Isolamento e produção de Chlorella sp e Moina sp para utilização na larvicultura de Matrinxã

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UNIVERSIDADE NILTON LINS 
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO 
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA 
 
 
 
 
Isolamento e produção de Chlorella sp. 
(CHLOROPHYCEAE) e Moina sp.(CLADOCERA) para 
utilização na larvicultura de Matrinxã (Brycon amazonicus) 
 
 
 
 
JOANA PAULA DE SOUZA CORNÉLIO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manaus, Amazonas 
2012 
ii 
 
JOANA PAULA DE SOUZA CORNÉLIO 
 
 
 
 
 
Isolamento e produção de Chlorella sp. 
(CHLOROPHYCEAE) e Moina sp.(CLADOCERA) para 
utilização na larvicultura de Matrinxã (Brycon amazonicus) 
 
 
 
Orientadora: Drª Marle Angélica Villacorta Correa 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao 
Programa de Pós-graduação em 
Aquicultura da Universidade Nilton 
Lins como parte dos requisitos para 
obtenção de título de Mestre em 
Aquicultura 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manaus, Amazonas 
2012 
 
iii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
C834i Cornélio, Joana Paula de Souza. 
 Isolamento e produção de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEAE) e Moina 
sp.(CLADOCERA ) para utilização na larv icultura de Matrinxã (Brycon 
amazonicus)./Joana Paula de Souza Cornélio.- Manaus:UNL,2012. 
 79.; il.; 30 cm. 
 Dissertação (Mestrado em Aquicultura) – Universidade Nilton Lins, 
Manaus, 2012. 
 Orientador: Marle Angélica Villacorta-Correa 
Palavras-chave: Isolamento, produção, Chlorella, Cladocera. I.Título.II.Universidade 
Nilton Lins. 
CDU 639.3.043 
iv 
 
 
BANCA JULGADORA 
 
 
Membros titulares: 
 
_______________________________________ 
Dr. Alfredo Olivera Gálvez – UFRPE 
_______________________________________ 
Dr. Edinaldo Nelson Santos Silva – INPA 
 
_______________________________________ 
Dr. André Ricardo Ghidini- UNINORTE 
 
 
Membros suplentes: 
 
 
_______________________________________ 
Drª Maria Célia Portella – CAUNESP 
 
______________________________________ 
Drª Elizabeth Gusmão Affonso - INPA 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 
v 
 
Sinopse: 
Realizou-se o isolamento e a produção de organismos planctônicos 
(Chlorella sp. e Cladocera) para utilização na larvicultura de peixes 
amazônicos 
 
 
 
 
 
Palavras-chave: Isolamento, produção, Chlorella, Cladocera 
vi 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 DEDICATÓRIA 
 
 
 
 
 
À minha família, e em especial minha mãe Valdereis 
Maria Farias de Souza e irmã Keila Cristina de Souza 
Cornélio pelo amor a mim dado. Amo vocês! 
Dedico-lhes... 
 
vii 
 
AGRADECIMENTOS 
 
A Deus por sua presença constante em nossas vidas!! 
À minha orientadora, Profa. Dra Marle Angélica Villacorta-Correa pela dedicação, 
apoio, confiança e pela aprendizagem não só acadêmica, mas de vida!Obrigada!! 
Aos amigos José Augusto Bida Neto, Rosilane Oliveira, Aureliano (Saterê) e Jadilson 
(Piauí) pelo apoio, companhia e amizade que tiveram por mim durante o período do 
trabalho!Vocês são especiais! 
Ao Projeto DARPA em nome do Sr. Geraldo Bernardino pelo apoio dado a pesquisa 
realizada! 
À Universidade Nilton Lins e Instituto de Pesquisas da Amazônia por proporcionar a 
oportunidade de cursar o Mestrado em Aquicultura! 
Aos colegas e amigos do curso de aquicultura, em especial Eduardo Ribeiro, Aline 
Alcântara e Alyson Ribeiro que direta ou indiretamente contribuíram para a realização 
deste trabalho! 
Às amigas Antônia Hippy, Raquel Aguiar e Sandra Portela pelas palavras de 
incentivo e pela amizade!Obrigada meninas! 
À FAPEAM pela concessão da bolsa durante o período de estudo. 
 
 
viii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ó Senhor Deus, tu me proteges e me dás força! 
(Jeremias 17:19) 
 
ix 
 
 
 
RESUMO GERAL 
A larvicultura de peixes amazônicos especialmente daqueles com larvas de hábitos 
alimentares carnívoros e comportamento canibal se constitui hoje em um dos principais 
desafios que dificulta o desenvolvimento da piscicultura na região. Para a criação de 
larvas de peixes, a utilização de alimento natural como os organismos planctônicos 
constitui uma questão relevante. Estes organismos podem ser produzidos em instalações 
especiais e se constituem alimentos de alto valor nutricional nas primeiras fases do 
desenvolvimento dos peixes. O objetivo deste trabalho foi realizar adaptações 
metodológicas para a produção de Moina sp.(CLADOCERA) para servir como alimento 
de larvas de peixes amazônicos. O estudo foi realizado nas instalações da Estação de 
Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas – UFAM 
de junho de 2011 a fevereiro 2012. O trabalho está apresentado em forma de capítulos: 
1) Isolamento de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) para sua produção em laboratório; 
2) Produção de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de organismos 
zooplanctônicos e 3) Produção de Moina sp. (CLADOCERA: MOINIDAE) para sua 
utilização na larvicultura de matrinxã (Brycon amazonicus). Nestes capítulos são 
detalhados os procedimentos metodológicos para a produção de Chlorella sp. a partir de 
cepas monoespecíficas que foram produzidas em laboratório e zooplâncton 
(CLADOCERA) produzido em sistema aberto. As técnicas para a produção tanto de 
fitoplâncton como de zooplâncton foram simplificadas utilizando farinha de peixe e o 
NPK como fonte de nutrientes. Os resultados obtidos neste trabalho poderão em 
primeira mão servir para produção de zooplâncton que atenda as experiências de manejo 
alimentar durante a larvicultura do matrinxã (Brycon amazonicus) no âmbito do projeto 
“Desenvolvimento da Aquicultura e dos Recursos Pesqueiros na Amazônia” e 
posteriormente, repassadas para o setor produtivo. 
Palavras-Chave : cultivo de alga, Chlorella, produção de zooplâncton, CLADOCERA, 
farinha de peixe, NPK. 
 
 
 
 
 
 
x 
 
 
ABSTRACT 
 The hatchery fish Amazonian especially those with larvae eating habits are carnivorous 
and cannibalistic behavior constitutes today one of the major challenges impeding the 
development of fish farming in the region. For the fish larvae creation, the use of natural 
food such as plankton is a relevant question.These organisms can be produced in special 
plants and foods are of high nutritional value in the early stages of fish development. 
The aim of this study was methodological adaptations for producing Moina sp. 
(Cladocera) to serve as food for fish larvae Amazon. The study was The study was 
undertaken at the premises of the station Aquaculture Experimental Farm of the Federal 
University of Amazonas - UFAM June 2011 to February 2012. The work is presented in 
the form of chapters: 1) Isolation of Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) for production 
in laboratory; 2) Production of Chlorella sp. laboratory for feeding zooplankton and 3) 
Production of Moina sp. (Cladocera: MOINIDAE) for use in larviculture matrinxã 
(Brycon amazonicus). In these chapters are detailed methodological procedures for 
producing Chlorella sp. from monospecific strains that were produced in the laboratory 
and zooplankton (Cladocera) produced in an open system. Techniques for the 
production of both phytoplankton and zooplankton were simplified using fish meal and 
the like NPK nutrient source. The results obtained in this study may serve to firsthand 
zooplankton production that meets the experiences of feeding management during the 
larviculture matrinxã (Brycon amazonicus) under the project "Development of 
Aquaculture and Fisheries Resources in the Amazon" and subsequent ly transferred to 
the productive sector. 
Keywords: cultivation of algae, Chlorella, production of zooplankton, Cladocera, fish 
meal, NPK. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xi 
 
 
SUMÁRIO 
 PÁGINA 
Introdução geral................................................................................................15 
Objetivos.......................................................................................................... 21 
Capítulo 01 
Isolamento de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) para produção em 
laboratório 
 
Resumo............................................................................................................. 22 
Abstract............................................................................................................ 23 
Introdução......................................................................................................... 24 
Material e métodos........................................................................................... 26 
Resultados........................................................................................................ 29 
Discussão.......................................................................................................... 34 
Conclusão......................................................................................................... 37 
Referências bibliográficas................................................................................ 38 
Capítulo 02 
Produção de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de 
organismos zooplanctônicos 
 
Resumo............................................................................................................. 41 
Abstract............................................................................................................ 42 
Introdução......................................................................................................... 43 
Material e métodos........................................................................................... 46 
Resultados........................................................................................................ 49 
Discussão.......................................................................................................... 54 
Conclusão......................................................................................................... 57 
Referências bibliográficas................................................................................ 58 
Capítulo 03 
Produção de Moina sp.(Cladocera:Moinidae) para sua utilização na 
larvicultura de peixes amazônicos 
 
Resumo............................................................................................................. 61 
Abstract............................................................................................................ 62 
Introdução......................................................................................................... 63 
Material e métodos........................................................................................... 66 
Resultados........................................................................................................ 68 
Discussão.......................................................................................................... 71 
Conclusão......................................................................................................... 75 
Referências bibliográficas................................................................................ 76 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xii 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
CAPÍTULO I 
 Página 
Figura 1. Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da UFAM: a) Localização, 
b) Instalações.............................................................................................. 
 
26 
 
Figura 2. Viveiros onde foram coletadas as amostras de fitoplâncton: a) CPAq/INPA 
,b) Estação de Aquicultura da UFAM............................................................................. 
 
26 
 
Figura 3. Coleta da amostra com rede de fitoplâncton de 30 μ ...................................... 30 
 
Figura 4. Filtragem da amostra para eliminar a matéria 
orgânica.............................................................................................................................. 
 
30 
 
Figura 5- Amostra concentrada de Chlorella sp............................................................... 30 
 
Figura 6. Incubação das amostras sob condições controladas........................................... 30 
Figura 7. Cultura em meio sólido: a- Estriamento; b- Diferenciação das colônias 
iniciais de Chlorella sp...................................................................................................... 
 
 
31 
 
Figura 8. Crescimento das colônias de Chlorella sp.: a-colônias em meio agar com 3 
dias de incubação;b- Amostra concentrada de Chlorella sp.............................................. 
 
31 
 
Figura 9. Retirada das colônias de Chlorella sp................................................................ 31 
 
Figura 10. Transferência das cepas isoladas para tubos de 
ensaio............................................................................................................................... 
 
32 
 
Figura 11 . Incubação das cepas de Chlorella sp. isolada no laboratório de fitoplâncton 
da Fazenda Experimental da UFAM................................................................................. 
 
32 
 
Figura 12. Processo de isolamento de cepas de Chlorella sp............................................ 32 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xiii 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
CAPÍTULO II 
 Página 
 
Figura 1. Delineamento experimental inteiramente casualizado......................... 
 
47 
 
 
Figura 2. Unidades experimentais utilizadas para o cultivo: a- 250 ml; b-1000 
ml; c- 5 litros; d- 20 litros; e- 35 litros. ............................................................... 
 
48 
 
 
Figura 3. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de 
peixe e NPK em volume de 200 ml...................................................................... 
 
49 
 
 
Figura 4. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de 
peixe e NPK volume de 900 ml........................................................................... 
 
50 
 
 
Figura 5. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de 
peixe e NPK em volume de 4 L......................................................................... 
 
50 
 
 
Figura 6. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de 
peixe em volume de 18 L................................................................................. 
 
51 
 
 
Figura 7. Curvas de crescimento de Chlorella sp.enriquecido com farinha de 
peixe em volume de 30L...................................................................................... 
 
52 
 
Figura 8. Padrão de coloração das culturas a) fase de indução b) fase de crescimento 
exponencial....................................................................................... 53 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xiv 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
CAPÍTULO III 
 Página 
Figura 1. Desenho experimental utilizado na pesquisa........................................ 
 
67 
Figura 2. Locais de coleta das amostras nas unidades experimentais.................. 
 
67 
Figura 3. Espécie utilizada para a produção: a- Moina sp.; b-Estruturas 
taxonômicas para identificação:a) segunda antena; b) ocelos; c) rostro; d) 
posabdômen; e) ramos do posabdômen.............................................................. 
 
 
 
68 
Figura 4. Curva de crescimento da Moina sp. : a-Meio de cultura farinha de 
peixe; b-Meio de cultura NPK............................................................................. 
 
 
69 
Figura 5.Densidade média de Moina sp. por estágio de desenvolvimento na 
produção com o meio de cultura farinha de peixe............................................... 
 
 
69 
Figura 6. Densidade média de Moina sp. por estágiode desenvolvimento na 
produção com o meio de cultura NPK................................................................. 
 
 
70 
 
 
 
 
 
15 
 
 
INTRODUÇÃO GERAL 
O pescado produzido no Brasil no ano de 2010 foi de 1.264.765 t, com um 
incremento de 2 % em relação a 2009, quando foram produzidas 1.240.813 t. Em 2010 
houve uma redução de 8,4% na produção oriunda da pesca extrativa marinha em relação 
a 2009, resultada de um decréscimo de 49.217 t. Em contra partida, a produção da pesca 
extrativa continental e a aquicultura continental fecharam em alta em relação a 2009, 
com um acréscimo de 3,9% e 16,9% respectivamente (MPA, 2010). 
A ampliação de políticas públicas facilitando o acesso aos programas 
governamentais existentes tais como o Plano Mais Pesca e Aquicultura desenvolvida 
pelo MPA, possibilitou o desenvolvimento da aquicultura nacional. Isto pode ser 
constatado com o crescimento da produção entre 2008 e 2009 que mesmo sendo menos 
acentuada que a do triênio 2008-2010 (40%), teve um incremento de 16,9 % (MPA, 
2012). 
Gandra (2010) refere que na região amazônica o peixe representa a principal fonte 
de proteína para consumo humano, particularmente das populações ribeirinhas que 
apresentam um consumo per capita de pescado estimado entre 500 e 600 g/dia. Em 
Manaus o consumo é de 93,61 g/pessoa/dia e parte desta demanda é suprida pelo 
pescado oriundo da piscicultura. Contudo, a produção da piscicultura local (12.000 t de 
tambaqui em 2009) não atendeu as necessidades do mercado consumidor já que desse 
valor, 6.000 toneladas são oriundos da piscicultura de outros estados como Rondônia, 
Roraima e Acre (Gandra, 2010). 
Segundo dados do IBAMA (2007), os peixes mais cultivados e mais estudados até 
o momento na região amazônica são o tambaqui (Colossoma macropomum), o matrinxã 
(Brycon amazonicus) e o pirarucu (Arapaima gigas). O tambaqui é a espécie mais 
cultivada e com maior produtividade na região Norte (Ostrensky et al., 2000) contando 
com maiores informações técnicas que faz com que cadeia produtiva esteja mais 
estruturada e em vias de consolidação. 
A necessidade de otimizar a utilização de recursos e investimento em pesquisas 
conduziu a uma estratégia adotada pelo MPA para seleção de espécies amazônicas sobre 
as quais serão realizados investimentos utilizando o método de escores. Este método se 
16 
 
fundamenta em critérios que consideram a importância econômica, estratégica, social, 
probabilidade de êxito na pesquisa e adoção de tecnologia. 
De acordo com o método do escore, a matrinxã, após o tambaqui é a segunda 
espécie cujas pesquisas devem ser priorizadas na região amazônica e que foi 
considerada na proposta do “Projeto Desenvolvimento da Aquicultura e dos Recursos 
Pesqueiros na Amazônia”. 
Diversos trabalhos destacam o bom desempenho zootécnico do matrinxã (Val e 
Honczarick, 1995; Brandão et al., 2004; Fim, 2004; Izel et al., 2004). Entretanto, 
Sampaio (2010) afirmou que a oferta de pós- larvas e juvenis nas estações de produção 
não está suprindo a demanda dos produtores regionais. Uma das causas da baixa 
produção é o canibalismo que ocorre nas primeiras fases de desenvolvimento da espécie 
(Bernardino et al., 1993; Ceccarelli, 1997). 
Várias estratégias foram utilizadas com a finalidade de minimizar o canibalismo 
nas primeiras fases do desenvolvimento do matrinxã como: redução das densidades de 
estocagem das larvas (Campagnolo e Nuñer, 2006); formato dos tanques utilizados na 
larvicultura (Pedreira, 2006); utilização de substratos artificiais, escurecimento das 
incubadoras (Lopes et al., 1995); uso de hormônios tireoideos (Vasques, 2003; 
Leonardo, 2005) e enriquecimento da ração com triptofano (Hoshiba, 2007). 
Dentre as estratégias alimentares, vem sendo realizadas pesquisas sobre a oferta de 
organismos planctônicos para diminuir o canibalismo da matrinxã na fase larval. A 
produção e utilização de alimento natural vivo são fundamentais para os peixes nos 
primeiros estágios de desenvolvimento por apresentarem altos níveis de proteína de 
excelente qualidade, vitaminas, minerais, ácidos graxos essenciais e possuírem enzimas 
necessárias para ajudar no crescimento e sobrevivências das larvas (Coutteau e 
Sorgeloos, 1997; Kubitza, 1998; Kolkovski, 2001; Portella et al., 2002; Carvalho et al., 
2003; Sipaúba-Tavares, 2003; McKinnon et al., 2003). 
Os organismos planctônicos também são importantes para o crescimento das pós-
larvas porque a maioria dos peixes nesta fase, não possuem sistema enzimático e 
digestório completamente desenvolvidos (Furuya et al., 2001). 
A utilização de microalgas como fonte de alimento na aquicultura vem se 
destacando por apresentar fonte de proteínas, ácidos graxos insaturados, vitaminas, sais 
17 
 
minerais, pigmentos, enzimas, antibióticos e outros metabólitos biologicamente ativos 
(Pereira, 2001). 
Lourenço (2006), afirma que o cultivo de microalgas em laboratório é uma 
ferramenta essencial para a produção de biomassa algal que pode ser utilizada para a 
alimentação de Zooplâncton que por sua vez servirão de alimento para peixes na fase 
larval. 
Segundo Cecarelli e Senhorini (1996), a matrinxã tem preferência alimentar por 
crustáceos planctônicos, principalmente da classe Cladocera. Sampaio (2010), 
trabalhando com conteúdo estomacal de larvas de matrinxã encontrou que até 11 dias 
após a eclosão as larvas de matrinxã tem preferência alimentar por cladóceros e 
posteriormente ocorre o consumo de alimento inerte. 
Portanto, este item alimentar poderia ser utilizado durante a larvicultura até que as 
larvas sejam capazes de aceitar a ração. Assim, se torna necessário o investimento em 
pesquisas para a produção em massa de Cladocera utilizando uma metodologia simples 
e adaptada às condições locais que suporte a alimentação de larvas de matrinxã. 
Neste contexto, no presente trabalho apresentamos em forma de capítulos as 
diferentes técnicas utilizadas na produção de organismos planctônicos (fitoplâncton e 
zooplâncton) visando à produção em massa de Cladocera. Estes organismos poderão ser 
utilizados na larvicultura da matrinxã para diminuir o canibalismo desta espécie nas 
primeiras fases de seu desenvolvimento, que atualmente se constitui no maior entrave 
tecnológico para aumentar a produção de alevinos e abastecer a crescente demanda dos 
produtores da região. 
 
 
 
 
 
18 
 
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21 
 
 
OBJETIVOS 
 
GERAL 
Isolar e produzir organismos planctônicos, fitoplâncton Chlorella sp. e zooplâncton 
Moina sp. , para utilização na larvicultura da Matrinxã (Brycon amazonicus). 
 
ESPECÍFICOS 
1. Isolar Chlorella sp. para produção em laboratório; 
2. Produzir de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de organismos 
zooplanctônicos ; 
3. Produzir Moina sp. para utilização na larvicultura da matrinxã (Brycon 
amazonicus). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
Isolamento de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) para produção em laboratório 
 
RESUMO 
 
O isolamento e o cultivo de microalgas em laboratório têm recebido um grande impulso 
nos últimos anos, embora exista a necessidade de aprimoramento dos métodos e 
tecnologias empregadas, principalmente para as espécies de água doce. O objetivo deste 
trabalho foi o isolamento da microalga Chlorella sp. visando à formação de um banco 
de cepas monoalgais para posterior cultivo em laboratório e em larga escala. O 
experimento foi realizado no laboratório de fitoplâncton na Estação de Aquicultura da 
Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas-UFAM. As coletas foram 
realizadas nos viveiros da Coordenação de Pesquisas em Aquicultura do Instituto 
Nacional de Pesquisas da Amazônia - Cpaq / INPA e na Estação de Aquicultura da 
Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas – UFAM. Foram 
utilizadas duas metodologias de isolamento de microalgas utilizando meio de cultura 
NPK: 1) Subculturas repetidas e 2) Meio NPK sólido com Agar. Para o método 2,a 
incubação foi realizada em temperatura entre 25 e 27º C (ambiente) e intensidade 
luminosa de aproximadamente 5.000 lux. As colônias monoespecíficas foram 
transferidas para frascos erlenmeyer contendo inicialmente 30 ml de meio de cultura 
liquido para iniciar uma subcultura e posteriormente foi diluído para 200 ml 
constituindo as cepas isoladas. O material foi distribuído em tubos de ensaio com tampa 
de rosca e mantidos em câmara de incubação a temperaturas entre 20 e 27º C, sob 
iluminação continua. 
 
Palavras-Chave : isolamento de microalgas, cepas de microalgas, Chlorella, incubação, 
NPK. 
23 
 
 
 
Isolation of Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) for producing in laboratory 
 
ABSTRACT 
 
 
 The Insulation and cultivation of micro-algae laboratory have received a big 
boost in recent years, although there is a need for improved methods and technologies 
employed, particularly for freshwater species. The objective of this work was the 
insulation of microalgae Chlorella sp. for the training of a bank of monoalgaes strains 
for further cultivation in the laboratory and on a large scale. The experiment was 
conducted in the laboratory of phytoplankton at Station Aquaculture Experimental Farm 
of the Federal University of Amazonas-UFAM. Samples were collected in ponds at the 
Aquaculture Research Coordination National Institute of Amazonian Research - CPAQ 
/ INPA and Aquaculture Station of the Experimental Farm of the Federal University of 
Amazonas - UFAM. Two methodologies insulation using microalgae culture medium 
NPK: 1) Repeated Subcultures and 2) Half NPK solid Agar. For the second method, the 
incubation was carried out at a temperature between 25 and 27 ° C (ambient) and 
luminous intensity of about 5,000 lux. The monospecific colonies were transferred to 
Erlenmeyer flasks containing initially 30 ml of liquid culture medium to initiate a 
subculture and were subsequently diluted to 200 ml constituting the isolates. The 
material was distributed in test tubes with screw cap and kept in an incubation chamber 
at temperatures between 20 and 27 ° C under continuous illumination. 
 
 
Keywords : insulation of microalgae strains of microalgae, Chlorella, incubation, NPK. 
 
 
24 
 
 
 
 
Capítulo 01: Isolamento de Chlorella sp. (CHLOROPHYCEA) para produção em 
laboratório 
 
INTRODUÇÃO 
 
As algas são organismos unicelulares que habitam ambientes marinhos e 
continentais, são capazes de realizar fotossíntese (Calijuri, 2006) e servir de alimento e 
abrigo para muitas espécies de organismos aquáticos. As algas constituem o primeiro 
elo da cadeia alimentar e são de fundamental importância na manutenção da vida nos 
ecossistemas aquáticos, além disso, são responsáveis por 98 % do oxigênio da terra 
(Bicudo 2004). Estes organismos possuem importância tanto ambiental, pois podem 
realizar o equilíbrio nos ambientes aquáticos quanto social e econômico, servindo como 
fonte de alimento e matéria prima (Barros, 2010). 
O fitoplâncton desempenha função importantena aquicultura, pois é fonte de 
aminoácidos essenciais e servem como alimento vivo para os estágios iniciais de 
organismos aquáticos (Portella et al. 1997). 
 Rotíferos e Cladocera são itens alimentares preferidos por larvas de tambaqui 
Colossoma macropomum (Sipauba Tavares, 1993; Carvalho & Goulding, 1982), já as 
larvas de matrinxã Brycon amazonicus tem preferência por cladocera (Senhorini, 2002; 
Sampaio, 2010). Day (1958) afirma que cladoceros podem servir como alimento para 
diversos peixes de água doce na Índia (Cyprinidae e Siluridae). Moina sp. tem sido 
extensivamente utilizado como alimento vivo durante a larvicultura, manutenção e 
cultura de peixes de aquário de importância comercial (Bellosillo, 1937; Alikunhi, 
1952; Alikunhi et al, 1955; Cooper e Grasslight, 1963). 
 Varias espécies de algas são utilizadas para a produção de organismos 
zooplanctonicos. Espécies do gênero Chlorella foram utilizadas com sucesso na 
produção de Moina sp. (Montealegre 1996; Prieto, 2006). 
Para iniciar o processo de cultivo de microalgas em laboratório é necessário o 
desenvolvimento de métodos e técnicas adequadas que permitam a produção com 
sucesso de culturas monoalgais. Segundo Bicudo (1970), existe uma predominância 
sequencial das espécies existentes, aquelas que predominam inicialmente tendem a 
desaparecer, sendo substituídas por outras mais comuns e mais resistentes. A 
25 
 
competição entre espécies é uma das principais dificuldades na preservação de uma 
população. Assim, o isolamento de microalgas em um meio adequado para o 
crescimento é necessário para estabelecer uma cultura monoalgal. 
Entre as algas de água doce mais cultivadas estão as Chlorophyceae, ressaltando o 
potencial da Chlorella sp.,Scenedesmus quadricauda, Ankistrodesmus gracilis, que têm 
mostrado excelente resultado em cultivos realizados em laboratório e quando utilizada 
indiretamente como alimento de larvas de peixes via zooplâncton (Sipaúba-Tavares e 
Braga,1999; Sipaúba-Tavares et al.,1999). 
Conforme Vendrúscolo (2009), o cultivo de microalgas dos gêneros Chlorella e 
Scenedesmus sp. para alimentação de espécies de microcrustáceos tem se destacado pela 
facilidade de manejo destas espécies, e de suas características de alimentação, 
reprodução e facilidade de cultivo. 
Portella (1995) afirma que a cultura monoespecífica a partir de cepas purificadas 
de microrganismos vegetais e animais em larga escala abriu novas e amplas 
perspectivas para a alimentação de larvas de espécies marinhas e de água doce. 
O aprimoramento das técnicas para o cultivo em massa de algas é de grande 
importância, pois possibilita a transferência dos seus nutrientes (vitaminas e ácidos 
graxos) para um nível trófico superior (Sipaúba-tavares & Rocha, 1993; Brown et al. 
1997). Pouco tem sido feito na região amazônica para produzir algas tanto em 
laboratório quanto em larga escala a partir de cepas purificadas de espécies nativas 
visando sua aplicação na larvicultura. 
Diversos métodos foram desenvolvidos para o isolamento de microalgas visando à 
produção de culturas monoalgais (Sipauba-Tavares e Rocha, 2001; Guerreiro & 
Villegas, 1982; Hardy e Diaz-Castro, 2000). 
Neste trabalho foram testados diferentes métodos para o isolamento de Chlorella 
sp. visando a formação de um banco de cepas monoalgais. 
26 
 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
 
O experimento foi realizado no laboratório de Fitoplâncton da Estação de 
Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas - UFAM 
localizada no Km 38 da BR 174 (Manaus – Presidente Figueiredo) (Figura 1 A e B). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
As amostras de fitoplâncton foram coletadas nos viveiros da Coordenação de 
Pesquisas em Aquicultura do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - CPAq / 
INPA e da Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal 
do Amazonas - UFAM. (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da UFAM: a- Localização; b- Instalações. 
 
 
 a 
 
a 
B 
Figura 2. Viveiros onde foram co letadas as amostras de fitoplâncton. CPAq/INPA (A), Estação de 
Aquicultura da UFAM (B) 
Fonte: Ribeiro, 2011; Arquivo pessoal. 
 
b 
27 
 
 
As amostras foram coletadas utilizando uma rede de fitoplâncton com abertura de 
30µ. A água foi filtrada com peneiras de 1 mm, 170µ, 60µ e 40µ para eliminar o 
material orgânico, insetos e zooplâncton e concentrar a amostra de fitoplâncton. Sob um 
microscópio óptico com aumento de 10X verificou-se a ocorrência da espécie desejada 
Chlorella sp. 
Como existiam na amostra outras espécies de fitoplâncton não desejadas, o 
material coletado foi diluído em três erlenmeyers de 25 ml contendo um meio 
enriquecido com 2 ml de solução padrão de NPK (20:5: 20 g/l) em um litro de água 
destilada autoclavada e mantidos no laboratório sob iluminação contínua. 
Durante o período de incubação foi acompanhado diariamente o crescimento da 
espécie desejada e quando verificada sua predominância foi realizada a seleção das 
células de Chlorella sp. e transferidos para outros erlenmeyers sob as mesmas condições 
de cultivo até que quase 100% da amostra fosse composta pela espécie desejada, 
estando em condições de ser transferida para o meio sólido. 
O meio sólido foi preparado conforme a metodologia descrita por Guerrero e 
Villegas (1982) que consiste na utilização de Agar na concentração de 1,5 % que 
equivale a 1,5 g por 100 ml de meio de cultura enriquecido com 2 ml de solução padrão 
de NPK/ litro de água destilada. Este meio de cultura foi esterilizado em autoclave a 
120º C durante 20 minutos. Retirado da autoclave o meio foi mantido a temperatura 
ambiente durante aproximadamente cinco minutos e ainda em estado liquido transferido 
para placas Petri por aproximadamente 10 minutos até a solidificação após o 
esfriamento. 
Uma gota de água contendo o fitoplâncton desejado (Chlorella sp.) foi colocado 
no meio sólido e realizado o estriamento sobre a superfície com uma alça de vidro. Este 
material foi incubado sob condições favoráveis de cultivo (entre 25 e 27º C e 
aproximadamente 5.000 lux) e acompanhado o crescimento até o aparecimento de 
colônias algais, e quando estas eram bem diferenciadas e espalhadas em mais de 50% da 
placa foram retiradas com uma alça bacteriológica, colocadas em uma pequena 
quantidade do meio liquido e verificado sob microscópio se estas colônias continham 
uma única espécie de alga. 
As colônias monoespecíficas foram transferidas para frascos erlenmeyer contendo 
inicialmente 30 ml de meio de cultura liquido para iniciar uma subcultura que 
posteriormente foi diluída para 200 ml. Este material foi distribuído em tubos de ensaio 
28 
 
com tampa de rosca e mantidos em câmara de incubação a temperaturas entre 24º e 27º 
C, sob iluminação continua. 
29 
 
 
RESULTADOS 
 
A coleta de microalgas foi realizada com o objetivo de obter uma cultura unialgal. 
A rede de plâncton com abertura de malha de 30 µ foi eficiente pra reter o fitoplâncton 
(Figura 3). A amostra original concentrada (Figura 4) foi observada sob microscópio 
óptico. Verificada a presença da espécie desejada (Chlorella sp.) (Figura. 5) foi 
acrescentada a amostra um meio de cultura enriquecido com NPK em quantidade 
equivalente a 50% do volume da amostra. Deste concentrado foram retiradas sub 
amostras de 30 ml e diluídas para volumes de 200 ml. Este material foi mantido sob 
iluminação constante de aproximadamente 5.000 lux e temperatura entre 25 e 27ºC 
(Figura 6). Diariamente se realizaram observações visuais para verificar o crescimento 
das espécies desejadas. 
Com 4 dias de cultivo, constatada a abundancia da espécie desejada (Chlorella 
sp.) foi realizada uma seleção preliminar e posteriormente transferido para três 
erlenmeyers contendo 100 ml do meio de cultura.Após cinco dias de incubação, 
verificada a predominânciadas células desejadas, uma gota da cultura foi estriada em 
seis placas com o meio de cultura sólido, composto por Agar enriquecido com NPK 
(Figura 7). Após 3 dias de incubação, foi observada a presença de colônias 
diferenciadas cobrindo mais de 50 % da placa (Figura 8). Utilizando uma alça 
bacteriológica foram retiradas as colônias individualizadas e transferidas para um vidro 
de relógio contendo algumas gotas do meio de cultura (Figura 9). 
Confirmada a presença de uma única espécie o concentrado unialgal foi 
transferido para três erlenmeyers contendo 30 ml de meio de cultura. Este material foi 
incubado por 2 dias e repicada para 3 volumes de 200 ml. Transcorrido cinco dias, na 
fase de crescimento exponencial, 20 ml da cultura unialgal foram transferidos para 
tubos de ensaio com capacidade de 30 ml. Com este material foi implementado um 
banco de cepas de Chlorella sp. (Figura 10). As cepas foram mantidas em câmara de 
incubação com fotoperíodo de 12 horas no claro e 12 horas no escuro e temperatura 
entre 24 e 27º C (Figura 11). 
 
 
 
 
30 
 
 
Na Figura 13 pode ser observado o processo de isolamento desde a coleta até a 
estocagem das cepas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Filtragem da amostra para eliminar para 
eliminar a matéria orgânica 
Fonte: Arquivo pessoal 
 
Figura 6. Incubação das amostras sob condições controladas 
Fonte: Arquivo pessoal 
 
Figura 3. Coleta da amostra com rede de 
fitoplâncton de 30 μ 
Fonte: Arquivo pessoal 
Figura 5- Amostra concentrada de Chlorella sp. 
Fonte: Arquivo pessoal 
 
31 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
a b 
Figura 8.Crescimento das colônias de Chlorella sp.: a-colônias em meio agar com 3 dias de 
incubação;b- Amostra concentrada de Chlorella sp. 
Fonte: Arquivo pessoal 
 
 
b a 
Figura 7. Cultura em meio sólido: a - Estriamento; b- Diferenciação das colônias iniciais de Chlorella sp. 
Fonte: Arquivo pessoal 
Chlorella sp. 
Figura 9. Ret irada das colônias de Chlorella sp 
Fonte: Arquivo pessoal 
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Figura 11. Incubação das cepas de Chlorella sp. 
isolada no laboratório de fitoplâncton da Fazenda 
Experimental da UFAM 
Fonte: Arquivo pessoal 
Figura 10 . Transferência das cepas isoladas para tubos de ensaio 
Fonte:Arquivo pessoal 
 
 
33 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Processo de isolamento de cepas de Chlorella sp. 
 
34 
 
 
DISCUSSÃO 
 
O crescente interesse no estudo de microalgas se deve à sua importância nas 
diversas cadeias tróficas e na possibilidade de aplicação em distintas áreas como 
nutrição, saúde humana e animal, tratamento de águas residuais, produção de 
biocombustível e fertilizantes (Anupama e Ravindra, 2000; Becker, 2004; Pulz,2004; 
Lourenço,2006; Peres,2007; Patil,2011; Karnataka,2011).A aplicação mais comum tem 
sido na aquicultura para alimentação direta ou indireta de algumas espécies de peixes, 
moluscos, crustáceos e diversos organismos forrageiros de interesse econômico (Derner 
et al.,2006). 
A produção de microalgas no Brasil é realizada principalmente por empresas 
localizadas no litoral de Santa Catarina e região nordeste que produzem biomassa e a 
utilizam principalmente na alimentação de organismos como camarões e moluscos 
marinhos (Derner et al, 2006). Apesar de ser uma atividade consolidada em outros 
países, não encontramos disponível na literatura, trabalhos sobre isolamento de algas 
nativas da região amazônica visando sua utilização na larvicultura de peixes. Entre as 
principais microalgas cultivadas na aquicultura destacam-se as espécies dos gêneros 
Chlorella e Scenedesmus (Sipaúba-Tavares e Rocha, 1993; Portella et al.,1997; Hardy e 
Diaz-Castro, 2000; Macedo e Pinto-Coelho, 2000; Becker, 2004; Ohse et al., 2008; 
Vendrúscolo, 2009). Estes gêneros são utilizados como alimento na produção de 
Rotíferos e Cladocera (Hardy e Diaz-Castro, 2000; Sebastien e Granja, 2005, Portella, 
1997; Macedo e Pinto Coelho, 2000) que constituem alimento de larvas de peixes como 
Colossoma macropomum e Brycon amazonicus (Goulding e Carvalho, 1982; Sipaúba-
Tavares, 1993; Senhorine, 2002; Sampaio, 2010). 
O isolamento de microalgas é o primeiro passo para o cultivo tanto em laboratório 
como em larga escala. Existem vários métodos para o isolamento, entre eles o método 
das culturas repetidas (Guerrero e Villegas, 1982), que se mostrou eficiente neste 
trabalho, para a eliminação do fitoplâncton acompanhante e consequente predominância 
de Chlorella sp. Guerrero e Villegas (1982) sugerem que os volumes para as diluições, 
estejam entre 50 e 100 ml, entretanto, os volumes de 30 e 200 ml utilizados neste 
trabalho foram também eficientes. 
35 
 
 
A intensidade de luz e a duração da iluminação influenciam diretamente no 
crescimento das microalgas, pois a luz atua como principal fonte de energia no processo 
de produção de biomassa (Sipaúba-Tavares e Rocha, 2001). 
Neste trabalho, a iluminação constante de aproximadamente 5.000 lux foi eficiente 
no crescimento de Chlorella sp., entretanto Portella et al. (1997), obteve bons resultados 
para o cultivo de Chlorella homosphaera com intensidade entre 3.200 a 4.000 lux. 
Sipaúba-Tavares e Rocha (1993) obtiveram bons resultados utilizando intensidade de 
luz de 5200 lux no cultivo de Scenedesmus bijugus semelhante ao utilizado neste 
experimento. Já Hardy e Diaz-Castro (2000) utilizaram lâmpadas fluorescentes de 2500 
lux, abaixo do utilizado neste experimento e também tiveram bons resultados. De 
acordo com os resultados acima referidos podemos observar que a intensidade de luz 
para o crescimento de ambas as espécies pode variar entre 2500 e 5200 lux. 
Portella et al. (1997) e Pequeno et al. (2012), encontraram que fotoperíodo de 12 
horas claro/escuro foram eficientes no aumento da densidade algal, que difere dos 
resultados encontrados neste trabalho onde a iluminação foi constante obtendo-se 
também resultados satisfatórios. 
Neste trabalho a multiplicação das células de Chlorella sp.ocorreu em 
temperaturas entre 25 e 27º C semelhantes àquelas utilizadas por Ohse et al (2008) e 
Pequeno et al.(2012) para o cultivo de Chlorella sp. (25±2º C e 28 ± 3°C 
respectivamente). Vendrúscolo (2009) utilizou a temperatura de 24º C para 
S.quadricauda. Já no estudo sobre qualidade nutricional de S. quadricauda 
desenvolvido por Macedo (1999) a temperatura foi de 20º C. Sipaúba-Tavares e Rocha 
(2001) propõe temperatura de 25º C para o gênero Chlorella. 
Após a predominância das espécies desejadas através do método de subculturas 
repetidas seguiu o isolamento das colônias monoalgais pelo método de Ágar em placas. 
Para a utilização deste método, foram realizados testes pilotos com outros meios de 
cultura como farinha de peixe, CHU10 e NPK e constatamos a eficiência do NPK 
corroborando os resultados de Sipaúba-Tavares e Rocha (1993); Hardy e Diaz-Castro 
(2000). 
36 
 
 
Após o estriamento, a incubação para o desenvolvimento das colônias unialgais 
utilizando meio sólido foi realizada: 1) em geladeira a temperatura de aproximadamente 
10º C conforme utilizado por Hardy e Diaz-Castro (2000); 2) em estufa a 40º C de 
acordo com Guerrero e Villegas (1982) e 3) na câmara de incubação a temperatura 
ambiente. Este último método (3) foi mais eficiente que os anteriores (1 e 2).Quando a 
incubação foi realizada em geladeira até vigésimo dia não houve nenhumdesenvolvimento de colônias. Na estufa, a partir do décimo terceiro dia foi observado 
poucas colônias, porém o meio o meio de cultura estava contaminado por outros 
microrganismos inviabilizando a cultura. 
Hardy e Diaz-Castro (2000) obtiveram resultados satisfatórios no crescimento das 
colônias utilizando incubação em geladeira. Guerrero e Villegas (1982) sugerem a 
incubação em temperatura em 40ºC. Entretanto, os resultados obtidos nesse trabalho 
diferem dos anteriormente referidos, tendo sido encontrado o melhor crescimento das 
colônias depositando as placas em uma câmara de incubação em temperatura entre 27 e 
28º C. 
O tempo de incubação na câmara foi de 3 dias que consideramos bastante eficiente 
se compararmos estes resultados com aqueles encontrados por Hardy e Diaz-Castro no 
qual o tempo de incubação foi entre 3 e 4 semanas e por Guerrero e Villegas (1982),de 
aproximadamente 10 dias. Portanto consideramos o método adaptado neste trabalho 
adequado e que pode ser adotado para a o isolamento das colônias. 
37 
 
 
CONCLUSÕES 
 
 
1. O método das subculturas repetidas mostrou-se eficiente no processo de 
eliminação de fitoplâncton acompanhante e seleção de Chlorella sp. 
2. O meio NPK (20:5: 20) sólido com agar foi eficiente para o isolamento das 
cepas; 
3. A incubação em temperaturas entre 27 e 28º (ambiente natural) utilizando 
câmara de incubação foi eficiente para o crescimento das cepas; 
4. O processo de isolamento de Chlorella sp. nas condições deste trabalho teve 
duração de 19 dias desde a coleta até a obtenção das cepas monoalgais. 
38 
 
 
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40 
 
 
 
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Goiás, Goiânia, Goiás, 45 pp. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
 
Produção de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de organismos 
zooplanctônicos 
 
RESUMO 
 
O cultivo de algas é de grande importância dentro da cadeia produtiva da piscicultura, 
pois as mesmas transferemdireta ou indiretamente, através do zooplâncton, nutrie ntes 
para as larvas de peixes. A Chlorella sp. constitui um dos alimentos de preferência do 
zooplâncton. O objetivo deste trabalho foi o cultivo de Chlorella sp. visando sua 
utilização na produção de Cladocera para a alimentação de larvas de matrinxã (Brycon 
amazonicus). O experimento foi realizado na Estação de Aquicultura da Fazenda 
Experimental da Universidade Federal do Amazonas-UFAM. Foram utilizadas cepas 
isoladas de Chlorella sp. produzidas no laboratório de fitoplâncton da UFAM. Para a 
produção de Chlorella sp. foram testados dois meios de cultura distribuídos em dois 
tratamentos T1(farinha de peixe procedente do Peru,0,35 g l-1 de água destilada 
peneirada e esterilizada a 160 ° C) e T2 ( 2 ml l- de água destilada de uma solução 
padrão de NPK 20:5:20 g l-1). O delineamento experimental foi inteiramente 
casualizado com três repetições por tratamento. O ambiente de cultivo foi mantido com 
iluminação durante 24 horas aproximadamente (5.000 lux). A temperatura foi 
monitorada diariamente quatro vezes por dia. O cultivo foi iniciado em um volume de 
200 ml, com diluições sucessivas para 900 ml; quatro litros; 18 litros e 30 litros 
efetuadas na fase de crescimento exponencial das células. Para a comparação das 
médias do número de células por tratamento foi utilizado o teste t com nível de 
significância de 5%. A média da temperatura diária do ambiente durante o experimento 
foi 26,75 °C com valor mínimo de 24,4 °C e máximo de 30,75 °C. Em todas as 
diluições a exceção daquela de 200 ml a produção de Chlorella sp. (número de células 
por ml) utilizando meio de cultura enriquecido com farinha de peixe foi 
significativamente superior (P<0,05) aquela produzida no meio de cultura enriquecido 
com NPK (P>0,05).No final do experimento na diluição de 30 litros foram obtidas 
5.747.500 cél ml -1 no meio de cultura de farinha de peixe e 1.557.500 cél ml -1 no 
meio com NPK. Em todas as diluições a farinha de peixe apresentou maior número de 
cél ml -1. . O crescimento exponencial das células, quando foram feitas as diluições foi 
de 3 dias a exceção daquela de 30 litros que durou dois dias. O tempo total da produção 
de Chlorella sp. em laboratório foi de 11 dias.No final do experimento foi confirmada a 
eficiência da farinha de peixe na produção de Chlorella sp. que poderá ser utilizada na 
elaboração de um protocolo para o cultivo dessa microalga. 
 
 
Palavras-chave: cultivo de Chlorella , meios de cultura para microalgas, farinha de 
peixe, NPK. 
42 
 
 
Production of Chlorella sp. laboratory for feeding zooplankton 
 
 
 
ABSTRACT 
 
 Growing algae is of great importance in the chain of farming because they 
transfer directly or indirectly, through zooplankton, nutrients for fish larvae. The 
Chlorella sp. is preferably a food zooplankton. The aim of this work was the cultivation 
of Chlorella sp. for their use in the production of Cladocera for feeding larvae matrinxã 
(Brycon amazonicus). The experience was conducted at Station Aquaculture 
Experimental Farm of the Federal University of Amazonas-UFAM. We used strains of 
Chlorella sp. produced in the laboratory of phytoplankton UFAM. For the production of 
Chlorella sp. were tested both culture media distributed in two treatments T1 (fish meal 
coming from Peru, 0.35 g l-1 distilled water sieved and sterilized at 160 ° C) and T2 (2 
ml l-distilled water solution standard NPK 20:5:20 g l-1). The experimental design was 
completely randomized with three replicates per treatment. The culture environment 
was kept lit for 24 hours approximately (5.000 lux). 
 The temperature was monitored daily four times per day. The cultivation was 
started in a volume of 200 ml with successive dilution to 900 ml, four liters, 18 liters 
and 30 liters performed in the exponential growth phase of the cells. To compare the 
mean number of cells per treatment was used t test with significance level of 5%. The 
average daily temperature in the room during the experiment was 26.75 ° C with a 
minimum of 24.4 ° C and maximum of 30.75 ° C. At all dilutions except that 200 ml of 
the production of Chlorella sp. (Number of cells per ml) using culture medium 
supplemented with fish meal was significantly higher (P <0.05) that produced in the 
culture medium enriched with NPK (P> 0.05). At the end of the experiment at a dilution 
of 30 liters were obtained 5747500 CELL ml -1 in the culture medium of fish meal and 
1,557,500 ml -1 in the middle with NPK. In all dilutions fishmeal had the greatest 
number of Cel ml -1. The exponential growth of the cells, when the dilutions were made 
3 days was the exception that 30 liters which lasted two days. The total time of 
production of Chlorella sp. laboratory was 11days. No end of the experiment confirmed 
the efficiency of fishmeal production of Chlorella sp. that could be used in developing a 
protocol for the cultivation of these microalgae. 
 
 
Keywords : cultivation of Chlorella, culture media for microalgae, fish meal, NPK. 
 
 
43 
 
 
 
Capítulo 02: Produção de Chlorella sp. em laboratório para alimentação de 
organismos zooplanctônicos 
 
INTRODUÇÃO 
 
O fitoplâncton compreende os organismos aquáticos que vivem dispersos na 
coluna de água e têm capacidade fotossintética (Calijuri, 2006), por isso representam o 
mais eficiente conversor de nutrientes e luz em ambientes aquáticos, transferindo 
energia aos níveis tróficos superiores e determinando a produtividade destes ambientes 
(Richmond, 2004). 
Kay (1991), afirma que as algas são fonte de alimento rapidamente renovável e 
produzem mais biomassa que qualquer outro produtor primário por unidade de tempo. 
A produção de trigo (300 kg/matéria seca/ha/ano) quando comparada à produção de 
alga Chlorophyceae,Chlorella sp. (15.700 kg/matéria seca/ha/ano) apresenta valores 
bem inferiores para uma mesma unidade de tempo. 
Na aquicultura, as microalgas são utilizadas como alimento para peixes, 
moluscos, crustáceos e organismos zooplanctônicos, geralmente consumidos na forma 
fresca (alimento vivo), sendo essenciais em determinados estágios de desenvolvimento 
ou em todo ciclo de vida destes organismos (Nunes, 2005). 
Em geral, as microalgas apresentam altas concentrações de lipídios, ácidos 
graxos polinsturados, vitaminas, entre outros que podem ser transferidos para níveis 
mais altos da cadeia trófica via zooplâncton (Sipaúba-Tavares, e Rocha 2001; 
Vendruscolo, 2009). 
Uma microalga para ser viável em dietas fornecidas a zooplâncton deve 
apresentar altas taxas de crescimento, fácil cultivo, ser robusta, ter tamanho e forma 
adequada para ser ingerido, ter parede celular digerível ou ausente, ter disponibilidade 
de carboidratos assimiláveis e alta qualidade nutritiva, ou seja, alto teor de proteína, que 
nas algas fica em torno de 30% (Lourenço, 2006). 
Segundo Sipaúba-Tavares e Rocha (1993), clorofíceas unicelulares ou 
cenobiais são selecionadas para servirem de alimento do zooplâncton, por apresentarem 
44 
 
 paredes celulares mais finas e quantidade elevada de carbono orgânico total em relação 
ao peso seco. 
Entre os gêneros mais utilizados para o cultivo em laboratório e em larga 
escala está a Chlorella. Vários trabalhos utilizaram este gênero para o cultivo com 
diversas finalidades entre elas a produção de zooplâncton (Tanji et al.,1983 ;Portella et 
al ,1997; Alva-Martinez et al.,2001 ;Rodrigues e Filho, 2004; Oshe et al.,2008). 
Segundo Wikfors et al.(1992) as culturas em massa de algas foram obtidas 
basicamente por dois métodos: 1) indução da biomassa do fitoplâncton natural pela 
fertilização de tanques de cultivo e 2) fomento de culturas monoespecificas. Segundo 
estes autores, o primeiro método é mais simples, porém, ineficiente no controle das 
espécies produzidas, já o segundo proporciona um controle a partir da utilização de 
cepas selecionadas, sendopor isso mais adotado por estações de piscicultura em todo 
mundo. 
No Brasil as estações de piscicultura adotam principalmente o primeiro método 
(Albinati,1984;Araujo,1984;Silva et al.,1984;Grieco-Reis et al.,1986). Esta técnica 
apresenta alguns problemas, como a limitação de luz após florescimento do fitoplâncton 
com alta biomassa seguida de um declínio pelo sombreamento das camadas inferiores, 
tornando esta técnica inadequada, para o cultivo em larga escala de algas e zooplâncton 
(Sipaúba-Tavares, 1988). 
Vários meios alternativos para o cultivo de algas em laboratório foram 
desenvolvidos com a finalidade de diminuir os custos na produção obtendo organismos 
com alto valor nutricional em curto espaço de tempo. 
Alguns métodos alternativos foram utilizados para a produção de Chlorella 
sp.como: esgoto doméstico esterilizado (Pipes e Gotaas, 1960); extrato de lodo ativado 
e lodo digerido (Wong & Lay, 1980); despejos industriais purificados ricos em 
nitrogênio (Jusiak et al., 1984); resíduos líquidos de indústria de suco de laranja 
(Beltrão, 1992); vinhaça de cana de açúcar (Oliveira, 1995); NPK (20:5:20) (Sipaúba 
Tavares e Rocha, 1993). 
Ismiño-Orbe (2009), testou a produção de zooplâncton (rotíferos) utilizando 
com sucesso a farinha de peixe como fertilizante para a produção de fitoplâncton. 
Atualmente esta técnica está sendo utilizada com sucesso em Iquitos - Peru para a 
larvicultura do tambaqui e surubim. 
São de grande importância pesquisas para desenvolver técnicas de cultivo em 
massa de algas utilizadas na alimentação direta ou indireta das larvas possibilitando a 
45 
 
transferência dos nutrientes para um nível trófico superior (Sipaúba-Tavares e Rocha, 
1993; Brown et al.,1997). 
Existem diversas espécies de algas e zooplâncton que não possuem tecnologia 
de cultivo em larga escala. Porém foram realizados estudos com enfoque na produção 
em pequena escala (Sipaúba-Tavares, 1988; Sipaúba-Tavares e Rocha, 1993; Sipaúba-
Tavares et al.,1994; Sipaúba-Tavares et al.,1999; Hardy e Castro,2000; Macedo e Pinto-
Coelho, 2000). 
A produção de fitoplâncton constitui uma necessidade para viabilizar a 
produção de organismos zooplanctônicos que possam ser utilizados na alimentação 
inicial de larvas de peixes amazônicos que hoje constitui o maior entrave tecnológico 
para a piscicultura de espécies nativas como o tambaqui e matrinxã. 
 Considerando-se a necessidade de adaptar uma metodologia de cultivo de 
fitoplâncton para a produção de zooplâncton, o objetivo deste trabalho foi desenvolver 
uma metodologia própria de cultivo de Chlorella sp. que seja de fácil adoção e 
economicamente viável, para a produção continua e em massa de alimento vivo de boa 
qualidade. Conjectura-se que este alimento seja capaz de suportar a larvicultura 
intensiva de peixes utilizados na piscicultura regional que atualmente constitui um elo 
fundamental na cadeia produtiva da piscicultura com espécies nativas amazônicas. 
46 
 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
 
O experimento foi realizado no Laboratório de Fitoplâncton da Estação de 
Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas-UFAM, 
localizada no km 38 da BR 174, em janeiro de 2012. 
A partir de cepas isoladas de Chlorella sp. obtidas conforme descrito no capítulo 
1, para o cultivo desta espécie em laboratório foram testados dois meios de cultura 
distribuídos em dois tratamentos: no tratamento 1 (T1) foi utilizado farinha de peixe 
(0,35 g l-1 peneirada e esterilizada a 160°C) (Ismiño-Orbe, 2009) e no tratamento 2 
(T2), NPK (2 l l-1 de uma solução padrão de NPK 20:5: 20 g l-1) (Hardy e Diaz-Castro, 
2000). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com três repetições 
por tratamento (Figura 1). 
O sistema utilizado para o cultivo foi estático não- axênico. A iluminação foi 
mantida constante de aproximadamente 5.000 lux monitorado com luxímetro digital. A 
temperatura ambiente, monitorada diariamente quatro vezes por dia (01:00; 07:00; 
13:00 e 19:00 horas). As culturas foram mantidas com aeração continua proveniente de 
um compressor radial utilizando pedras porosas de aquário. 
 O cultivo foi iniciado a partir de 20 ml da cepa diluída em um volume 200 ml, e 
posteriores diluições para 900 ml; 4 litros; 18 litros e 30 litros efetuados na fase 
exponencial de crescimento das células (Figura 2). Em cada diluição e em ambos meios 
de cultura foi acrescentada vitamina do complexo B (B1 100mg, B12 5000mcg e B6 
100mg) preparada em farmácia de manipulação. Uma cápsula deste complexo 
vitamínico foi diluída em 2 litros de água destilada. As dosagens utilizadas podem ser 
observadas na tabela 1. 
O acompanhamento do crescimento algal foi diário a partir de contagens sob 
microscópio óptico com aumento de 10X utilizando uma câmara de Neubauer (Sipaúba-
Tavares e Rocha, 2001). Foram feitas três contagens diárias de cada repetição 
totalizando 9 amostras por tratamento. 
Para estimar o número de células/ml foi utilizada a fórmula: 
d (células/ml) = contagem total x 10 ⁴/n° de blocos contados (Sipaúba-Tavares e 
Rocha,2001). 
Para a comparação das médias do número de células por tratamento foi utilizado o 
teste t calculado com o programa Sigma Stat versão 3.1. 
47 
 
 
Durante cultivo, medidas de assepsia foram praticadas como procedimento de 
rotina para evitar a contaminação das amostras. Para evitar a contaminação por insetos e 
outras substâncias indesejáveis os recipientes contendo as amostras foram cobertos com 
uma malha de 150µ e papel alumínio perfurado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Volumes (ml) Vitamina B (ml) 
200 0,5 
900 0,8 
4.000 3,5 
18.000 19 
30.000 30 
Tabela 1. Quantidade do complexo vitamínico utilizado por volume 
 
Figura 1. Delineamento experimental inteiramente casualizado 
 
 
 
T2 T1 T1 T2 T2 T1 
48 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A B C 
D ED 
Figura 2. Unidades experimentais utilizadas para o cultivo: a - 250 ml; b-1000 ml; c- 5 litros; d- 20 
lit ros; e- 35 litros. 
Fonte: Arquivo pessoal 
 
 
 
 
 
 
a b 
c d 
e 
49 
 
 
 
RESULTADOS 
 
O cultivo de Chlorella sp. foi iniciado em volume de 200 ml com média de 
1.065.000,00 cél.ml- para o meio de cultura farinha de peixe e 369.027,77 cél.ml-1 com 
o meio de cultura NPK. 
Após 3 dias de cultivo nesta diluição (200 ml) o meio de cultura com farinha de 
peixe apresentou uma concentração algal de 7.888.750,00 cél. ml-1 que foi superior 
quando comparada ao meio de cultura NPK que foi de 6.415.250,00 cél.ml-1(Figura 
3). Entretanto, o teste t aplicado aos dados revelou que não existiu diferença 
significativa entre os valores médios finais de cada tratamento (P=0,129). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Após o terceiro dia de cultivo, na diluição de 900 ml o meio com farinha de 
peixe alcançou 47.275.00,00 cél. ml-1, enquanto o meio com NPK alcançou 
2.912.500,0 cél.ml-1 ,tendo o meio com farinha de peixe um crescimento algal 
significativamente maior (P=0, 005) quando comparado com o meio NPK (Figura 4). 
Figura 3. Curvas de crescimento de Chlorella sp em volume de 200 ml : a- meio de cu ltura farinha de peixe;b- 
meio de cultura NPK 
200 ml
Dias de cultivo
1 2 3
C
él
u
la
s/
m
l
0
2e+6
4e+6
6e+6
8e+6
1e+7
 
200 ml
Dias de cultivo
1 2 3
C
él
u
la
s/
m
l
0
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6
5e+6
6e+6
7e+6
 
50 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
No volume de 4 litros, a fase exponencial de crescimento foi alcançada no 
terceiro dia com 4.138.750,0 cél. ml-1 para o cultivo com farinha de peixe e 2858750,0 
cél.ml-1 para o cultivo com NPK (Figura 5).O teste t aplicado aos dados revelou que o 
crescimento algal no meio de cultura com farinha de peixe foi significativamente 
superior que no meio de cultura NPK (P=0, 001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Curvas de crescimentode Chlorella sp. em volume de 4 litros : a- meio de cultura farinha de peixe;b- 
meio de cultura NPK 
 4 litros
Dias de cultivo
1 2 3
C
él
u
la
s/
m
l
0
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6
5e+6
 
 4 litros
Dias de cultivo
1 2 3
C
él
u
la
s/
m
l
0
5e+5
1e+6
2e+6
2e+6
3e+6
3e+6
 
Figura 4. Curvas de crescimento de Chlorella sp. em volume de 900 ml : a- meio de cultura farinha de peixe;b- 
meio de cultura NPK 
 
900 ml
Dias de cultivo
1 2 3
C
él
u
la
s/
m
l
0
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6
5e+6
 
 900 ml
Dias de cultivo
1 2 3
C
él
u
la
s/
m
l
0,0
5,0e+5
1,0e+6
1,5e+6
2,0e+6
2,5e+6
3,0e+6
3,5e+6
 
51 
 
 
No volume de 18 litros, a farinha de peixe também se mostrou mais eficiente no 
crescimento algal comparado com o meio de cultura NPK com 4.322.500,00 cél. ml-1 e 
1.495.000,0 cél.ml-1, respectivamente (Figura 6). O teste t aplicado aos dados revelou 
que existia diferença significativa entre os valores médios de cada tratamento (P< = 0, 
001) ao terceiro dia de cultivo, onde o T1(farinha de peixe) foi mais eficiente que o T2 
(NPK). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
No volume de 30 litros o crescimento exponencial foi obtido com dois dias de 
cultivo e o número de células obtido utilizando farinha de peixe foi de 5.747.500,00 cél. 
ml-1 superior ao número obtido no meio de cultura NPK que foi de 1.557.500,00 cél.ml-
1 .(Figura 7). O teste t aplicado aos dados revelou que o número de células no meio com 
farinha de peixe foi significativamente superior (P=< 0,001) aos obtidos com o meio 
NPK. 
Figura 6. Curvas de crescimento de Chlorella sp. em volume de 18 litros : a- meio de cu ltura farinha de 
peixe;b- meio de cu ltura NPK 
18 litros
Dias de cultivo
1 2 3
C
él
u
la
s/
m
l
0
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6
5e+6
 
18 litros
Dias de cultivo
1 2 3
C
él
u
la
s/
m
l
0,0
2,0e+5
4,0e+5
6,0e+5
8,0e+5
1,0e+6
1,2e+6
1,4e+6
1,6e+6
 
52 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Durante o período de cultivo, a média da temperatura diária foi de 26,75º C 
como valor mínimo de 24,4º C e máximo de 30,75º C. 
Em todas as diluições a farinha de peixe apresentou crescimento exponencial 
com três dias de cultivo a exceção daquela de 30 l que durou dois dias. O tempo total da 
produção de Chlorella sp.em laboratório foi de 11 dias. 
 Foi observado que a fase de crescimento exponencial coincide com uma 
coloração verde claro uniforme sem grumos. Quando a coloração se torna verde-escuro 
e com presença de grumos foi observado que o número de células diminui 
caracterizando a fase senescente (Figura 8). 
Figura 7. Curvas de crescimento de Chlorella sp. em volume de 30 litros : a- meio de cu ltura farinha de peixe;b- 
meio de cultura NPK 
30 litros
Dias de cultivo
1 2
C
él
u
la
s/
m
l
1e+6
2e+6
3e+6
4e+6
5e+6
6e+6
 
30 litros
Dias de cultivo
1 2
C
él
u
la
s/
m
l
6,0e+5
8,0e+5
1,0e+6
1,2e+6
1,4e+6
1,6e+6
 
53 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Padrão de coloração durante o cultivo de Chlorella sp. nas diferentes 
diluições utilizadas:a-200 ml; b-900 ml ;c- 4 litros; d- 18 lit ros; e- 30 litros 
Fonte: Arquivo pessoal 
 
 
 
Fonte: Arquivo pessoal 
54 
 
 
DISCUSSÃO 
 
Em cultivos controlados de algas os meios de cultura oferecem os nutrientes 
necessários para o crescimento ótimo das espécies (Fioresi e Sipaúba-Tavares, 2008). A 
densidade de células no cultivo depende da espécie e do tipo de fertilizante utilizado, 
interagindo com as variáveis físicas e químicas no desenvolvimento e crescimento da 
microalga (Sipaúba-Tavares et al.,1999). 
Neste estudo o cultivo de Chlorella sp. com o meio de cultura farinha de peixe 
apresentou no final do experimento densidade média de células significativamente 
maior que no NPK em todas as diluições a exceção da de 200 ml. 
Vários meios de cultura alternativos vêm sendo utilizados para o cultivo de 
Chlorella, entre eles estão os efluentes industriais, efluentes de biogestores, lodo 
digerido, esgoto domestico e resíduos de suinocultura (Pipes e Gotaas,1960; Wong e 
Lay,1980;Jussiak et al.,1984; Rodriguez,2000;Sanchez et al,2001). 
Ismiño-Orbe (2009) trabalhando com produção de S.quadricauda mostrou a 
eficiência da farinha de peixe como meio de cultura para a produção massiva desta 
espécie que por sua vez foi utilizada para a produção de organismos zooplanctônicos 
que foram utilizados na larvicultura de tambaqui e surubim. Neste trabalho foi também 
demonstrada a eficiência da farinha peixe com produção de 5.747.500,00 cél. ml-
1.cel.ml que não podem ser comparados com os dados da referida autora, pois a mesma 
não fornece dados quantitativos. 
Pereira (2001) utilizando meio de cultura NPK para o cultivo de 
Ankistrodesmus gracilis afirma que o mesmo foi eficiente tanto em pequena como em 
larga escala promovendo fase exponencial em cinco dias com número máximo de 
células de 119, 30 x104 cél.ml-1. Hardy e Diaz-Castro (2000) trabalhando com os meios 
tradicionais NPK (20:5: 20) e Chu 12, afirmam que o Scenedesmus quadricauda teve 
bom desenvolvimento em ambos os meios, com crescimento exponencial entre 5 e 7 
dias e tendência de melhor crescimento no meio NPK com 107 células.ml-1. 
Klein e Gonzalez (1993), testando diferentes meios de cultura (água de 
matadouro, vinhoto e caldo de peixe) para o cultivo de Tetraselmis chuii obteve bons 
resultados com caldo de peixe apresentando densidade celular de 201 x 104 céls.ml-1, no 
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entanto o cultivo com a farinha de peixe, utilizada neste trabalho, teve resultados 
superiores em número de células/ml-1 . 
No presente estudo no decorrer de 11 dias foram obtidos 5.7475.00,00 cél. ml-1 
em farinha de peixe e 1.557.500,00 cél.ml-1 no NPK. Vendrúsculo (2009), testando o 
cultivo da Chloropyceae, Scenedesnus quadricauda com biodigerido de aves obteve 
um pico máximo de 1.327.756 células/ml no sétimo dia, totalizando 14 dias de cultivo. 
O número de cél.ml‾1 foi menor ao encontrado com farinha de peixe. O mesmo afirma 
que o cultivo da microalga Scenedesmus quadricauda atinge o máximo 
desenvolvimento num intervalo de 8 a 11 o que também foi observado neste estudo 
(11dias) para Chlorella sp. 
Rodrigues e Belli Filho (2004), cultivando Chlorella minutissima em meio de 
esterco suíno, obtiveram um pico de crescimento ao redor do 7o dia em menor 
densidade (2,1 x 105 células.ml-1), quando comparado aos resultados deste estudo com 
farinha de peixe e NPK. 
Neste trabalho a multiplicação das células de Chlorella sp. e S.quadricauda 
ocorreu em temperaturas entre 25 e 27ºC semelhantes aquelas utilizadas por Ohse et 
al.(2008) e Pequeno et al.(2012) para o cultivo de Chlorella sp. (25±2º C e 28 ± 3°C 
respectivamente).Vendrúscolo (2009) utilizou a temperatura de 24º C para 
S.quadricauda. Já no estudo sobre qualidade nutricional de S.quadricauda desenvolvido 
por Macedo (1999) a temperatura foi de 20º C. Sipaúba-Tavares e Rocha (2001) propõe 
temperatura de 25º C para o gênero Chlorella. 
Pequeno et al (2012) e Oshe et al (2008), estudando o efeito da temperatura no 
crescimento de microalgas encontraram densidades de 7,5 cél.ml‾1 e 772x104 cél.ml‾1 
em temperaturas de 28 ± 3°C e 25º C respectivamente. Os intervalos de temperatura 
encontrados neste estudo (24,4º C e 30,75º C) foram semelhantes aos resultados 
referidos pelos autores. 
Comparando o efeito da iluminação sobre o crescimento celular com os dados 
de Portella et al.(1997); Hardy e Diaz-Castro(2000); Oshe et al (2008) e que utilizaram: 
3200 a 4000 lux; 2500 lux respectivamente. Estes resultados foram semelhantes a 
luminosidade utilizada neste trabalho que foi de aproximadamente 5000 lux. 
 
De acordo com as observações realizadas neste experimento a densidade algal 
estava relacionada com a tonalidade de coloração sendo o verde claro sendo a cor 
característica de cultura em crescimento exponencial quando foram realizadas as 
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diluições.