Métodos Empregados na Automação Bioquímica

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métodos empregados na automação 
Vantagens dos métodos instrumentais 
automatizados 
 maior velocidade no processamento das análises 
 maior confiabilidade dos resultados 
 diminuição das contaminações (não destampa nenhum tubo) 
 diminuição na geração de resíduos (resíduo já fica em uma capa 
plástica) 
 menor consumo de amostras e reagentes 
 redução de custos 
Métodos instrumentais ópticos 
 dependem ou da medição da quantidade de energia radiante de um 
certo comprimento de onda que é absorvido pela amostra (métodos 
de absorção) 
 os principais métodos ópticos de absorção utilizados são: 
- espectrofotometria no visível (colorimetria) 
✓ relacionada com espectro de energia/luz que esta na faixa 
daquilo que consegue ver, 400 a 780nm (nanômetro) 
✓ colorimetria pois gera cor, e geração de cor é importante 
✓ a cor vai servir para inferir (concluir/deduzir) a 
concentração de um analito (que são marcadores biológicos 
que podem estar alterados em determinadas patológicas 
que são de interesse na pesquisa de bioquímica, ex: glicose, 
bilirrubina, TGP...) 
- espectrofotometria no ultravioleta 
- espectrofotometria no infravermelho 
- turbidimetria 
✓ determina a quantidade de luz absorvida por uma 
suspensão 
✓ partículas dispersas em meio líquido e avalia o quanto de luz 
absorve nessa suspensão 
✓ também infere o quanto tem de uma dada substância 
Métodos analíticos 
Espectrofotometria 
 método utilizado para medir o quanto uma substância química 
absorve a luz, medindo a intensidade quando um feixe de luz passa 
através da solução da amostra 
 o princípio básico é que cada composto absorve ou transmite luz 
em uma certa amplitude de comprimento de onda 
 a cor é indicada pelo nanômetro ou luz 
 
método de Lambert-Beer 
 quando uma radiação monocromática (luz; em um dado momento 
ela é de uma única cor, monocromática) passa através de uma 
solução, uma parte da energia é absorvida pelo meio, enquanto 
a parte restante é transmitida 
 transmitância- quantidade de energia radiante transmitida pela 
solução; é dada pela relação entre a intensidade da radiação 
transmitida (I) e a intensidade da radiação incidente (Io), ou seja, 
T=I/Io 
 absorbância- quantidade de energia radiante absorvida pela 
solução; a absorbância ou densidade óptica (DO) é diretamente 
proporcional à concentração da amostra 
- quando maior a concentração do analito na solução que está 
usando, maior será a absorção dessa luz 
- uma solução mais escura significa que absorveu mais 
energia/luz, então tem uma alta concentração de analito 
espectrofotômetro 
 medir a quantidade de luz que uma amostra absorve ou a 
quantidade de luz que é transmitida através da solução quando 
se incide luz sobre a mesma 
 luz monocromática (única cor) em comprimento de onda 
definido, permitindo leituras de absorbância mais exatas, do UV 
ao IV 
 utiliza prisma, grade de difração ou filtro de interferência 
principais componentes de um espectrofotômetro 
 lâmpadas- tungstênio (UV próximo ou visível), deutério (UV) e 
xenônio (IV) 
 a amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de quartzo 
quando a radiação for na região espectral do UV, quando for na 
luz visível usa-se os de vidro por ter uma melhor disersão 
 detector- os detectores devem ser altamente sensíveis 
- os dados obtidos pelo detector são enviados para um 
dispositivo de processamento de dados 
- a luz transmitida que vai ser avaliada pelo detector, os 
dados obtidos vão processar o valor que absorvido em 
relação com o valor da transmitância, para fazer o cálculo 
do analito 
 monocromador- fenda ajustável em relação a escolha do 
comprimento de onda e interesse 
- o comprimento de onde é indicado na bula 
 
não estão no espectro do 
visível e nem colorimetria 
 as radiações eletromagnéticas com comprimento de onda entre 
380 e 780nm são visíveis ao olho humano 
 abaixo de 380nm é denominada UV e acima de 780nm 
corresponde a zona IV 
 sempre que uma solução for colorida seu nm estará entre 400 e 
780nm 
 a seleção do filtro se baseia na cor complementar da espécie 
analisada (cor absorvida) (a cor complementar garante uma melhor 
leitura) 
Fotometria 
 técnica de analise quantitativa que envolve a medida de intensidade 
de absorção de luz monocromática de um composto químico em 
solução 
 a concentração das soluções é proporcional à quantidade de luz 
absorvida 
 fotocolorímetro ou espectrofotômetro 
 
fotocolorímetro 
 trabalha com luz monocromática em faixas de comprimento de 
onda de luz visível 
 utilizam como monocromadores os filtros 
 
Colorimetria 
 método de análise quantitativa que se baseia na comparação da cor 
produzida por uma reação química com uma cor padrão 
 de acordo com a intensidade da cor produzida, infere-se a 
concentração do determinado analito 
 o método mais seguro de se verificar a coloração de uma reação é 
através do uso do espectrofotômetro, que compara a intensidade 
de cor com uma cor estabelecida, chamada “branco” (solução em 
que o espectrofotômetro é zerado) 
 utiliza sempre um tubo branco, um padrão e o tubo com a solução 
com o analito 
 medido entre 400 a 680nm 
conceitos 
 padrão/calibrador- soluções cujas concentrações de analitos são 
exatamente conhecidas, destinando-se a atuar no ajuste 
(calibração) de um sistema analítico 
- sempre precisa utilizar, ele que vai ajudar a fazer o cálculo do 
fator, e se conseguir calcular o fator vai poder calcular a 
concentração das soluções que estão sendo dosadas, de todos 
os pacientes 
- está ligado com a exatidão 
 controles- soluções com valores de analitos exatamente 
conhecidos, utilizadas para verificação de exatidão e principalmente, 
precisão de uma metodologia analítica 
 
 
modo de leitura 
 monocromática- a absorbância utilizada para cálculo é o 
resultado da leitura em um único comprimento de onda 
 bicromática- analisa a absorbância da solução utilizando dois 
comprimentos de onda 
- comprimento de onda primário 
- comprimento de onda secundário 
- utilizada para tirar o ruído de amostras com interferentes 
(hemólise/lipemia) corrigindo a amostra 
- hemólise/lipemia modificam a condição primária do soro 
- também interfere o quanto tem de uma dada substância 
✓ em métodos manuais é um problema 
✓ em máquinas não importa, por conta do modo de 
leitura bicromática (pode utilizar soro sem jejum) 
 
Reação Colorimétrica 
 
 
 
Ponto final 
 a quantidade de produto formado reflete a reação de todo 
analito presente na amostra 
 T0-T1- tempo em que está ocorrendo a reação 
 T1-T2- tempo em que a reação se completou e está estável, 
neste intervalo será realizada a leitura da reação 
 T2-T3- perda da estabilidade 
 
 
 
 exemplo: dosagens de bilurribina direta, colesterol-HDL e 
colesterol 
Reações Cinéticas 
 geralmente utilizado em reações em que o analito é uma enzima 
 a atividade da enzima é analisada por meio da reação dela com 
um composto químico denominado substrato e essa reação 
gera um produto 
reação cinética de tempo fixo com leitura em ponto final 
 após completar o intervalo cinético estabelecido, a reação é 
interrompida e o produto formado é medido 
 T0-T1- intervalo de tempo onde ocorre a reação 
 T1- interrupção da reação enzimática 
 T1-T2- intervalo de estabilidade do produto da reação (período 
ideal para leitura) 
 T2-T3- perda da estabilidade do produto da reação (não pode fazer 
a leitura nesse período) 
 
 
 
 exemplo: dosagem de cálcio total 
 
reação cinética continua 
 esta reação pode ser crescente ou decrescente 
 é uma reação que após um período inicial de estabilização, adquire 
velocidade constante que se mantém enquanto existir quantidade 
suficiente de substrato 
 a leitura é feita várias vezes no espectrofotômetro em um 
período de tempo a reação, pois o produto vai ser formando 
conforme vão se passando o tempo de reação e incubação 
 as medições devem ser realizadasno intervalo onde a velocidade é 
constante 
 avalia o cálculo da diferença dessas absorbância 
 avalia gradativamente a reação 
 cada intervalo de tempo uma absorbância tem que ser lida 
 
 
 
 
 exemplo: dosagem de CK-MB 
 
reação cinética de 2 pontos 
 tem período certo, não tem vários períodos 
 faz em dois momentos: 
- 1° uma primeira medição 
✓ tempo por absorbância que acontece em um período curto 
depois que a reação estabilizou 
- 2° uma segunda medição 
✓ após um tempo de intervalo apropriado 
 a diferença de absorbância entre os dois intervalos, delta da 
reação, é utilizada para cálculo 
 em um tempo mais curto ele consegue garantir uma boa definição 
 
 
 
 
 exemplo: dosagem de creatinina 
 
Realização de espectrofotometria manual 
 para realizar qualquer análise colorimétrica manual, utiliza-se no 
mínimo, 3 tubos de ensaio 
 tubo branco- deverá conter apenas o reagente de uso 
(cromógeno ou reagentes de cor) utilizado para a reação; 
finalidade de “zerar” o aparelho, e deve ser o primeiro a 
passar pelo aparelho 
 tubo padrão- deverá conter o reagente de uso e padrão (do 
kit); a reação que ocorrerá entre esses dois reagentes deverá 
obter um resultado de absorbância e concentração conhecido; 
esse tubo serve para obter um fator calibrador 
 tubo teste- devera conter o reagente de uso e a amostra a 
ser analisada; a absorbância obtida através dessa análise 
devera ser multiplicada pelo fator obtido, a fim de se obter a 
concentração final da mesma 
Cálculo da concentração de analito 
 f=[padrão]/abs.padrão 
 uma vez conhecido o fator de proporcionalidade, basta realizar 
a seguinte equação: 
- [amostra]= abs.teste/abs. padrão x [padrão] 
✓ [padrão]= está na bula 
✓ abs.padrão= teste padrão 
✓ abs.amostra ou abs.teste= amostra do paciente 
 exemplo: determinação da [Hb] de uma amostra 
- [padrão]= 13,6g/dL 
- abs.padrão= 0,412 
- abs.amostra= 0,390 
- 
0,390
0,412
× 13,6 0,946 × 13,6 = 12,87𝑔/𝑑𝐿 
Linearidade 
 a linearidade de um método analítico é a capacidade de obter 
respostas analíticas diretamente proporcionais à concentração 
de um analito em uma amostra 
 valor limite que pode expressar a quantidade de analito 
 tem um intervalo ou dado valor que pode garantir que a 
concentração calculada é uma concentração real e segura 
 se a linearidade passar do limite da bula, não pode ser 
considerada, deverá ser feito uma diluição 1:10 
Nefelometria x Turbidimetria 
 método direto de medida de espalhamento, de uma luz 
incidente, por partículas em suspensão 
 esse espalhamento depende do tamanho e da forma das 
partículas, da concentração e do índice de refração do meio 
 o sistema consta de: 
- fonte de energia radiante (halogênio, tungstênio e laser) 
- condensador (flash de luz paralelo e não divergente) 
 
interrupção da reação 
reação para detecção 
de um substrato 
- seletor de comprimento de onda (filtro ou monocromadores) 
- cubeta 
- sistema de detecção (define a técnica empregada) 
- θ0°= turbidimetria 
✓ quando o sistema de detecção avalia diretamente 0°graus 
a saída de luz, tem uma turbidimetria 
- θ90°= nefelometria 
✓ a luz saiu, mas ela ricocheteou, tem nefelometria em 
90°graus 
 hemólise/lipemia interfere nesses dois métodos 
turbidimetria 
 é a medida da diminuição da intensidade da luz incidente quando 
passa através de uma suspensão de partículas 
 a diminuição da luz incidente esta ligada diretamente com a 
concentração dessas partículas em solução 
 
 
 
nefelometria 
 é a medida da luz dispersa em ângulos distintos aos da incidência 
(normalmente de 15 a 90°) 
 é a angulação das saídas de luz que define esses dois métodos