AtividadeLarvicidaInibicao-Bezerra-2022

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS 
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - BACHARELADO 
 
 
 
 
 
 
PEDRO VÍTOR VALE BEZERRA 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADE LARVICIDA E INIBIÇÃO in vitro DE PROTEASES INTESTINAIS DE 
Aedes aegypti POR EXTRATOS DE SEMENTES DE PLANTAS DA CAATINGA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL 
2022 
 
PEDRO VÍTOR VALE BEZERRA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADE LARVICIDA E INIBIÇÃO in vitro DE PROTEASES INTESTINAIS DE 
Aedes aegypti POR EXTRATOS DE SEMENTES DE PLANTAS DA CAATINGA 
 
 
 
 
 
Monografia apresentada ao curso de graduação 
em Ciências Biológicas, da Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte, como 
requisito parcial à obtenção do título de 
Bacharel em Ciências Biológicas. 
 
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira 
Uchôa 
Coorientador: Dr. Giulian César da Silva Sá 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL 
2022 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN 
Sistema de Bibliotecas - SISBI 
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB 
 
 Bezerra, Pedro Vítor Vale. 
 Atividade larvicida e inibição in vitro de proteases 
intestinais de Aedes aegypti por extratos de sementes de plantas 
da caatinga / Pedro Vitor Vale Bezerra. - 2022. 
 48 f.: il. 
 
 Monografia (graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, Centro de Biociências, Graduação em Ciências Biológicas 
Bacharelado. Natal/RN, 2022. 
 Orientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira Uchôa. 
 Coorientador: Dr. Giulian César da Silva Sá. 
 
 
 1. Homogenato intestinal - Monografia. 2. Zimograma - 
Monografia. 3. Atividade aedicida - Monografia. 4. Proteases 
serínicas - Monografia. I. Uchôa, Adriana Ferreira. II. Silva, 
Giulian César da. III. Título. 
 
RN/UF/BSCB CDU 616.34-002 
 
 
 
 
 
 
Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351 
 
 
 
 
 
 
 
PEDRO VÍTOR VALE BEZERRA 
 
 
ATIVIDADE LARVICIDA E INIBIÇÃO in vitro DE PROTEASES INTESTINAIS DE 
Aedes aegypti POR EXTRATOS DE SEMENTES DE PLANTAS DA CAATINGA 
 
 
Monografia apresentada ao curso de Graduação 
em Ciências Biológicas da Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte, como 
requisito parcial à obtenção do título de 
Bacharel em Ciências Biológicas. 
 
 
Aprovada em: 22/07/2022 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
______________________________________ 
Profa. Dra. Adriana Ferreira Uchôa 
(Presidenta/Orientadora) 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
 
______________________________________ 
Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos 
(Examinador 1 - Membro interno) 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
 
______________________________________ 
Dr. Cássio Lázaro Silva Inácio 
(Examinador 2 - Membro externo) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho a minha avó Djandi de 
Medeiros Vale in memoriam e a todas as outras 
vítimas impactadas pelas arboviroses. Espero 
que a continuação desta pesquisa consiga 
futuramente contribuir para o controle dessas 
doenças. 
 
AGRADECIMENTOS 
 
O que consegui realizar até hoje, é fruto da contribuição de um número de relações 
que não consigo mensurar. Assim, de maneira geral, sou grato a todas as pessoas que 
contribuíram com um ou mais tijolos na construção pessoal e profissional que venho erguendo 
e que continuará em constante edificação. 
Sou imensamente grato à minha orientadora Dra. Adriana Uchôa, por ter me acolhido 
tão gentilmente a seu grupo de pesquisa, por ter acredito no meu potencial e alimentado uma 
centelha de curiosidade cuja chama continua crescendo até hoje, por ter me ensinado tanto 
desde a teoria até a bancada, e não somente sobre ciência e academia, mas sobre questões extra-
acadêmicas que certamente trouxeram reflexão e me inspiraram a me tornar uma pessoa e um 
pesquisador melhor. Agradeço também ao meu coorientador Giulian Sá, que igualmente me 
acolheu com tanto carinho e investiu no meu potencial, me mostrou os caminhos a percorrer 
numa pesquisa e na escrita deste trabalho. Obrigado por acreditar em mim e tornar tudo mais 
leve e divertido com sua personalidade icônica. 
Destaco minha gratidão a toda minha família, pelo suporte, carinho e compreensão. 
Em especial, meus pais, que abdicaram de múltiplas coisas para investir na minha educação e 
viabilizar meu acesso a tanto conhecimento e toda a rica experiência que pude ter no curso de 
Ciências Biológicas da UFRN. Ao meu irmão Arthur e minha prima/irmã Isabelle, que 
cresceram junto comigo e representam grande influência do que sou hoje. 
Sou profundamente grato a Marina Rocha, que foi meu porto seguro durante toda a 
construção deste trabalho. A experiência foi recheada de ansiedade e insegurança e sua presença 
foi de suma importância para voltar a minha estabilidade e continuar. Obrigado pelo carinho, 
pelo apoio, por trazer tanto bem-estar, por acreditar no meu potencial e me ajudar a refletir e 
construir um Pedro melhor a cada dia. 
Agradeço a minhas amigas parceiras do Laboratório de Proteomas (UFRN) Melissa e 
Leidiane, por terem igualmente me acolhido tão bem ao grupo de pesquisa, por me ensinarem 
tanto, desde o básico até os experimentos mais complexos, o passo a passo que vocês fizeram 
comigo foi fundamental. Obrigado também por tornarem a rotina de pesquisa leve e divertida, 
nossas conversas, risadas e aprendizados estão eternizados nas minhas memórias. Agradeço ao 
novo integrante do laboratório, Dalmo, pela companhia e frequente ajuda nos experimentos que 
realizei neste trabalho, sem dúvida você contribuiu para que desse certo. 
Carrego muita gratidão por todas as amizades que construí ao longo da graduação 
Guilherme, Juan, João, Artur, Isabel, Saulo, Bianca, Suzanne, Carol, Letícia, Damila, Amanda, 
 
Andressa, Martina, Wandrel, Jorge, Jesus e muitos outros. A graduação foi recheada de 
desesperos, conquistas, perrengues, campos, práticas, experiências que se tornaram ainda mais 
especiais por serem compartilhadas com vocês, com um carinhoso toque de apoio mútuo. 
Agradeço ao professor Dr. Elizeu Antunes, por disponibilizar a estrutura, reagentes e 
equipamentos do Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas (LQFPB-UFRN) 
indispensável para realização deste trabalho, pelos ensinamentos em laboratório e em aula, por 
aceitar participar da banca avaliadora do TCC e contribuir com meu trabalho. Aos demais 
membros do LQFPB, especialmente Geovanna, Igor, Rafael e Lídia, pela ajuda e orientação 
nas atividades e pela companhia. 
Agradeço à professora Dra. Fátima Ximenes, por disponibilizar a estrutura, os 
equipamentos e a colônia de Aedes aegypti do Laboratório de Pesquisa em Entomologia 
(LABENT- UFRN) essencial para a realização deste estudo. Agradeço a toda a equipe do 
LABENT, Cássio, Virgínia, Ayrton e demais, por consolidar o funcionamento e progressão da 
colônia, das atividades e do ambiente de trabalho, pelos ensinamentos e pelas maravilhosas 
companhia e conversas durante os intervalos, vocês tornaram a rotina de pesquisa leve e 
prazerosa. 
Destes, em especial, gostaria de agradecer profundamente a Dr. Cássio Lázaro, pela 
ajuda com os bioensaios, por ter me ensinado tudo sobre manutenção de colônia do Aedes, ter 
possibilitado a reativação da colônia pós-pandemia, o que tornou meu TCC possível de realizar, 
por ter me ensinado a dissecar os intestinos das larvas, e pelo ensinamento das demais atividades 
no LABENT. Em último, sou muito grato por aceitar participar da minha banca avaliadora e 
contribuir com seu conhecimento e sua experiência. 
Agradeço ao professor Dr. Hugo Alexandre, por disponibilizar a estrutura e 
equipamentos do Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL-UFRN), e sua 
equipe de orientandos, pelapaciência, por serem tão prestativos e se disponibilizarem a orientar 
nas atividades do BIOPOL. Muito obrigado Weslley, Rony, Cynthia, Maylla, Leonardo e Lucas 
por toda a ajuda, em especial Cynthia e Maylla por terem me socorrido em um imprevisto 
durante uma eletroforese dos zimogramas. 
Agradeço a professora Dra. Selma Jerônimo e a todas as equipes de laboratórios do 
Instituto de Medicina Tropical, por disponibilizarem estrutura e equipamentos que necessitei 
nesta jornada. 
Muito obrigado a todos os professores e demais funcionários da UFRN por me 
ensinarem tanto, por manterem essa instituição grandiosa funcionando e por tudo que me 
proporcionaram. Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 
 
Tecnológico (CNPQ) pelo financiamento e apoio das pesquisas que contribuo, incluindo a que 
gerou este trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A vida é uma união simbiótica e cooperativa, permitindo triunfar 
aqueles que se associam. 
Lynn Margulis 
 
RESUMO 
 
Arboviroses são doenças epidemiologicamente relevantes transmitidas por artrópodes, afetando 
sobretudo países tropicais, como o Brasil. Atualmente o enfrentamento das arboviroses é 
realizado, principalmente, através do controle populacional do Aedes aegypti, principal 
mosquito vetor urbano. Recentemente, a busca por alternativas ecologicamente amigáveis para 
o controle vetorial tem sido incentivada, como o desenvolvimento de inseticidas botânicos. 
Nesse cenário, a Caatinga, centro de biodiversidade, representa uma fonte importante de 
espécies vegetais para prospecção de moléculas inseticidas. A presente pesquisa investigou a 
potencial atividade de extratos de sementes de 3 espécies vegetais da Caatinga, Amburana 
cearensis, Anadenanthera colubrina e Erythrina velutina, contra larvas de A. aegypti, e buscou 
avaliar, in vitro, suas capacidades de inibição das proteases intestinais das larvas deste 
mosquito. Bioensaios foram realizados expondo as larvas em diferentes concentrações dos 
extratos, sendo analisada a taxa de sobrevivência larval em 24h e 48h, para estimar as 
concentrações letais 50% (CL50). Homogenatos foram produzidos a partir dos intestinos 
médios das larvas para analisar in vitro a inibição pela exposição aos extratos, 
quantitativamente, através de ensaio de atividade enzimática, e qualitativamente, através de 
zimogramas. Os extratos aquosos de A. cearensis (EC), A. colubrina (EA) e E. velutina (EM) 
comprometeram a sobrevivência das larvas, apresentando CL50 iguais a 0,67 mg/mL, 0,28 
mg/mL e 1,85 mg/mL, após 24h de exposição, e 0,24 mg/mL, 0,05 mg/mL e 0,91 mg/mL, após 
48h de exposição, respectivamente. A caracterização inicial dos extratos sugere uma eficiência 
nas condições de extrações, com rendimento em peso seco entre 14,53 mg e 34,50 mg, 
rendimento total entre 7,56% e 54,16%, e teores de proteínas solúveis entre 1,16 mg/mL e 2,30 
mg/mL. As proteínas solúveis nos extratos possivelmente favoreceram o comprometimento da 
atividade enzimática das proteases do homogenato intestinal das larvas de A. aegypti, com 
atividade inibitória específica em EC (662,65 UI/mg), EA (226,19 UI/mg) e EM (496,11 
UI/mg). As análises dos zimogramas revelaram a presença de bandas proteolíticas de peso 
molecular relativo alto (acima de 66 kDa), médio (entre 45 kDa e 30 Kda) e baixo (abaixo de 
30 kDa), e que os extratos afetaram grupos distintos de proteases do homogenato das larvas. Os 
resultados indicam que a inibição das proteases intestinais pode compreender um dos modos de 
ação para a atividade larvicida dos extratos, em especial para o extrato EC. Testes 
complementares estão em andamento para confirmar essa relação. 
 
Palavras-chave: Homogenato intestinal. Zimograma. Atividade aedicida. Proteases serínicas. 
 
ABSTRACT 
 
Arboviruses are epidemiologically relevant viruses transmitted by arthropods, affecting 
especially tropical countries, such as Brazil. Currently, the fight against arboviruses is carried 
out mainly through population control of Aedes aegypti, main urban vector mosquito. Recently, 
the search for eco friendly alternatives for vector control has been encouraged, such as the 
development of botanical insecticides. In this scenario, the Caatinga, a center of biodiversity, 
represents an important source of plant species for prospecting insecticidal molecules. The 
present research investigated the potential activity of seed extracts from 3 plant species from 
the Caatinga, Amburana cearensis, Anadenanthera colubrina and Erythrina velutina, against 
A. aegypti larvae, and sought to evaluate, in vitro, the ability to inhibit intestinal proteases of 
the mosquito larvae. Thus, bioassays were performed exposing the larvae to different extract 
concentrations, and the percentage of larval survival at 24 and 48 hours was analyzed in order 
to estimate the lethal concentrations 50% (LC50). For the in vitro tests, homogenates were 
produced from the larvae midguts, in order to analyze the inhibition by exposure to extracts 
quantitatively, through an enzyme activity assay, and qualitatively, through zymography. The 
aqueous extracts of A. cearensis (CE), A. colubrina (AE) and E. velutina (ME) compromised 
larval survival, presenting LC50 equal to 0.67 mg/mL, 0.28 mg/mL and 1, 85 mg/mL, after 24h 
of exposure, and 0.24 mg/mL, 0.05 mg/mL and 0.91 mg/mL, after 48h of exposure, 
respectively. The initial characterization of the extracts suggests an efficiency in the extraction 
conditions, with dry weight yield between 14.53 mg and 34.50 mg, total yield between 7.56% 
and 54.16%, and soluble protein contents between 1,16 mg/ml and 2,30 mg/ml. The extracts 
soluble proteins possibly contributed for the enzyme activity impairment of A. aegypti larvae 
intestinal homogenate proteases, with specific inhibitory activity in CE (662.65 IU/mg), AE 
(226.19 IU/mg) and ME (496.11 IU/mg). The zymography analysis revealed the presence of 
proteolytic bands of high relative molecular weight (above 66 kDa), medium (between 45 kDa 
and 30 kDa) and low (below 30 kDa), and that the extracts affected distinct proteases groups in 
the larval homogenate. The results indicate the inhibition of intestinal proteases may comprise 
one of the modes of action for the larvicidal activity of the extracts, especially for the CE extract. 
Complementary tests are underway to confirm this relationship. 
 
Keywords: Intestinal homogenate. Zymography. Aedicidal activity. Serine proteases. 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 – Ciclo de vida do Aedes aegypti e principais arboviroses transmitidas pela 
fêmea................................................................................................. 
 
17 
Figura 2 – Sementes de Amburana cearensis (Cumaru), Anadenanthera colubrina 
(Angico) e Erythrina velutina (Mulungu)................................................ 
 
22 
Figura 3 – Desenho experimental do teste in vitro para detecção de inibição das 
proteases do HIL pelos extratos............................................................... 
 
26 
Figura 4 – Atividade residual do homogenato intestinal de larvas nos tratamentos 
com extratos de Angico, Cumaru e Mulungu........................................... 
 
31 
Figura 5 – Atividade Inibitória Específica dos extratos de Angico, Cumaru e 
Mulungu................................................................................................... 
 
32 
Figura 6 – Perfil enzimático do homogenato intestinal de larvas de Aedes aegypti 
em zimograma.......................................................................................... 
 
33 
Figura 7 – Zimogramas dos tratamentos do homogenato intestinal de larvas de 
Aedes aegypti com os extratos de Angico, Cumaru e Mulungu.............. 
 
34 
Figura 8 – Comparação do gel-espelho e zimograma do homogenato intestinal delarvas de Aedes aegypti e do extrato de Angico, isolados e combinados. 
 
35 
Figura 9 – Comparação do gel-espelho e zimograma do homogenato intestinal de 
larvas de Aedes aegypti e do extrato de Cumaru, isolados e combinados 
 
36 
Figura 10 – Comparação do gel-espelho e zimograma do homogenato intestinal de 
larvas de Aedes aegypti e do extrato de Mulungu, isolados e 
combinados............................................................................................... 
 
 
37 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 – Extratos produzidos a partir das sementes de A. cearensis (Cumaru), A. 
colubrina (Angico) e E. velutina (Mulungu).............................................. 
 
23 
Tabela 2 – Determinação do peso seco, rendimento total e teor de proteínas solúveis 
totais dos extratos....................................................................................... 
 
29 
Tabela 3 – Concentrações letais encontradas após bioensaios dos extratos com larvas 
de Aedes aegypti............................................................................... 
 
30 
Tabela 4 – Inibição da atividade proteolítica do homogenato intestinal de larvas de 
Aedes aegypti pelos extratos....................................................................... 
 
30 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 16 
2 OBJETIVOS....................................................................................................... 21 
2.1 Objetivo geral..................................................................................................... 21 
2.2 Objetivos específicos.......................................................................................... 21 
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 21 
3.1 Materiais biológicos............................................................................................ 21 
3.1.1 Obtenção das sementes......................................................................................... 21 
3.1.2 Obtenção das larvas de Aedes aegypti................................................................. 22 
3.2 Produção dos extratos........................................................................................ 22 
3.3 Caracterização inicial dos extratos................................................................... 23 
3.3.1 Rendimento da extração....................................................................................... 23 
3.3.2 Teor de proteínas solúveis totais.......................................................................... 24 
3.4 Ensaio biológico larvicida contra Aedes aegypti com extratos das sementes 24 
3.5 Investigação dos efeitos na atividade enzimática de proteases do intestino 
médio de larvas de Aedes aegypti pelos extratos de sementes......................... 
 
24 
3.5.1 Dissecação de intestinos das larvas de Aedes aegypti e obtenção do homogenato 
intestinal larval (HIL) .......................................................................................... 
 
24 
3.5.2 Teste in vitro para detecção de inibição das proteases do HIL pelos extratos..... 25 
3.6 Zimograma.......................................................................................................... 27 
3.7 Gel-espelho (SDS-PAGE) ................................................................................. 28 
3.8 Análises estatísticas............................................................................................ 28 
4 RESULTADOS................................................................................................... 28 
4.1 Caracterização inicial dos extratos................................................................... 28 
4.2 Ensaios larvicidas de A. aegypti com extratos das sementes.......................... 29 
4.3 Detecção da atividade inibitória das proteases do homogenato intestinal de 
larvas de A. aegypti pelos extratos................................................................ 
 
30 
4.4 Zimograma: perfil enzimático do homogenato intestinal de larvas e 
inibição da proteólise pelos extratos................................................................. 
 
32 
4.5 Perfil eletroforético (SDS-POAGE 12%) dos géis-espelho............................. 34 
5 DISCUSSÃO....................................................................................................... 37 
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................ 41 
 
 REFERÊNCIAS................................................................................................. 42 
 APÊNDICE A – PERFIL ELETROFORÉTICO DOS TRATAMENTOS 
DE HIL E EXTRATOS ISOLADOS E COMBINADOS............................... 
 
47 
 
 
 
 
 
16 
 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
Os arbovírus representam um grupo de vírus de RNA transmitidos aos seres humanos 
predominantemente por artrópodes hematófogos, principalmente mosquitos, flebotomíneos e 
carrapatos (SCHNEIDER; CALVO; PETERSON, 2021). Os arbovírus disseminados por 
mosquitos pertencem majoritariamente aos gêneros Alphavirus e Flavivirus (SCHNEIDER; 
CALVO; PETERSON, 2021), nos quais se enquadram as espécies virais responsáveis por 
arboviroses de grande relevância epidemiológica no Brasil e no mundo, a saber: dengue, febre 
amarela, zika e chikungunya (DE SOUZA et al., 2022; WHO, 2021). Essas arboviroses 
compartilham aspectos clínicos semelhantes, embora a febre amarela e a dengue possam induzir 
episódios de febre hemorrágica; a chikungunya pode se tornar debilitante pela artralgia grave; 
enquanto pessoas acometidas por zika estão predispostas ao desencadeamento da síndrome de 
Guillain-Barré, além de proporcionar alterações congênitas em fetos, como microcefalia e 
hidropisia fetal (NEVES, 2021; REIS et al., 2021). 
Em períodos epidêmicos sazonais, a porcentagem de casos graves de infecção por 
arbovírus tende a aumentar significativamente (DONALISIO; FREITAS; ZUBEN, 2017), 
sobretudo em países tropicais, como observado atualmente no Brasil com o elevado número de 
casos ocorridos em 2022 (BRASIL, 2022). Segundo o 21° boletim epidemiológico de 
arboviroses do Ministério da Saúde, até a 20ª semana de 2022, o Brasil apresentou 1.036.505 
casos prováveis de dengue, 98.540 de chikungunya, 4.839 de zika e 575 casos suspeitos de 
febre amarela, estes últimos relacionados ao contato em áreas silvestres por pessoas não 
vacinadas, que representam risco para surtos do ciclo urbano (BRASIL, 2022). Dentre as 
regiões afetadas, a região Nordeste se sobressai por ser um centro hiperendêmico da dengue há 
mais de 30 anos e, ainda, sofrer as consequências da epidemia de Zika de 2015 (RODRIGUEZ-
BARRAQUER et al., 2019). Estes dados evidenciam a necessidade de implementar estratégias 
que minimizem os impactos gerados pelas arboviroses. 
Quanto à prevenção baseada na imunização da população contra as arboviroses, apenas 
a febre amarela contempla a existência de uma vacina eficaz e disponível no sistema público 
de saúde, a YFV-17D (PETRAGLIA et al., 2020) incluída no Plano Nacional de Imunização 
em 2018, por maior circulação do vírus observado com o surto em 2017 (GOLDANI, 2017). 
Embora exista uma vacina para o manejo da dengue, CYD-TDV (Dengvaxia®), sua eficácia é 
relatada apenas para soropositivos e ainda não contempla os quatro sorotipos virais (DENG et 
al., 2020). Em relação à zika e à chikungunya, as vacinas continuam em fase de 
desenvolvimento (CASTANHA; MARQUES, 2020; REZZA; WEAVER, 2019). Essa 
17 
 
 
conjuntura, simultânea à inexistência de terapias específicas e aos quadros epidêmicos, 
direciona uma estrutura de combate às arboviroses centrada em medidas para controle 
populacional dos vetores dos agentes etiológicos (MARTINS; PRATA-BARBOSA; CUNHA,2020). 
O principal vetor reconhecido para a maioria das arboviroses prevalentes em 
ambientes urbanos é o mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) (SEGURA et al., 
2021). Seu ciclo de vida compreende duas fases, uma aquática, onde três estágios se 
desenvolvem (ovo, larva e pupa), e uma alada, representada pelo mosquito adulto (Figura 1) 
(IWAMURA; HOLST; MURRAY, 2020). Alguns fatores, como o clima (quente e úmido), 
diversidade e disponibilidade de criadouros, urbanização mal planejada, capacidade de 
dispersão do mosquito, mudanças climáticas e falhas nas ações de combate e controle das 
populações, tornam o combate às populações do mosquito vetor um desafio constante 
(LWANDE et al., 2020). 
 
Figura 1 – Ciclo de vida do Aedes aegypti e principais arboviroses transmitidas pela fêmea. 
 
 
Fonte: Modificado de Silvério et al. (2020, p.22). 
 
Estudos de vigilância entomológica conduzidos na região metropolitana de Natal-RN 
(XIMENES et al., 2020; BARBOSA et al., 2017; MEDEIROS et al., 2009), cenário em que 
essa pesquisa se insere, revelaram uma diversidade preocupante de espécies de mosquitos com 
18 
 
 
potencial de transmissão de arbovírus, dentre eles A. aegypti, apresentando alta densidade 
populacional. Adicionalmente, Ximenes et al. (2020) identificaram a ocorrência do arbovírus 
causador da chikungunya em mosquitos fêmeas e machos de Aedes albopictus (Skuse), e 
fêmeas das espécies A. aegypti, Aedes fluviatilis (Lutz) e Wyeomyia bourrouli (Lutz), sugerindo 
que a expansão dos arbovírus está associada à participação de diversas espécies de mosquitos 
nas áreas de transmissão. 
Zara e colaboradores (2016) relatam que as principais estratégias de controle de A. 
aegypti no Brasil consistem no controle mecânico, biológico e químico. O controle mecânico 
se baseia na eliminação dos criadouros e na utilização de barreiras físicas que evitem o contato 
com humanos, como a adoção de telas em portas e janelas. O controle biológico fundamenta-
se na utilização de outros organismos vivos capazes de suprimir o desenvolvimento do inseto 
vetor ou de interferir na sua competência reprodutiva. Esses organismos podem ser animais 
predadores, como peixes e invertebrados, ou patógenos, como bactérias, fungos e protozoários. 
Já o controle químico, compreende o uso de compostos químicos sintéticos capazes de interferir 
na fisiologia do inseto, prejudicando seu desenvolvimento e sua sobrevivência. 
Embora o controle químico represente uma estratégia recorrente de controle do A. 
aegypti no Brasil, há solidificada uma falsa concepção de segurança quanto à sua eficácia 
(ARAÚJO; CARVALHO; CAPURRO, 2021). A grande problemática é o surgimento de 
populações de Aedes resistentes aos inseticidas químicos, facilitado pelo uso intensivo e 
irrestrito desses produtos (SILVA; COSTA; SANTOS, 2020). A resistência aos principais 
inseticidas sintéticos utilizados no manejo populacional de insetos vetores, como o temephos 
(organofosforado) e a deltametrina (piretróide), já foi observada em diferentes populações de 
Aedes no território brasileiro (BELLINATO et al., 2016). Somada à resistência, os inseticidas 
químicos apresentam baixa biodegradabilidade, alta toxicidade a organismos não-alvo e 
biomagnificação, podendo alcançar e afetar uma diversidade de ecossistemas (MAGALHÃES 
et al., 2021; SILVA; COSTA; SANTOS, 2020). 
Nas últimas décadas, o desenvolvimento de métodos alternativos e ecologicamente 
corretos vem sendo incentivado, com o intuito de contribuir para uma maior diversidade de 
ferramentas para o controle de insetos do gênero Aedes (BENELLI; JEFFRIES; WALKER, 
2016). Em revisão recente Sá et al. (2022) discutiu a relevância dos bioinseticidas derivados de 
plantas no manejo integrado de mosquitos dos gêneros Aedes, Anopheles e Culex. Estes, 
apresentam vantagens quando comparados aos compostos sintéticos como: a 
biodegradabilidade, segurança ambiental e baixa ou nenhuma toxicidade a organismos não-
alvos (incluindo insetos polinizadores e animais homeotérmicos). Além disso, as plantas 
19 
 
 
concentram um vasto repertório de moléculas com potencial inseticida, em especial proteínas, 
as quais podem ser empregadas de forma combinada para afetar o desenvolvimento dos insetos 
de maneiras distintas, com baixa ocorrência de episódios de resistência nessas populações (SÁ 
et al., 2022; PAVELA et al., 2019; CASTILLO; STASHENKO; DUQUE, 2017). 
As plantas coevoluíram com os insetos desenvolvendo mecanismos distintos para lidar 
com a herbivoria, partindo de alterações morfológicas para proteção física dos órgãos até um 
arsenal bioquímico de moléculas com atividade inseticida (WAR et al., 2018). Nesse contexto, 
a Caatinga, um bioma de condições edafoclimáticas sazonalmente desfavoráveis (ALVES, 
2007), pode ser uma fonte interessante de moléculas vegetais com atividade inseticida, tendo 
em vista a eficiência das espécies da flora em defender seus recursos nos períodos de seca. 
Além disso, apesar de ter sido negligenciada por décadas, inclusive na esfera científica, a 
Caatinga compreende uma grande e riqueza de espécies vegetais endêmicas que valida tal 
bioprospecção (SANTOS et al., 2011). Atualmente são registradas nas florestas e matas secas 
sazonais da Caatinga brasileira a ocorrência de 3.347 espécies de plantas, agrupadas em 962 
gêneros e 153 famílias de angiospermas, das quais, 526 espécies são endêmicas, ratificando sua 
biodiversidade vegetal ímpar (FERNANDES; CARDOSO; DE QUEIROZ, 2020). 
Pesquisas recentes destacam o potencial inseticida da flora ocorrente nos biomas da 
região Nordeste do Brasil como fonte de moléculas bioativas contra as fases do 
desenvolvimento do A. aegypti, sobretudo na larval (DA SILVA et al., 2022; FELIX et al., 
2021; MARQUES et al., 2021; MOURÃO et al., 2021; DE OLIVEIRA et al., 2019; SILVA et 
al., 2019; PEREIRA et al., 2018; SANTOS et al., 2012). A exemplo disso, Barbosa et al. (2014) 
observou a atividade bioinseticida contra A. aegypti em diversas espécies da flora presentes na 
Caatinga do Rio Grande do Norte. A atividade larvicida é a mais recorrente em estudos deste 
tipo, visto que além de representar uma fase mais vulnerável do ciclo de vida do inseto é ideal 
para ações de controle antropogênico. A eliminação das larvas atua interrompendo o ciclo 
biológico do inseto, fazendo com que este não alcance a fase adulta, responsável pela 
transmissão de arbovírus. 
Nas larvas de A. aegypti, um dos principais alvos dos inseticidas botânicos é o intestino 
médio do inseto, órgão responsável pelo fornecimento de proteínas essenciais à nutrição e 
morfogênese da larva (SÁ et al., 2022). O efeito deletério desses bioinseticidas pode decorrer 
da inibição de proteases intestinais, enzimas que catalisam a clivagem hidrolítica das ligações 
peptídicas de proteínas ingeridas pelo inseto (HABIB; FAZILI, 2007). Essas enzimas são 
essenciais para o processo inicial da decomposição de proteínas derivadas da dieta, 
transformando macromoléculas em porções peptídicas menores que serão novamente 
20 
 
 
degradadas, fornecendo aminoácidos essenciais à fisiologia do inseto (ZHU-SALZMAN; 
ZENG, 2015). A ingestão de inibidores de proteases (IPs) pela larva do mosquito, pode afetar 
a atividade catalítica destas enzimas, impedindo ou minimizando sua atividade proteolítica 
(HABIB; FAZILI, 2007) e comprometendo o desenvolvimento do inseto (DIAS et al., 2017). 
Os IPs vegetais, em especial, são metabólitos primários (proteínas e peptídeos) presentes em 
altas concentrações principalmente em órgãos de armazenamento, como sementes 
(VOLPICELLA et al., 2011), e estão envolvidos em vários processos fisiológicos e 
ontogenéticos da planta, incluindo a defesa contra herbivoria (GROSSE-HOLZ; HOORN, 
2016; VOLPICELLA et al., 2011). A ocorrência desses inibidores é amplamente relatada em 
espécies da família Fabaceae (CLEMENTE et al., 2019), o grupo vegetal investigado nestapesquisa. 
Dentre a vasta diversidade vegetal ocorrente na região Nordeste do Brasil, três espécies 
da família Fabaceae, Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm. (cumaru), Anadenanthera 
colubrina (Vell.) Brenan (angico) e Erythrina velutina Willd. (mulungu) têm despertado o 
interesse de pesquisadores devido ao seu uso na medicina popular para o tratamento de 
inúmeras complicações de saúde (GUARNEIRE et al., 2021; SILVA et al., 2016; SILVEIRA 
et al., 2022). Recentemente, extratos salinos dessas três espécies foram investigados quanto ao 
seu potencial inseticida, sendo confirmado o uso potencial no controle populacional de larvas 
de A. aegypti (BARBOSA et al., 2014). Considerando a bioatividade dessas formulações 
naturais, a necessidade de ofertar novas estratégias ao manejo integrado de insetos vetores e a 
maior facilidade de sistemas de extração aquosos, torna-se interessante a verificação da 
potencialidade do efeito larvicida em extratos aquosos de A. cearensis, A. colubrina e E. 
velutina, além da busca pelo entendimento dos possíveis modos de ação desses extratos frente 
aos processos fisiológicos das larvas de A. aegypti. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
 
2 OBJETIVOS 
 
2.1 Objetivo geral 
 
Investigar em extratos aquosos de Amburana cearensis, Anadenanthera colubrina e 
Erythrina velutina a atividade larvicida contra larvas de Aedes aegypti e a presença de atividade 
inibitória, in vitro, em proteases totais do homogenato intestinal das larvas. 
 
2.2 Objetivos específicos 
 
• Obter e caracterizar extratos aquosos de sementes de A. cearensis, A. colubrina e E. 
velutina quanto ao seu rendimento e teor de proteínas solúveis totais; 
• Examinar a presença de atividade larvicida dos extratos obtidos; 
• Verificar o efeito in vitro dos extratos na atividade proteolítica total do homogenato 
intestinal de larvas de A. aegypti; 
• Detectar, por zimograma, a atividade de proteases intestinais de larvas de A. aegypti e a 
interferência dos extratos no padrão de bandas proteolíticas. 
 
3 MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1. Materiais biológicos 
 
3.1.1 Obtenção das sementes 
 
As sementes de Amburana cearensis (Cumaru - Figura 2A), Anadenanthera colubrina 
(Angico - Figura 2B) e Erythrina velutina (Mulungu - Figura 2C) foram cedidas pelo banco de 
sementes da Floresta Nacional (Flona) de Nísia Floresta, Unidade de Conservação gerida pelo 
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), localizada no município 
de Nísia Floresta (6°04'56.7"S 35°11'08.3"W), estado do Rio Grande do Norte. A utilização 
dos espécimes esteve em conformidade com o Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio 
Genético e do Conhecimento Tradicional Associado, sob registro SisGen n. A3104E7. 
 
 
22 
 
 
Figura 2 – Sementes de Amburana cearensis (Cumaru), Anadenanthera colubrina (Angico) e 
Erythrina velutina (Mulungu) 
 
 
Fonte: Autoria própria (2022). 
 
3.1.2 Obtenção das larvas de Aedes aegypti 
 
As larvas de Aedes aegypti foram provenientes de uma colônia de insetos estabelecida 
no Laboratório de Pesquisa em Entomologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal-RN, Brasil. Os insetos adultos 
foram coletados no Campus Universitário da UFRN e mantidos em gaiolas de criação (30 cm 
x 30 cm) sob temperatura constante de 28 °C, umidade de 50%-70% e fotoperíodo natural; os 
mosquitos, machos e fêmeas foram alimentados com solução açucarada (10%). Para as fêmeas 
realizarem a postura de ovos, foi oferecido um hamster (Mesocricetus auratus) para o repasto 
sanguíneo a cada 48 h. O repasto sanguíneo é necessário para a obtenção de proteínas essenciais 
no desenvolvimento dos ovos. Para a obtenção das larvas, mini ovitrampas foram instaladas no 
interior da gaiola de criação de A. aegypti. As palhetas com ovos foram submersas em solução 
de água e fermento biológico (2,5 mg/L) para eclosão das larvas, tal processo acelera e busca 
padronizar o processo de eclosão e desenvolvimento larval (ANJOLETTE; MACORIS, 2016). 
Em seguida, as larvas foram monitoradas até o desenvolvimento do estádio L4, quando então 
foram utilizadas nos bioensaios e nas dissecações para produção do homogenato intestinal. 
 
3.2 Produção dos extratos 
 
As sementes de A. cearensis, A. colubrina e E. velutina foram trituradas em moinho 
elétrico modelo STAR FT-50 (Fortinox, Brasil) e tamisadas até obtenção de um pó com peneira 
23 
 
 
com trama de 40 mesh. A extração aquosa a quente foi realizada através da homogeneização 
do pó de cada semente em água destilada, na relação de hidromódulo de 1:10 (p/v), mantido 
em banho maria a 80 °C por 3h30. A cada 30 minutos, os extratos foram agitados 
mecanicamente, posteriormente submetidos à centrifugação (10.000 x g, 4 °C, 15 min) 
(Centrífuga modelo 5810R, Eppendorf, Alemanha). Em seguida o sobrenadante foi filtrado em 
papel de filtro quantitativo de poro médio (20-25 µm, Whatman™). Os precipitados foram 
submetidos à reextração sob as mesmas condições. Os precipitados finais foram descartados e 
os sobrenadantes de ambas as extrações foram unidos, armazenados a frio (–20°C) e liofilizados 
(Liofilizador FreeZone 4.5, USA). 
Após as extrações, os três extratos aquosos foram identificados conforme a Tabela 1. 
 
Tabela 1 – Extratos produzidos a partir das sementes de A. cearensis (Cumaru), A. colubrina 
(Angico) e E. velutina (Mulungu). 
Sigla Extrato 
EA Extrato de angico aquoso 
EC Extrato de cumaru aquoso 
EM Extrato de mulungu aquoso 
Fonte: Autoria própria (2022). 
 
3.3 Caracterização inicial dos extratos 
 
3.3.1 Rendimento da extração 
 
O rendimento da massa extraída nas extrações (mg/mL) foi determinado pelo cálculo 
de peso seco (expresso em mg) a partir de volumes conhecidos dos extratos brutos. Em separado 
e em triplicata, um volume padrão (5,0 mL) de extratos foi disposto em tubos de fundo cônico 
tipo Falcon, com peso conhecido, e submetido à liofilização com posterior pesagem. A 
diferença entre os pesos pré e pós liofilização foi calculada, sendo o resultado dividido pelo 
volume inicial da liofilização (5,0 mL), estimando, desse modo, a quantidade de massa extraída 
por mL de solvente. Já o rendimento total (expresso em %), compreendeu a relação da massa 
24 
 
 
total de pó de semente (g) investida na extração e a massa total de cada extrato (g) obtido após 
a liofilização. 
 
3.3.2 Teor de proteínas solúveis totais 
 
 A quantificação de proteínas solúveis totais de cada extrato foi realizada pelo método 
de Bradford (1976), com adaptações para microensaio em placas de 96 poços. A albumina 
sérica bovina (ASB; Sigma-Aldrich, EUA) foi a proteína referência utilizada para obtenção de 
uma curva padrão (0,05 a 0,5 mg/mL). Após o ensaio, realizou-se a leitura em 
espectrofotômetro a 595 nm (Espectrofotômetro Epoch-Biotek, EUA). 
 
3.4 Ensaio biológico larvicida contra Aedes aegypti com extratos das sementes 
 
 Os ensaios larvicidas foram desenvolvidos seguindo diretrizes da Organização Mundial 
da Saúde para larvicidas de origem natural (WHO, 2005). Um total de 20 larvas de A. aegypti 
em 4° ínstar (L4) foi exposto a 10 mL de diferentes concentrações de cada extrato, para 
obtenção das CL50 24 h e 48 h, ou seja, concentrações mínimas capazes de matar 50% das 
larvas após 24 h e 48 h de exposição aos extratos, respectivamente, expressas em mg/mL de 
peso seco. O ensaio foi desenvolvido em quintuplicata (n=5) com controle negativo 
representado pela exposição de larvas apenas à água destilada. As larvas foram monitoradas 
durante 48 h, sendo quantificado o número de larvas mortas a cada 24 h. A morte larval foi 
constatada pela ausência de resposta motora aos estímulos mecânicos empregados contra as 
larvas. 
 
3.5 Investigação dos efeitos na atividade enzimática de proteases do intestino médio de 
larvas de Aedes aegypti pelos extratos de sementes3.5.1 Dissecação de intestinos das larvas de Aedes aegypti e obtenção do homogenato intestinal 
larval (HIL) 
 
 Intestinos íntegros das larvas de A. aegypti foram dissecados adaptando a metodologia 
descrita em Barbosa (2014). Larvas de quarto instar (L4) foram imobilizadas em gelo e 
mantidas em solução Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0. Em seguida, com auxílio de um microscópio 
estereoscópico e bisturi (Lâmina N23, Med Goldman, Brasil), os apêndices terminais e cabeça 
25 
 
 
foram destacados do tórax das larvas para facilitar a remoção do intestino com pinças 
entomológicas. Os intestinos excisados foram transferidos imediatamente para um microtubo 
resfriado contendo uma solução tampão de Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, CaCl2 0,02 M, NaCl 0,15 
M. Foram dissecados 100 intestinos para cada microtubo contendo 500 µL de solução tampão. 
Ao final, o tubo foi armazenado em freezer (-20°C) para posterior produção do homogenato 
intestinal larval (HIL). 
A homogeneização dos intestinos seguiu a metodologia de Almeida Filho e 
colaboradores (2017). Com auxílio de pistilo em polipropileno cônico para microtubos (80 mm 
x 5 mm; Axygen, Brasil), os intestinos armazenados em solução tampão foram macerados em 
banho de gelo e submetido à centrifugação (10.000 x g, 4 °C, 10 min). O sobrenadante foi 
recolhido, identificado como HIL e conservado a -20 °C até sua utilização nos ensaios. 
Alíquotas do HIL (0,5 mL) foram reservadas para dosagem de proteínas solúveis totais 
conforme descrito na seção 3.3.2. 
 
3.5.2 Teste in vitro para detecção de inibição das proteases do HIL pelos extratos 
 
Para verificar a capacidade inibitória dos extratos contra as proteases do HIL de A. 
aegypti, foi empregado o método adotado por Almeida Filho e colaboradores (2017), 
considerando algumas modificações. Inicialmente, 15 µL (equivalente a 24 µg de proteína) de 
HIL foram individualmente incubados, durante 15 min a 37 °C, contendo os extratos 
solubilizados em Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, CaCl2 0,02 M. Em seguida, foram adicionados 100 
µL do substrato azocaseína a 1% (Sigma-Aldrich, Brasil). A reação enzimática foi mantida 
durante 30 min, sendo interrompida pela adição de 150 µL de ácido tricloroacético (TCA) a 
20% (Sigma-Aldrich, Brasil). Os tubos foram centrifugados a 10000 x g a 4 °C, durante 10 min. 
Os sobrenadantes resultantes foram transferidos para uma placa de 96 poços e alcalinizados 
com NaOH 2,0 M na proporção de 1:1 (v/v), com posterior análise espectrofotométrica a 440 
nm (Espectrofotômetro Epoch-Biotek, EUA). 
A atividade proteolítica total do HIL foi utilizada como controle negativo de inibição, 
sendo realizada sob as mesmas condições descritas anteriormente, mas na ausência de extrato, 
de modo que a incubação ocorreu apenas com Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, CaCl2 0,02 M. O 
teste foi realizado em triplicata (n=3) com controles de interferência da cor (do homogenato e 
do extrato) na leitura de absorbância, identificados como “branco” da amostra, em que a 
azocaseína (1%) foi adicionada somente após o TCA (20%). O desenho experimental do teste 
pode ser verificado na Figura 3. 
26 
 
 
 
Figura 3 - Desenho experimental do teste in vitro para detecção de inibição das proteases do 
HIL pelos extratos 
 
Legenda: Cada tubo possui três réplicas (n=3). Os asteriscos (*) destacam a ausência de azocaseína 
(substrato) na respectiva etapa do ensaio para separação dos testes e dos brancos. 
Fonte: Autoria própria (2022). 
 
 
Os resultados das absorbâncias dos testes com os extratos foram tratados para obter 
três tipos de dados: a atividade inibitória percentual (AIP), a unidade inibitória (UI), a atividade 
inibitória específica (AIE) e a atividade residual (AtR), calculadas pelas equações 1, 2, 3 e 4 
respectivamente. A (AIP) corresponde à porcentagem de atividade do HIL reduzida na presença 
do extrato em comparação ao controle negativo. A unidade inibidora (UI) foi definida como a 
quantidade de inibidor capaz de diminuir em 0,01 o valor de absorbância no ensaio. A atividade 
inibitória específica (AIE) representa a relação entre UI e a quantidade de proteína do extrato 
utilizada no ensaio. A AIE é um dado importante para realizar a comparação da atividade 
inibitória dos extratos, uma vez que foram aplicadas quantidades diferentes de proteína para 
cada extrato no teste. A atividade residual (AtR) consiste na atividade proteolítica percentual 
restante do HIL no tratamento com extrato, em comparação à atividade proteolítica total do HIL 
(controle negativo). 
 
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖𝑡ó𝑟𝑖𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑢𝑎𝑙 (%) = 100% − 𝐴𝑡𝑅 (1) 
 
𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝐼𝑛𝑖𝑏𝑖𝑡ó𝑟𝑖𝑎 (𝑈𝐼) = [(𝐴𝑒 − 𝐴𝑏𝑒) − (𝐴𝑎 − 𝐴𝑏𝑎)]/0.01 (2) 
 
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖𝑡ó𝑟𝑖𝑎 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 (𝑈𝐼/𝑚𝑔) = 𝑈𝐼/𝑞𝑝𝑎 (3) 
 
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 (%) = [ (𝐴𝑎 − 𝐴𝑏𝑎) ∗ 100/𝐴𝑒 − 𝐴𝑏𝑒] (4) 
27 
 
 
 
A legenda dos elementos presentes nas equações anteriores está disposta a seguir: Ae 
= Absorbância da atividade proteolítica total do HIL; Abe = Absorbância do branco da atividade 
proteolítica total do HIL; Aa = Absorbância da atividade proteolítica na presença do extrato; 
Aba = Absorbância do branco da atividade proteolítica na presença do extrato; qpa = 
Quantidade de proteína empregada no ensaio. 
 
3.6 Zimograma 
 
Para a construção do zimograma e corrida eletroforética, foi empregada a metodologia 
descrita por Rodrigues e colaboradores (2011). O gel de separação foi produzido na 
concentração de 12% de poliacrilamida em tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8, sendo 
copolimerizado com gelatina suína a 0,1% (Sigma Aldrich). O gel de empilhamento foi 
preparado a 3,5% de poliacrilamida em tampão Tris-HCl 1,0 M, pH 6,8. Nos zimogramas 
produzidos, foram aplicados, em separado, o HIL (equivalente a 20 µg de proteína), os extratos 
(equivalente a 30 µg de proteína), e a combinação de ambos, extrato e HIL. 
Inicialmente, os tratamentos (HIL, extrato e sua associação) foram incubados em 
Tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, CaCl2 0,02 M durante 20 min, a 37 °C, conforme descrito 
por Napoleão e colaboradores (2011). A corrida eletroforética (Eletroforese em gel de 
poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio, SDS-PAGE) foi desenvolvida a 50 V no gel de 
empilhamento e 150 V no gel de separação, sob temperatura de aproximadamente 4 °C. Após 
corrida eletroforética, o gel foi lavado com Triton X-100 (Sigma-Aldrich, EUA) duas vezes, 
durante 30 min em cada lavagem, a 4 °C. Em seguida, o gel foi incubado em tampão Tris-HCl 
0,1 M, pH 7,5, durante 60 min para reativação da atividade proteolítica e digestão do substrato 
gelatina incorporado no gel. Por fim, a coloração foi realizada com uma solução de Coomassie 
Brilliant Blue R-250 (Sigma-Aldrich, EUA), metanol 40% (Merck, Alemanha) e ácido acético 
glacial 10% (Merck, Alemanha). Após 12 h, o gel foi descorado com uma solução de ácido 
acético glacial a 10% (Merck, Alemanha) até visualização das bandas de gelatina hidrolisadas. 
As massas moleculares das proteases foram estimadas comparando com os padrões de massa 
molecular (14,4-97 kDa; Amersham™) de um gel-espelho SDS-PAGE, sem gelatina. 
 
 
 
 
28 
 
 
3.7 Gel-espelho (SDS-PAGE) 
 
A estimativa da massa molecular das proteínas presentes nos géis de eletroforese foi 
realizada por SDS-PAGE, conforme descrito por Laemmli (1970), com algumas modificações. 
O gel de separação foi produzido na concentração de 12% de poliacrilamida em tampão Tris- 
HCl 1,5 M, pH 8,8. O gel de empilhamento foi preparado a 3,5% de poliacrilamida em tampão 
Tris-HCl 1,0 M, pH 6,8. Os compostos (HIL, extrato e sua associação) foram administrados ao 
sistema igualmente ao apresentado no método do zimograma (seção 3.6). Após corrida 
eletroforética, a coloração foi realizada conforme descrito por Neuhoff e colaboradores (1988), 
por uso de uma solução coloidal de Coomassie Brilliant Blue G-250 (Sigma-Aldrich,EUA), 
mantendo a coloração até a visualização adequada das bandas, sendo o excesso de corante 
removido por imersões em água destilada. Os géis foram digitalizados e a estimativa das massas 
moleculares das proteínas foi realizada comparando com a mobilidade eletroforética relativa do 
marcador de massas moleculares entre 14,4 e 97 kDa (Amersham™). 
 
3.8 Análises estatísticas 
 
As análises foram realizadas em replicatas biológicas e experimentais a partir de dados 
reunidos nos ensaios de dosagens (n=3) e ensaios larvicidas (n=5). As concentrações letais 
(CL50) foram calculadas a partir da correlação dose-mortalidade por meio da análise Probit, 
com intervalo de confiança de 95%, usando o software Microsoft Excel 2016.. Para os testes de 
inibição, como os dados apresentaram-se paramétricos e não pareados pelos testes de 
normalidade Shapiro-Wilk e Kolmogorov-Smirnov, foi empregado o teste One-Way ANOVA, 
seguido do teste de múltiplas comparações de Bonferroni para identificar diferenças 
significativas entre os grupos. O nível de significância considerado para as diferenças foi P < 
0,05. As análises foram desenvolvidas no programa GraphPad Prism 9.4.0 (Graphpad Software 
Inc, EUA). 
 
4 RESULTADOS 
 
4.1 Caracterização inicial dos extratos 
 
As concentrações dos extratos brutos, calculadas a partir das medidas de peso seco de 
cada extrato variaram entre 14,53 mg e 34,50 mg, enquanto o rendimento total das extrações 
29 
 
 
variou entre 7,56% e 54,16%, com destaque para o extrato aquoso de angico (EA), que 
apresentou o maior rendimento total (Tabela 2). Os extratos EM e EA se destacaram por 
concentrar (respectivamente, 2,30 mg/mL e 2,02 mg/mL) os maiores teores de proteínas 
solúveis, quando comparados ao EC (1,16 mg/mL). 
 
Tabela 2 - Determinação do peso seco, rendimento total e teor de proteínas solúveis totais dos 
extratos. 
Extrato Peso seco 
(mg)* 
 Rendimento total 
(%) 
Proteínas solúveis 
totais (mg/mL)* 
EA** 34,50 54,16% 2,02 
EC 14,53 7,56% 1,16 
EM 21,93 14,91% 2,30 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Nota: (*) Os dados são apresentados como resultado da média dos valores, com três repetições (n=3). (**) Os 
dados para EA fazem parte da dissertação de mestrado da pesquisadora Leidiane Barbosa, sendo gentilmente 
permitida a referência dos dados gerados em colaboração com este trabalho. (EA) Extrato de angico aquoso; 
(EC) Extrato de cumaru aquoso; (EM) Extrato de mulungu aquoso. 
 
4.2 Ensaios larvicidas de A. aegypti com extratos das sementes 
 
Todos os extratos apresentaram atividade larvicida contra as larvas L4 de A. aegypti, 
conforme observado na Tabela 3, com concentrações letais CL50 de 24 h que variaram entre 
0,28 mg/mL e 1,85 mg/mL, e CL50 48 h entre 0,05 mg/mL e 0,91 mg/mL. Em destaque, o 
extrato EA apresentou a menor CL50 (0,28 mg/mL para 24 h e 0,05 mg/mL para 48 h). Os 
dados derivados da Tabela 3 permitem construir o seguinte ranqueamento dos extratos quanto 
à atividade larvicida mais promissora: EA > EC > EM, correspondendo a uma ordem crescente 
das concentrações letais 50%. 
 
 
 
 
 
 
30 
 
 
Tabela 3 - Concentrações letais encontradas após bioensaios dos extratos com larvas de Aedes 
aegypti 
Extrato CL50 24 h CL50 48 h 
EA* 0,28 0,05 
EC 0,67 0,24 
EM 1,85 0,91 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Nota: Os dados representam a concentração letal, expressa em mg/mL, capaz de matar 50% das larvas (CL50) em 
24 h e 48 h. (EA): Extrato de angico aquoso; (EC): Extrato de cumaru aquoso; (EM): Extrato de mulungu aquoso. 
(*): Os dados para EA fazem parte da dissertação de mestrado da pesquisadora Leidiane Barbosa, sendo 
gentilmente permitida a referência dos dados gerados em colaboração com este trabalho. 
 
4.3 Detecção da atividade inibitória das proteases do homogenato intestinal de larvas de 
A. aegypti pelos extratos 
 
Os descritores de inibição calculados estão compilados na Tabela 4. Os dados de AIP 
e UI destacam o EM com maior atividade inibitória percentual e unidade inibitória 
(AIP=78,73%; UI=23,25) e revelam o seguinte ranking de atividade inibitória entre os extratos 
EM > EC > EA. Enquanto isso, nos dados de AIE o EC se sobressai (AIE=662,65 UI/mg) e 
outro ranking de atividade inibitória é estimado (EC > EM > EA). 
 
Tabela 4 - Inibição da atividade proteolítica do homogenato intestinal de larvas de Aedes 
aegypti pelos extratos 
. 
Descritores de 
inibição 
 Extratos 
EA EC EM 
AIP (%) 42,24 69,02 78,73 
UI 12,52 20,45 23,25 
AIE (UI/mg) 226,20 662,65 496,11 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Nota: Os dados são apresentados como resultado da média dos valores, com três repetições (n=3). (AIP): 
Atividade inibitória percentual, expressa em %; (UI): Unidade inibitória; (AIE): Atividade inibitória específica, 
expressa em UI/mg; (EA): Extrato de angico aquoso; (EC) Extrato de cumaru aquoso; e (EM) Extrato de 
mulungu aquoso. 
31 
 
 
A atividade das proteases do HIL foi reduzida em todos os tratamentos do homogenato 
com os extratos (Figura 4), podendo ser observada a atividade residual do HIL nos tratamentos 
com extratos, em comparação ao controle. Não foram observadas diferenças estatísticas 
significativas (p = 0,068) entre os valores da atividade residual das combinações de HIL com 
EC e com EM. No entanto, consoante ao representado na Figura 5, para os dados de atividade 
inibitória específica a análise estatística revelou valores de AIE significativamente distintos 
entre todos os extratos, com destaque para EC. 
 
Figura 4 – Atividade residual do homogenato intestinal de larvas nos tratamentos com 
extratos de Angico, Cumaru e Mulungu. 
 
 
 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Legenda: Os dados (n=3) são apresentados como média ± desvio padrão. Letras iguais representam atividades 
residuais resultantes sem diferença estatística e letras diferentes representam dados significativamente distintos. 
(HIL): Homogenato intestinal das larvas; (HIL+EA): Associação do HIL com extrato de angico aquoso; 
(HIL+EC): Associação do HIL com extrato de cumaru aquoso; e (HIL+EM): Associação do HIL com extrato de 
mulungu aquoso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
 
Figura 5 – Atividade Inibitória Específica dos extratos de Angico, Cumaru e Mulungu. 
 
 
 
 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Legenda: Os dados (n=3) são apresentados como média ± desvio padrão. Letras iguais representam atividades 
inibitórias específicas resultantes sem diferença estatística e letras diferentes representam dados significativamente 
distintos. (EA): Extrato de angico aquoso; (EC) Extrato de cumaru aquoso; e (EM) Extrato de mulungu aquoso. 
 
4.4 Zimograma: perfil enzimático do homogenato intestinal de larvas e inibição da 
proteólise pelos extratos 
 
A atividade manifestada pelas proteases do HIL no zimograma (Figura 6B) sugere a 
presença de bandas proteicas que variaram em regiões de massa molecular relativa alta (acima 
de 66 kDa), média (entre 45 kDa e 30 kDa) e baixa (abaixo de 30 kDa). Demarcou-se três 
bandas proteicas mais evidentes (setas amarelas), localizadas na região de média massa 
molecular; ao passo que as bandas menos intensas ocorreram abaixo de 30 kDa. O perfil 
enzimático dos zimogramas foi confrontado ao demarcado em Rodrigues et al. (2011) (Figura 
6A). 
 
 
 
 
 
 
33 
 
 
Figura 6 – Perfil enzimático do homogenato intestinal de larvas de Aedes aegypti em 
zimograma 
 
 
 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Legenda: (A): Zimograma das proteases de A. aegypti, de acordo com Rodrigues et al. (2011); (B): Zimograma 
das proteases do HIL de A. aegypti. As setas, em amarelo, destacam as bandas proteolíticas do HIL mais 
proeminentes. 
 
Os zimogramas revelam diferentes perfis de inibição entre os extratos (Figura 7). No 
tratamento do HIL com EA, as bandas proteicas de média massa molecular (próximas a 45 kDa) 
apresentaram-se menos intensas, indicando a inibição da hidróliseda gelatina nessa região 
(Figura 7A). No tratamento com EC, visualiza-se a inibição das bandas proteicas de média 
massa molecular, similar ao tratamento com EA, e de bandas próximas com massa molecular 
abaixo de 30 kDa (Figura 7B). O tratamento com EM ganha destaque pelo amplo espectro de 
inibição entre as bandas proteicas, cujas baixas intensidades das bandas de alta, média e baixa 
massa molecular sugerem a ocorrência de inibição da atividade proteolítica em amplo espectro. 
Em especial, as bandas abaixo de 30 kDa apresentam apagamento indicando alta ação inibitória 
dos extratos nessas entidades moleculares (Figura 7C). 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
 
Figura 7 – Zimogramas dos tratamentos do homogenato intestinal de larvas de Aedes aegypti 
com os extratos de Angico, Cumaru e Mulungu 
 
 
 
 
 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Legenda: Os retângulos em tons de amarelo destacam as principais bandas proteicas inibidas no tratamento do 
HIL (homogenato intestinal de larvas) com os extratos. (EA): Extrato de angico aquoso; (EC) Extrato de cumaru 
aquoso; (EM): Extrato de mulungu aquoso; (HIL+EA): Associação do HIL com extrato de angico aquoso; 
(HIL+EC): Associação do HIL com extrato de cumaru aquoso; e (HIL+EM): Associação do HIL com extrato de 
mulungu aquoso. 
 
4.5 Perfil eletroforético (SDS-PAGE 12%) dos géis-espelho 
 
 Todos os tratamentos (HIL, extratos e sua associação) investigados nos zimogramas 
foram similarmente investigados por técnicas de eletroforese (SDS-PAGE 12%) para 
visualização do perfil proteico. Foi possível observar uma diversidade de bandas proteicas do 
HIL, com massas moleculares entre 13,3 kDa e 108,1 kDa (Figuras 8, 9 e 10). A Figura 8 
destaca a concentração de isoformas de proteínas em EA resistentes à ação proteolítica das 
proteases do HIL, com massas moleculares superiores a 97 kDa. A Figura 9 evidencia um 
arraste de bandas proteicas em EC com massas moleculares entre 13,3 kDa e 44,7 kDa e 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
35 
 
 
concentração próxima ao intervalo de 14,4 kDa. A Figura 10, por sua vez, revela a ocorrência 
de uma banda proteica em EM proeminente, destacada entre o intervalo de massa molecular de 
66 kDa e 45 kDa que, aparentemente, sofre hidrólise em associação com o HIL. Além de bandas 
proteicas intensas, com massas moleculares entre 14,7 kDa e 22,7 kDa. Em geral, nos 
tratamentos dos extratos com o HIL, nota-se o surgimento de novas bandas proteicas e o 
desaparecimento de outras, quando investigados em separado, decorrente da associação ou ação 
das proteases sobre as proteínas vegetais (setas coloridas nas Figuras 8A, 9A e 10A). Um 
detalhamento das massas moleculares estimadas dos extratos e HIL, combinados ou isolados, 
pode ser acompanhado nos apêndices desta obra (Apêndice A). 
Figura 8. Comparação do gel-espelho e zimograma do homogenato intestinal de larvas de 
Aedes aegypti e do extrato de Angico, isolados e combinados 
 
 
 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Legenda: A - Compostos aplicados em SDS-PAGE 12%; B - Compostos aplicados em zimograma. As setas 
brancas apontam bandas do HIL (homogenato intestinal de larvas) que desaparecem no tratamento do HIL 
com EA (extrato de angico aquoso). A seta amarela aponta uma banda do extrato EA não visível, quando 
combinado ao HIL. A seta vermelha indica uma banda inédita formada no tratamento do HIL com EA. (MM): 
Marcador de massa molecular: Fosforilase b, 97 kDa; Albumina, 66 kDa; Ovoalbumina, 45 kDa; Anidrase 
Carbônica, 30 kDa; Inibidor de Tripsina, 20,1 kDa; α-Lactalbumina, 14,4 kDa; e (HIL+EA): Associação do 
HIL com EA. 
, 
 , 
 
, 
 
, 
 
, 
 
, 
 
36 
 
 
Figura 9. Comparação do gel-espelho e zimograma do homogenato intestinal de larvas de 
Aedes aegypti e do extrato de Cumaru, isolados e combinados 
 
 
 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Legenda: A - Compostos aplicados em SDS-PAGE 12%; B - Compostos aplicados em zimograma. A seta 
vermelha indica uma banda inédita formada no tratamento do HIL (homogenato intestinal de larvas) com EC 
(extrato de cumaru aquoso). (MM): Marcador de massa molecular: Fosforilase b, 97 kDa; Albumina, 66 kDa; 
Ovoalbumina, 45 kDa; Anidrase Carbônica, 30 kDa; Inibidor de Tripsina, 20,1 kDa; α-Lactalbumina, 14,4 kDa; e 
(HIL+EC): Associação do HIL com EC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
, 
 
, 
 
, 
 
, 
 
, 
 
, 
 
37 
 
 
Figura 10. Comparação do gel-espelho e zimograma do homogenato intestinal de larvas de 
Aedes aegypti e do extrato de Mulungu, isolados e combinados 
 
 
 
Fonte: Autoria própria (2022). 
Legenda: A - Compostos aplicados em SDS-PAGE 12%; B - Compostos aplicados em zimograma. As setas 
amarelas apontam bandas do EM (extrato de mulungu aquoso) não visíveis quando combinado ao HIL 
(homogenato intestinal de larvas). As setas vermelhas indicam bandas inéditas formadas no tratamento do HIL 
com EM. (MM): Marcador de massa molecular: Fosforilase b, 97 kDa; Albumina, 66 kDa; Ovoalbumina, 45 
kDa; Anidrase Carbônica, 30 kDa; Inibidor de Tripsina, 20,1 kDa; α-Lactalbumina, 14,4 kDa; e (HIL+EM): 
Associação do HIL com EM. 
 
5 DISCUSSÃO 
 
A presente pesquisa identificou a ocorrência de atividade inseticida em larvas (L4) de 
A. aegypti por extratos aquosos de sementes de A. cearensis, E. velutina e A. colubrina, este 
último, configurando-se como os mais promissores, em termos de eficiência de extração e 
atividade inseticida (menor CL50). A análise dos dados sugere o estudo aprofundado dos 
extratos para uso no desenvolvimento de formulações destinadas ao controle de populações de 
A. aegypti. Considerando que as extrações realizadas foram desenvolvidas a quente (80 °C), 
, 
 
, 
 
, 
 
, 
 
, 
 
, 
 
38 
 
 
pode-se inferir que os compostos proteicos são termoresistentes, uma característica importante 
para a estabilidade e continuidade de sua atividade nas aplicações em campo, levando em 
consideração as altas temperaturas alcançadas em regiões tropicais, onde há alta infestação do 
mosquito. A utilização de espécies vegetais ocorrentes na Caatinga na obtenção de inseticidas 
botânicos representa uma estratégia extremamente relevante para o Nordeste brasileiro, que 
compreende uma região hiperendêmica da dengue há mais de 30 anos e representou o epicentro 
da Zika em 2015 (RODRIGUEZ-BARRAQUER et al., 2019). Compreende também uma 
estratégia eficaz para a melhoria na qualidade de vida e renda das comunidades nordestinas, 
através do uso sustentável de espécies endêmicas no desenvolvimento de formulações 
adjuvantes ao manejo integrado de insetos vetores de arboviroses (LUCENA; ARAÚJO; DE 
ALBUQUERQUE, 2007; PHILLIPS; GENTRY, 1993). 
A competência vetorial do A. aegypti associada aos quadros epidemiológicos 
preocupantes das arboviroses demanda esforços para disponibilizar uma diversidade de 
tecnologias que auxiliem o controle populacional do vetor (PEPE et al., 2021). O 
desenvolvimento de produtos inseticidas botânicos, em especial extratos botânicos, vêm se 
tornando uma alternativa de controle populacional promissora, diante das vantagens já 
conhecidas, como a biodegradabilidade, associada ao baixo impacto ambiental, e a 
concentração de uma diversidade de compostos bioativos, conferindo-lhes inúmeros modos de 
ação (SÁ et al., 2022). Extratos botânicos podem ser obtidos por uma variedade de sistemas de 
extração; e os extratos aquosos configuram-se como uma opção encorajadora devido à 
facilidade de sua formulação (PAVELA et al., 2019). Assim, as potencialidades do método de 
extração associadas aos resultados obtidos fortalecem a hipótese de que os extratos aquosos de 
sementes de A. cearensis, E. velutina e A. colubrina são uma estratégia com grande potencial 
ao controle de populações de A. aegypti. 
Uma das fases essenciais para a obtenção de um produto inseticida é a caracterização 
dos seus modos de ação (WHO, 2005). A inibição de proteases intestinais compreende um dos 
possíveis modosde ação dos inseticidas botânicos (SÁ et al., 2022). Nesta pesquisa, foi 
investigada, in vitro, a inibição das proteases intestinais das larvas de A. aegypti pelos extratos 
obtidos, considerando quatro pontos relevantes: (1) a existência de atividade larvicida dos 
extratos; (2) a ocorrência majoritária de proteases serínicas no intestino médio de larvas de A. 
aegypti (RODRIGUES et al., 2011); (3) a composição de 1 a 10% das proteínas totais de órgãos 
de armazenamento, como as sementes, ser representada por inibidores de proteases serínicas 
(IPS) (CLEMENTE et al., 2019); e (4) o fato de a maioria dos IPS ocorrer em fabáceas 
(CLEMENTE et al., 2019). 
39 
 
 
Na análise quantitativa da inibição in vitro, devido à administração de massas (mg) 
diferentes de proteínas de cada extrato no ensaio, os valores de AIE foram considerados mais 
apropriados para realizar a comparação da capacidade inibitória entre os extratos, uma vez que 
o cálculo equaliza os valores de inibição em relação a massa de proteína do extrato aplicado no 
teste. Na análise qualitativa, as proteases intestinais das larvas de A. aegypti apresentaram um 
perfil de atividade proteolítica em zimograma visível (Figura 6) semelhante ao encontrado por 
Rodrigues et al. (2011), o que confirma a reprodutibilidade do método para análise qualitativa 
em zimograma das proteases de A. aegypti. O tempo de incubação do HIL com os extratos foi 
semelhante ao descrito por Napoleão et al. (2011) (20 min), caracterizado como suficiente para 
induzir a formação dos complexos enzima-inibidor. 
A extração aquosa de A. colubrina (EA) foi capaz de solubilizar os IPS de suas 
sementes, consoante à inibição in vitro apresentada para o HIL em termos quantitativos (AIE = 
226,20 UI/mg, Tabela 4) e qualitativos (Figura 8B). Lima; Sartori; Rodrigues (2016) 
registraram a ocorrência de inibidores de tripsina em extratos de sementes de A. colubrina com 
massas moleculares entre 18 kDa e 24 kDa, similares às observadas nesta pesquisa (Figura 8A), 
indicando que possivelmente, tais inibidores podem ser solubilizados em EA. Além destes, 
outras classes de proteína compõem o “pool” proteico do extrato. França e colaboradores (2021) 
demarcaram a ocorrência de isoformas de vicilina com atividade pesticida contra 
Callosobruchus maculatus em um intervalo de massa molecular superior a 97 kDa, semelhante 
a banda proteica proeminente em EA (Figura 8A), a qual se apresentou resistente a atividade 
proteolítica do HIL. Apesar de EA ter apresentado os valores de CL50 mais eficazes (Tabela 
3), sua AIE foi a menor dentre os extratos (Tabela 4), o que pode indicar uma contribuição 
parcial ou baixa para este modo de ação na compreensão da atividade larvicida do extrato, 
estando provavelmente outras classes de moléculas além dos inibidores de proteases implicadas 
na atividade. 
Em relação ao extrato aquoso de A. cearensis (EC), a AIE (662,65 UI/mg) se 
sobressaiu entre as observadas para os demais extratos (Tabela 4), indicando a possibilidade de 
a inibição das proteases contribuir em maior grau na atividade larvicida do extrato contra larvas 
de A. aegypti. Desse modo, apesar das condições de extração terem concentrado os menores 
teores de proteínas solúveis (Tabela 2), EC foi considerado o extrato com probabilidade de 
possuir maior concentração de IPS solúveis em sistemas de extração aquosa. O zimograma de 
EC (Figura 9B) também revelou a inibição das proteases do HIL, devido a redução da nitidez 
das bandas proteicas com massas moleculares inferiores a 45 kDa, principalmente as inferiores 
a 30 kDa. Farias et al. (2010) também detectaram inibição da atividade de proteases por extratos 
40 
 
 
aquosos de semente de A. cearensis, atribuindo a ação à presença de um inibidor de tripsina, 
com massa molecular equivalente a 13,6 kDa, previamente descrito por Tanaka et al. (1997). É 
provável que as condições de extração de EC também tenham contribuído para a solubilização 
desse inibidor, uma vez que nos géis eletroforéticos (Figura 9A) é registrada um arraste de 
bandas proteicas com migração até o intervalo de massa molecular de 13,3 kDa. 
A alta AIE (496,11 UI/mg; Tabela 4) do extrato de E. velutina (EM) também sugere 
uma contribuição significativa da inibição de proteases intestinais como componente no modo 
de ação na atividade larvicida do extrato. O zimograma (Figura 7C) revelou que o extrato EM 
solubilizou IPS capazes de inibir uma maior diversidade de bandas proteolíticas do HIL. 
Machado et al. (2013) e Lima et al. (2017) purificaram inibidores de tripsina das sementes de 
E. velutina com massas moleculares entre 19 kDa e 20 kDa. Esses inibidores não somente 
podem ter ocorrido em EM como também podem igualmente contribuir com a inibição das 
proteases do HIL, pois as eletroforeses do extrato (Figura 10A) revelam a ocorrência de 
agregados proteicos com massas moleculares próximas a 20 kDa. 
Torna-se importante destacar que as relações discutidas nesta pesquisa entre a 
atividade inibitória dos extratos contra HIL e a atividade larvicida não são conclusivas, uma 
vez que a investigação desenvolvida aborda testes in vitro. No entanto, espera-se que tais 
hipóteses sejam confirmadas com testes in vivo, realizados a partir da coleta dos intestinos das 
larvas após tratamento com os extratos. A investigação de outros modos de ação também deve 
ser considerada, tais como: a análise do comprometimento do desenvolvimento do inseto pela 
presença de proteínas de ligação à quitina; a realização de ensaios enzimáticos com mediadores 
de neurotransmissão dos insetos; e ensaios de avaliação da resistência da matriz peritrófica das 
larvas pela interação com extratos. A realização desses ensaios auxiliará na melhor 
compreensão de como o extrato age na larva, podendo haver uma contribuição majoritária de 
um modo de ação, ou ocorrência de eventos que contribuem de forma simultânea e sinérgica se 
somando para conferir a atividade larvicida. 
Os achados desta pesquisa contribuem para o surgimento de mais perguntas: Quais 
seriam as classes dos inibidores de proteases presentes nos extratos? Os homogenatos 
intestinais obtidos das larvas expostas aos extratos apresentam o mesmo padrão de atividade 
proteolítica em zimograma? O padrão de expressão de proteases pode mudar após exposição 
das larvas aos extratos? Quais outras moléculas e modos de ação podem estar contribuindo com 
a atividade larvicida dos extratos? Essas e outras perguntas deverão ser respondidas 
posteriormente em novos estudos, de modo a ampliar a compreensão de como os extratos 
41 
 
 
botânicos com ação larvicida funcionam, além de avançar uma etapa importante e necessária 
para viabilizar sua utilização em formulações derivadas no controle do A. aegypti. 
 
 
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
Os sistemas de extração aquosa a quente das sementes de A. cearensis (EC), A. 
colubrina (EA) e E. velutina (EM) foram eficazes quanto ao rendimento, concentração de 
proteínas solúveis e potencialidade para o comprometimento da sobrevivência das larvas (L4) 
de A. aegypti, com ênfase para o extrato EA, que apresentou as concentrações letais (CL50) 
menores, sendo o mais promissor. O sistema de extração empregado foi eficaz para 
solubilização de moléculas termorresistentes até 80 °C com atividade inibitória para proteases. 
Os extratos manifestaram diferentes índices de inibição da atividade enzimática das proteases 
do homogenato intestinal de larvas de A. aegypti, com destaque para o extrato EC, o qual 
apresentou a maior atividade inibitória específica. A análise dos resultados sugere uma 
contribuição da inibição proteolítica no modo de ação dos extratos inseticidas investigados 
nesta pesquisa, principalmente para os extratos aquosos das sementes de A. cearensis e E. 
velutina. 
 
 
 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
42 
 
 
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