Modelagemmolecularbiodegradacao-Gomes-2022

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE – UFRN
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA
MOLECULAR
HELOISA SILVA SARAIVA GOMES
MODELAGEM MOLECULAR DA BIODEGRADAÇÃO DO CORANTE VERMELHO
CONGO POR LACASES
NATAL
2022
HELOÍSA SILVA SARAIVA GOMES
MODELAGEM MOLECULAR DA BIODEGRADAÇÃO DO CORANTE VERMELHO
CONGO POR LACASES
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Bioquímica e
Biologia Molecular da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como
requisito para obtenção de título de
Mestre em Bioquímica e Biologia
Molecular.
Orientador: Prof. Dr. Jonas Ivan Nobre
Oliveira
Coorientador: Prof. Dr. Umberto Laino
Fulco
Aprovada em: 27/07/2022
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Cláudio Bruno Silva de Oliveira
Examinador Externo à Instituição – UNINASSAU
Prof. Dr. Edilson Dantas da Silva Júnior
Examinador Interno ao Programa – UFRN
Prof. Dr. Jonas Ivan Nobre de Oliveira
Orientador/Presidente – UFRN
FICHA DE AVALIAÇÃO Nº 9/2022 - BIOQ (17.32)
Visualize o documento original em https://sipac.ufrn.br/documentos/ informando seu número: 9, ano: 2022, tipo:
FICHA DE AVALIAÇÃO, data de emissão: 27/07/2022 e o código de verificação: 30baf4e290
NATAL
2022
https://sipac.ufrn.br/public/jsp/autenticidade/form.jsf
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Saraiva Gomes, Heloísa Silva.
Modelagem molecular da biodegradação do corante vermelho congo por
lacases / Heloísa Silva Saraiva Gomes. - 2022. 61 f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro
de Biociências, Pós Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular, Natal, RN,
2022.
Orientador: Prof. Dr. Jonas Ivan Nobre Oliveira.
Coorientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco.
1. Interações intermoleculares - Dissertação. 2.
Biorremediação - Dissertação. 3. MFCC/DFT - Dissertação. 4. Rante
vermelho Congo - Dissertação. 5. Lacase de Pycnoporus Sanguineus -
Dissertação. 6. Lacase de Tratametes
Dissertaçãoersicolor - Dissertação. I. Oliveira, Jonas Ivan Nobre. II. Fulco,
Umberto Laino. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 539.196
Elaborado por Fernanda de Medeiros Ferreira Aquino - CRB-15/301
Agradecimentos
Agradeço primeiramente aos seres superiores que me permitiram aqui estar nesse
momento. Agradeço ao professor Jonas Ivan Nobre de Oliveira, em ter aceitado o
desafio de me orientar, e agradeço também pela paciência e empatia que comigo
teve, agradeço ao amigo Daniel Melo de Oliveira Campos por todo o auxílio,
paciência, empatia e coleguismo que teve para com minha pessoa. A amiga e colega
Karol, por também me ajudar e incentivar. Agradeço de coração ao Professor
Umberto Fulco, por toda a atenção e presteza, ao professor Edilson Dantas da Silva
Júnior pelas aulas fantásticas nas quais tive a honra de ser aluna, ao Professor
Gilberto Corso pelas excelentes aulas de estatística, Ao Professor Eudenilson Lins
de Albuquerque por mostrar o caminho da física quântica, obrigada a Professora
Kesia Karina de oliveira Souto Silva, do departamento de Engenharia Têxtil, por toda
a empatia, ensinamento e atenção que comigo teve no estágio à docência. Meu
agradecimento à professora Zulmara Virgínia de Carvalho do departamento de
Ciências e Tecnologia pelas aulas maravilhosas em tecnologia da informação, que
abriram meus olhos para o mundo da biotecnologia. Grande professora, mente
brilhante, aulas fantásticas! Agradeço a todos os demais professores que fizeram
parte desse ciclo, e que apesar de não termos nos conhecido pessoalmente, dedico
todo meu carinho a cada docente que teve o cuidado de repassar essa dádiva, que é
o conhecimento. Quero deixar claro o quanto vocês são importantes, o quanto o
trabalho de vocês é lindo, toda a minha gratidão, de coração, a cada um de vocês!
Agradeço ao meu querido companheiro de altos e baixos, Stênio Medeiros, por todo
o incentivo desde o início, sem você eu jamais estaria aqui nesse momento,
escrevendo sequer essa dissertação, obrigada pela vida, por me dar forças para ir
fazer a prova de inscrição do mestrado. Porque naquele momento eu não acreditava
mais em mim, talvez eu não estivesse nem viva, e foi você que disse: você vai fazer
a prova. Passei, mesmo sendo de uma área completamente diferente da minha
graduação e aqui estou eu, concluindo depois de tantas etapas percorridas.
Obrigada a Capes pelo incentivo financeiro à essa pesquisa.
Obrigada mais uma vez à todos que fizeram parte dessa jornada e agradecer ao
próprio mestrado que foi o que me fez manter de pé durante todo esse período
turbulento de pandemia do Covid-19. Sabemos de todas as dificuldades que cada
um de nós enfrentamos, cada batalha diária, e em meio a todas as turbulências que
passei, talvez sequer estivesse viva, sobrevivi a todo o caos e aqui concluo mais
essa etapa da minha vida, agradeço a minha família, minha mãe Débora, Meu pai
Gilberto, por sempre acreditar em mim e sempre dizer: filha você consegue!
Agradeço a minha tia Noêmia, que é mais minha mãe do que tia, agradeço a minha
tia Nelma e Laércio, por todo o apoio no início do mestrado. Agradeço a minha avó
Silvia que foi a pessoa que mais incentivou minha educação desde o princípio,
dedico este momento à senhora, te amo vovó! Dedico também àqueles que já não
estão no estado físico da matéria, mas que estão presentes em todos os momentos
da minha vida. Em especial meu avô Felizberto, minha tia avó Severina, uma das
pessoas que mais amei e amo, obrigada por tudo aonde quer que estejam! Amo
todos vocês! Gratidão a todos!
Resumo
O aumento global da urbanização e da atividade industrial levou à produção e
incorporação de moléculas contaminantes aos ecossistemas. Em especial, a
poluição dos corpos hídricos por efluentes sem tratamento prévio causa inúmeros
danos às espécies que vivem em ambientes aquáticos. Processos biotecnológicos e
estratégias físicas, químicas e biológicas têm sido adotadas para eliminar esses
contaminantes dos corpos d'água sob estresse antropogênico. Na perspectiva da
biorremediação, as lacases são enzimas capazes de degradar compostos fenólicos,
aromáticos e não aromáticos, inclusive corantes sintéticos produzidos no âmbito da
indústria têxtil. Nesse contexto, o presente trabalho se propõe a analisar
qualitativamente (tipo de ligação química), quantitativamente (energia de interação) e
de forma comparada os contatos intermoleculares do corante vermelho Congo
acoplado às lacases de Tratametes versicolor (CR-LacTv) e Pycnoporus sanguineus
(CR-LacPs), inclusive identificando padrões de interação. Para a descrição das
energias de ligação individuais do tipo ligante-receptor existentes nesses
biocomplexos, utilizamos o esquema de fracionamento molecular com capas
conjugadas (MFCC) no escopo da Teoria do Funcional da Densidade (DFT). Os
resultados apontam para uma maior afinidade do corante vermelho Congo com a
lacase de Pycnoporus sanguineus. No caso, o corante interage com LacPs (LacTv)
com uma energia de ligação de -38,26 kcal/mol (-19,26 kcal/mol), com 63,3% (63,6%)
dos contatos intermoleculares com os aminoácidos do receptor ocorrendo a partir da
região iii (i) desse ligante. Os principais resíduos do complexo CR-LacPs (CR-LacTv)
são a ARG161, PHE162, GLY392, GNL160, SER393, PRO391, PHE265 e GLY266
(PHE162, ALA161, GLY266, ALA393, PHE 265, PRO391, PRO160, GLY392), nos
quais destacamos a existência de seis (cinco) importantes ligações de hidrogênio e
dois (três) contatos hidrofóbicos em CR-LACPs (LacTv). A descrição estrutural e
energética das interações dos biocomplexos em questão auxilia no entendimento das
diferenças em termos de estabilidade e eficácia de enzimas da mesma família,
porém organismos distintos. Consequentemente, possibilitará estudos de aumento
da efetividade da biorremediação promovida por tais enzimas após alterações
pontuais dirigidas.
Palavras-chave: Biorremediação. MFCC. DFT. Interações intermoleculares. Corante
vermelho Congo.Lacase de Pycnoporus sanguineus. Lacase de Tratametes
versicolor.
Abstract
The worldwide increase in urbanization and industrial activities has led to the
production and introduction of contaminating molecules into ecosystems. Pollution of
water bodies by untreated sewage causes numerous damages to species living in
the aquatic environment. Biotechnological processes and physical, chemical, and
biological strategies have been developed to remove these contaminants from
anthropogenically polluted waters. From the perspective of bioremediation, lacases
are enzymes capable of degrading phenolic, aromatic, and non-aromatic compounds,
including synthetic dyes from the textile industry. In this context, the present work
proposes to analyze the intermolecular contacts of Congo red dye coupled to lacases
from Tratametes versicolor (CR -LacTv) and Pycnoporus sanguineus (CR -LacPs)
qualitatively (type of chemical bonding), quantitatively (interaction energy), and
comparatively, including the identification of interaction patterns. To describe the
individual ligand-receptor type binding energies present in these biocomplexes, we
used the molecular fractionation scheme with conjugated caps (MFCC) in the
framework of density functional theory (DFT). The results indicate a higher affinity of
the Congo red dye for the lacase of Pycnoporus sanguineus. In this case, the dye
interacts with LacPs (LacTv) with a binding energy of -38.26 kcal/mol (-19.26
kcal/mol), with 63.3% (63.6%) of the intermolecular contacts occurring with the amino
acids of the receptor from the iii (i) region of this ligand. The major residues of the CR
-LacPs (CR -LacTv) complex are ARG161, PHE162, GLY392, GNL160, SER393,
PRO391, PHE265, and GLY266 (PHE162, ALA161, GLY266, ALA393, PHE 265,
PRO391, PRO160, GLY392), in which we highlight the existence of six (five) large
hydrogen bonds and two (three) hydrophobic contacts in CR -LACPs (LacTv). The
structural and energetic description of the interactions of the biocomplexes in
question helps to understand the differences in terms of stability and efficacy of
enzymes of the same family but different organisms. Consequently, it will allow
studies to increase the effectiveness of bioremediation promoted by such enzymes
following targeted point changes.
Keywords: Bioremediation. MFCC. DFT. Intermolecular interactions. Congo red dye.
Lacase from Pycnoporus sanguineus. Lacase from Tratametes versicolor.
Lista de Abreviaturas e Siglas
ALA - Alanina
ARG - Arginina
ASN - Asparagina
ASP - Asparatato
GLY - Glicina
GLX - Glutamina
GNL - Glutamina
HIS - Histidina
PHE - Fenilalanina
PRO - Prolina
SER - Serina
LEU - Leucina
THR - Treonina
MET - Metionina
TRP - Triptofano
VAL - Valina
CIS - Cisteína
ILE- Isoleucina
TYR - Tirosina
LYS - Lisina
VAL - Valina
CR - Congo Red (corante vermelho Congo)
LacTV - Lacase de Trametes versicolor
LacPs - Lacase de Pycnoporus Sanguineus
Kcal/mol – Quilocaloria por mol
MFCC – Molecular Fractionation with Conjugated Caps (Fracionamento Molecular
com Caps Conjugados)
PDB – Protein Data Bank (Banco de Dados de Proteínas)
DFT – Density Functional Theory (Teoria do Funcional da Densidade)
Kda - Quilodaltons
Eº - Potêncial Redox
ETE - Estação de Tratamento de Efluentes
Lista de Ilustrações
Figura 1 - Estrutura 3D da molécula do corante Vermelho Congo. ......................................... 8
Figura 2 - Ilustração representativa do perfil das interações intramoleculares dos átomos de
cobre da enzima Lacase. ......................................................................................................... 12
Figura 3 - Estrutura tridimensional da Lacase de Pycnoporus sanguineus co-cristalizada
com o corante vermelho Congo (em laranja) (PDB ID: 5NQ7). ..............................................23
Figura 4 - Estrutura tridimensional da Lacase de Trametes versicolor co-cristalizada com o
corante vermelho Congo (em laranja) (PDB ID: 1KYA). ......................................................... 23
Figura 5 - Análise da conformação espacial (E1-E13) predominante em cada pH (1-14), com
destaque à representação esquemática da conformação mais abundante do corante
vermelho Congo em pH 7,2. .................................................................................................... 29
Gráfico 1 - Energia de interação total (em kcal/mol) do corante vermelho Congo com a
lacase de Trametes versicolor (CR-LacTv, em rosa) e de Pycnoporus sanguineus (CR-
LacPs, em laranja) em função do raio do bolso de ligação r (em Å). Resultados foram
obtidos utilizando o funcional GGA B97D e constante dielétrica de 40 no esquema MFCC. 31
Gráfico 2 - Painel gráfico destacando, em ordem crescente de distância (Å), os resíduos
mais relevantes que contribuem para os complexos formados pelo corante vermelho Congo
e a lacase de Trametes versicolor (CR-LacTv, em pink) e de Pycnoporus sanguineus (CR-
LacPs, em laranja). A região e os átomos do ligante interagindo com cada aminoácido estão
destacados. A marcação ‘*’ indica que a interação está presente somente em CR-LacPs ...34
Fonte: Autoria Própria. ............................................................................................................. 34
Figura 6 - Visão detalhada dos resíduos mais importantes envolvidos na ligação do corante
vermelho Congo com a lacase de Trametes versicolor (Pycnoporus sanguineus) em rosa
(laranja). ....................................................................................................................................35
Figura 8 - Visão detalhada, incluindo a distância dos contatos intermoleculares mais
importantes da região i (i e iii) do corante vermelho Congo no complexo CR-LacTv (CR-
LacPs) em rosa (laranja). As linhas pontilhadas indicam a categoria de interação
intermolecular conforme legendado. ........................................................................................40
Figura 9 - Visão detalhada, incluindo a distância dos contatos intermoleculares mais
importantes da região ii e iii (ii) do corante vermelho Congo no complexo CR-LacTv (CR-
LacPs) em rosa (laranja). As linhas pontilhadas indicam a categoria de interação
intermolecular conforme legendado. ........................................................................................41
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................................ 1
1.1 Efluentes industriais têxteis .........................................................................................2
1.2 Impactos ambientais causados pelos efluentes têxteis ..............................................4
1.3 Corantes AZO...................................................................................................................5
1.4 Corante vermelho Congo ............................................................................................ 7
1.5 Biotecnologia e biorremediação ..................................................................................8
1.6 Lacases ......................................................................................................................10
1.7 Decomposição do corante vermelho Congo por lacases dos fungos filamentosos
Pycnoporus sanguineus e Trametes versicolor ...................................................................14
1.8 Modelagem molecular .................................................................................................... 16
2 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................... 18
3 OBJETIVOS.......................................................................................................................... 20
3.1 Objetivos gerais ..............................................................................................................20
3.2 Objetivos específicos ......................................................................................................204 METODOLOGIA....................................................................................................................21
4.1 Construção dos complexos CR-LacTv e CR-LacPs ......................................................21
4.3 Otimização geométrica por QM/MM.............................................................................. 24
4.4 Cálculo das interações intermoleculares ....................................................................... 24
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................................27
5.1 Estado de protonação .................................................................................................... 29
5.2 Análise de convergência ................................................................................................ 30
5.3 Perfil de interação do corante vermelho Congo nos complexos CR-LacTv e CRLacPs
.............................................................................................................................................. 33
6 CONCLUSÕES..................................................................................................................... 42
7 PERSPECTIVAS...................................................................................................................44
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................45
1
1 INTRODUÇÃO
Na atualidade um grande desafio para a ciência é mitigar os efeitos antrópicos
decorrentes do aumento demográfico e do consumo de produtos industrializados que
elevam a emissão de poluentes em escala global (ARREGUI, 2019). Dentre esses
poluentes emitidos, os efluentes necessitam de uma delicada atenção da
comunidade científica, tendo como ponto de partida a preocupação com os aquíferos
subterrâneos e corpos d'água em superfície, assim como bacias hidrográficas, mares
e oceanos, que são intrínsecos, e seus ecossistemas interligados (RIBEIRO, 2012).
O tipo de efluente industrial varia de acordo com o nicho de mercado dessas
indústrias. Por exemplo, temos os efluentes orgânicos, os quais são emitidos pela
indústria de celulose, biocombustíveis, alimentícia, entre outras. Já no caso da
indústria têxtil, os insumos têm comumente natureza sintética; e justamente por não
possuírem características orgânicas, originam dejetos de difícil decomposição, como
é o caso dos corantes de tecidos (COGO, 2011). Somado a isso, o elevado grau de
salinidade e baixo teor de oxigênio desses efluentes tóxicos são fatores limítrofes
para determinadas espécies que poderiam degradar naturalmente esses substratos
(ZABOTTO, 2019).
Porém, com o avanço de estudos na área da biotecnologia, hoje há uma
esperança no tocante a decomposição biológica de muitos tipos de substratos que
antes seriam inimaginavelmente decompostos por até mesmo uma avançada
tecnologia de estação de tratamentos de efluentes (ARREGUI, 2019).
Ao longo do tempo foi observado que determinados fungos de podridão
branca e negra agiam na decomposição de alguns substratos mais complexos, como
por exemplo os compostos fenólicos e aromáticos (BARRETO, 2006). Muitos desses,
sintetizam enzimas com a função natural de biodegradar a lignina, um biopolímero
que dá sustentação às plantas e protege contra patógenos. Esta enzima em comum
pertence à família das lacases, presente em diversas espécies, como fungos,
bactérias, plantas e insetos. Essa enzima vem trazendo várias respostas positivas
em diversos estudos realizados com uma inúmera quantidade de substratos,
trazendo uma esperança para a comunidade científica e para o meio ambiente,
tornando resíduos que antes não possuiam tratamento, em resíduos biodegradáveis
(ARREGUI, 2019).
2
Neste trabalho, diferentes ferramentas computacionais, especificamente da
modelagem molecular, serão utilizadas para o acoplamento de um corante de difícil
biodegradação (corante vermelho Congo) em duas lacases fúngicas (Pycnoporus
sanguineus e Trametes versicolor). Então, os principais contatos intermoleculares
serão descritos em termos qualitativos (natureza da ligação química) e quantitativos
(energia de interação). Assim, percebe-se que este será um estudo pioneiro, no
tocante às interações de um composto sintético com enzimas durante um processo
de biorremediação.
1.1 Efluentes industriais têxteis
A água possui um valor imensurável para a vida no planeta terra, porém esse
recurso sofre um processo de escassez devido ao desmatamento e a maior parte
dos corpos hídricos serem contaminados por poluentes provenientes da indústria em
geral. Os efluentes industriais se caracterizam como uma das principais fontes
advindas, ocasionando uma série de impactos ambientais que muitas vezes atingem
toda uma bacia hidrográfica, além de ambientes lênticos, lóticos, lacustres e
marinhos, em que toda a biota a que pertencem esses hábitats sofrem prejuízos,
ocorrendo um grave dano ambiental que é o processo de eutrofização (CUNHA &
AUGUSTIN, 2014).
A indústria têxtil é uma das que mais se beneficiam do uso da água, com seu
alto consumo sendo consequentemente uma grande poluidora desse recurso. Esses
efluentes têxteis são provenientes das etapas de limpeza, tingimento e acabamento,
e sua complexidade se dá principalmente pelos corantes, surfactantes e aditivos, que
possuem grande complexidade em suas estruturas químicas, além das elevadas
concentrações (ZANONI & YAMANAKA, 2016).
No Brasil, muitos efluentes industriais são despejados com pouco ou nenhum
tratamento prévio, o que é proibido por lei de acordo com o CONAMA 430/201:
“Os efluentes de qualquer fonte poluidora somente poderão ser
lançados diretamente no corpo receptor desde que obedeçam as
condições e padrões previstos em lei, resguardadas outras
exigências cabíveis:
I – condições de lançamento de efluentes:
a) pH entre 5 a 9;
3
b) temperatura: inferior a 40°C, sendo que a variação de
temperatura do corpo receptor não deverá exceder a 3°C no limite
da zona de mistura;
c) materiais sedimentáveis: até 1 mL/L Para o lançamento em
lagos e lagoas, cuja velocidade de circulação seja praticamente
nula, os materiais sedimentáveis deverão estar virtualmente
ausentes;
d) regime de lançamento com vazão máxima de até 1,5 vez a
vazão média do período de atividade diária do agente poluidor,
exceto nos casos permitidos pela autoridade competente;
e) óleos e graxas: 1. óleos minerais: até 20 mg/L; 2. óleos vegetais
e gorduras animais: até 50 mg/L;
f) ausência de materiais flutuantes; e
g) Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO 5 dias a 20°C):
remoção mínima de 60% de DBO sendo que este limite só poderá
ser reduzido no caso de existência de estudo de autodepuração
do corpo hídrico que comprove atendimento às metas do
enquadramento do corpo receptor;”
É importante que essas indústrias possuam estações de tratamento de
efluentes ou transportem seus efluentes para onde exista uma ETE (Estação de
Tratamento de Efluentes) que garanta o que está previsto em lei. Porém muitos
efluentes provenientes de alguns setores específicos, como o setor têxtil e
petroquímico, possuem substratos que mesmo passando por tratamentos adequados,
ainda contém compostos que não conseguem ser degradados, por exemplo, alguns
tipos de corantes têxteis e alguns resíduos petroquímicos, devido à alta
complexidade de alguns desses elementos contidos nos efluentes provenientes
desses setores (DIAZ, 2007).
A indústria têxtil é a segunda maior poluidora, atrás apenas da indústria
petroquímica, descartando variados tipos de materiais que em sua maioria não são
biodegradáveis, ocasionando graves impactos ambientais (AZEVEDO, 2010). Além
da inúmera quantidade de materiais têxteis, existe uma quantidade significativa de
corantes utilizados nesta indústria para o tingimento de fibras e tecidos e que uma
alta porcentagem desses corantes possuem metais pesados. Além da alta
concentraçãode águas tingidas, despejadas em ambientes aquáticos, podendo
4
ocorrer também a contaminação dos solos, além da morte de inúmeras espécies da
fauna e flora, de vários tipos de ambientes distintos. Os efluentes têxteis possuem
uma grande variedade de complexas composições, e cada vez mais são criadas
fórmulas sintéticas que não necessariamente são biodegradáveis. O que ao longo do
tempo pode ocasionar graves prejuízos à natureza e às futuras gerações da vida
humana. (ZANONI & YAMANAKA, 2016).
A grande problemática atual da indústria têxtil é a degradação de corantes
sintéticos, que devido a sua complexidade, há poucos recursos capazes de degradá-
los, pois até mesmo tratamentos físicos e químicos avançados, se tornam ineficazes,
ainda deixando resíduos tóxicos. No entanto, com o avanço da biotecnologia,
atualmente estão sendo estudados métodos naturais de se degradarem esses
compostos da forma mais natural possível. Em alguns processos de descoloração
enzimática, é possível descolorir quase 100%, em determinados corantes
(BELTRAME et al., 2000).
1.2 Impactos ambientais causados pelos efluentes têxteis
Na atualidade existe uma gama de fatores que convergem para uma única
problemática: a escassez dos recursos naturais. Um fator importante nesse contexto
é o aumento demográfico, o qual contribui para um elevado nível de consumo e
consequentemente há uma maior demanda por produtos e a indústria necessita
atender um número de consumidores cada vez maior, tanto por esse fator, como
pela questão da lucratividade (CÂNDIDO & LIRA, 2013).
A indústria têxtil, move grande parte da economia mundial, e por sua vez, é a
que necessita de um maior consumo de água, para suas funções, o que gera uma
grande quantidade de efluentes. Sendo então, a indústria têxtil, a maior poluidora de
recursos hídricos, se utilizando de mais de 10.000 tipos de corantes anualmente, que
são produzidos cerca de 7x105 toneladas por ano, sendo que deste total 1/10 é
rejeitado de forma indevida no meio ambiente, alterando temperatura, pH da água,
luminosidade dos corpos hídricos (BA & VINOTH KUMAR, 2017).
Os efluentes têxteis são em sua maioria altamente tóxicos e muitos não são
biodegradáveis. Atualmente a grande problemática é a contaminação de corpos
hídricos, solos, e principalmente espécies da fauna e flora, assim como também a
espécie humana. Os efluentes têxteis podem causar sérios danos à saúde humana,
5
como o câncer, por exemplo, já que alguns compostos descartados por essa
indústria, são carcinogênicos (ZANONI & YAMANAKA, 2016).
Para os ambientes aquáticos o que ocorre é que além de algumas
substâncias conterem metais pesados, ainda tem o agravante da coloração, que
bloqueia a passagem da luz solar para o fundo desses corpos hídricos ocasionando
a morte de toda biota por eutrofização. Diminuindo a demanda bioquímica de
oxigênio da água, afetando espécies aeróbias, ocasionando a morte desses, por
asfixia. Além da contaminação de outras espécies terrestres que dependem desses
corpos hídricos, assim ocasionando desequilíbrio ecológico desses hábitats, também
ocorrendo a bioacumulação, processo de contaminação que exerce um efeito
acumulativo dentro da cadeia trófica, onde espécies da base da cadeia são
contaminados e a partir das outras espécies que se alimentam desse ser, a
contaminação vai se proliferando e aumentando ao ponto em que chega ao predador
do topo da cadeia, envolvendo a contaminação de todo um ecossistema, por
bioacumulação (SOUZA, 2018).
Os solos também são afetados, quando ocorre o descarte desses efluentes de
forma indevida, havendo a contaminação deste, trazendo graves consequências
como a infertilidade do solo, por exemplo, e assim podendo causar a morte de
espécies da flora e, consequentemente, da fauna (SENAI, 2003).
1.3 Corantes AZO
Na antiguidade os corantes para tingimento de fibras e tecidos eram todos
baseados em fontes orgânicas, provenientes principalmente de sementes, folhas e
caules de plantas, desta forma eram mais fáceis de serem degradados naturalmente.
No século XIX, foram criados os corantes sintéticos, cujo uso se intensificou em
meados do século XX. Estes, possuem uma maior complexidade molecular para
serem degradados contendo átomos denominados cromóforos responsáveis em dar
cor aos corantes, e os auxocromos que possuem a capacidade de concentrar as
cores.
Os corantes são pequenas moléculas, contendo dois importantes
componentes: o cromóforo, que tem a função de dar a cor e o grupo funcional que é
responsável em ligar o corante à fibra (ZANONI & YAMANAKA, 2016).
6
Segundo Beltrame (2018), os corantes podem se classificar como: ácidos ou
básicos; com complexo metálico 1:1 ou 1:2; com cromo ou enxofre; dispersos;
diretos ou substantivos; azóicos ou naftóis; à cuba ou à tinta; reativos; pigmentoso.
Pela Tabela 1, observam-se os tipos de corantes e suas respectivas
aplicações em determinadas fibras. Dentre estes, aqueles do tipo azo merecem
destaque, por serem os mais utilizados no mundo, chegando a um percentual de
70% (Schimmel, 2008). Este tipo de corante, em específico, foi criado em 1858, na
Inglaterra por Peter Griess de Diazo e em 1861 já se obtinha uma produção deste
composto em larga escala (PINHEIRO, 2018).
Na atualidade, existem mais de 34.000 corantes e pigmentos produzidos,
segundo a Color Index - publicação conjunta da Society of Dyers and Colourists
(SDC) e da American Association of Textile Chemists and Colourist (AATCC)
(ZANONI & YAMANAKA, 2016).
Composto pelo maior número de corantes sintéticos existentes, os corantes
azo são muito utilizados em vários segmentos industriais, como, por exemplo, o da
cosmetologia, biomedicina, alimentício, e principalmente no setor têxtil. Fazem parte
do grupamento (-N=N-) cromóforo, ligado a um carbono hibridizado sp². Os corantes
monoazo possuem uma ligação dupla e conseguintemente os diazos, duas , os
triazos três e assim sucessivamente, nesses compostos (X-N=N-Y), o radical X
representa a aceitação de elétrons, nos de radical Y doação de elétrons, sendo estes
grupamentos, ligados a anéis de benzeno, naftalinos e também aos grupos
aromáticos heterocíclicos alifáticos (Zanoni & Yamanaka, 2016).
Este tipo de corante é produzido da diazotação de uma amina aromática
primária, originando um sal diazolado, sendo este acoplado a uma substância onde
geralmente pode ser um fenol, amina aromática ou cetona, dando surgimento ao
composto azo, desta forma fornecendo uma larga gama de cores, o que torna seu
uso imprescindível para a indústria (ZANONI & YAMANAKA, 2016). Porém devido a
suas propriedades carcinogênicas, este tipo de corante atualmente vem sendo
proibido em vários países, principalmente nos ramos farmacológicos, alimentícios e
cosméticos. Além de causar sérios riscos à saúde humana, este tipo de composto
gera aminas como produto final, causando maior toxicidade que o próprio corante em
si (PINHEIRO, 2018).
7
Tabela 1 - Classificação de corantes por uso e natureza química.
Fonte: colors index (3rd revision), The society of dyers and colourists - American Association of Textil
Chemist and Colourists, 1987 In: Peres e Abraão, 1998) Apud (Beltrame 2000)
1.4Corante vermelho Congo
Desenvolvido por Paul Bottiger, o corante vermelho Congo ou vermelho do
Congo (benzidinodiazobis-1-naftalamina-4-sulfônico) apresenta fórmula e massa
molecular C32H22N6Na2O6S2 e 696,66 g.mol-1, respectivamente. Trata-se de um
composto (sal sódico) solúvel em água e especialmente em solventes orgânicos
(etanol, por exemplo) que produz uma solução coloidal vermelha (Figura 1). Quando
sensibilizado pelos ácidos inorgânicos, altera a sua cor do vermelho para o azul.
Quimicamente, apresenta anéis aromáticos com os substituintes amino e sulfonato
sódico, além de grupamentos azo, pois fazem parte do grupo de cromóforos (-N=N-),
carboxila (C=O), nitro (NO2), e nitroso (-N=O), através dos quais são capazes de
8
deslocalizar elétrons intramoleculares. Além destes,possui um grupo central de
bifenil e dois naftalenos simétricos, metabolizados em benzina (REIS, 2009).
É bastante utilizado em fibras têxteis, com quem apresenta elevada afinidade
e predominância, afinal está presente em mais de 70% de todas as indústrias têxteis
do mundo. Os corantes com grupo azo, perdem entre 10-20% de sua massa nos
processos de beneficiamento de tecidos, o que ocasiona sérios riscos ao ambiente
aquático, caso esses efluentes sejam descartados sem um tratamento prévio
(PINHEIRO, 2018).
Atualmente, é proibido em alguns países, e alguns nichos industriais, como o
da celulose, por exemplo, já não o utilizam devido às suas propriedades
carcinogênicas, causando sérios problemas à saúde humana (REIS, 2009). Devido a
sua alteração de cor, ele pode ser utilizado como indicador de pH, pois quando se
encontra em pH 3,0-5,2, ele se altera da cor azul para o vermelho. Por fim, possui
altas propriedades espectrométricas, com um pico de 498 nm em seu espectro de
absorção do UV-visível (REIS, 2009).
Por fim,
Figura 1 - Estrutura 3D da molécula do corante Vermelho Congo.
Fonte: National Center for Biotechnology Information (PubChem).
1.5Biotecnologia e biorremediação
A biotecnologia é uma ciência interdisciplinar em que se utiliza de inúmeras
tecnologias correlacionadas a biologia, aplicando-as em diversos outros campos da
ciência ou indústria. É o caso da utilização na indústria 4.0, na robótica, eletrônica,
internet das coisas, inteligência artificial, entre outras. É uma ciência com um
mercado crescente que gera bilhões (SILVA, 2021).
9
A biotecnologia promove o desenvolvimento e soluções através da
bioengenharia, podendo obter manipulações genéticas para conseguir benefícios, no
caso da criação de plantas transgênicas que podem ser resistentes a determinadas
pragas específicas, ou simplesmente não possuírem sementes, tanto para agradar
determinado público consumidor, como também evitar concorrência no mercado,
criando espécies únicas e que não podem se reproduzir por sementes, apenas por
estaquias, ocorrendo a monopolização dessas determinadas espécies (BAJAY,
2018).
O que é percebido neste ponto, é que além de inúmeros benefícios o mau uso
da biotecnologia pode trazer graves consequências para o futuro, podendo haver a
escassez de alimentos, a extinção de espécies, entre outros graves problemas que
poderão ocorrer com esses avanços (FREIRE, 2014). É então uma faca de dois
gumes, podendo trazer grandes avanços para o benefício do meio ambiente, como
pode ocasionar a destruição completa de espécies. No tocante a biotecnologia
relacionada a biorremediação, atualmente são realizadas diversas pesquisas a fim
de mitigar agentes poluidores, se utilizando de formas biológicas para tal feito. São
utilizadas em grande maioria, espécies vegetais, fungos e bactérias, para que haja
uma degradação natural ou induzida, mas que o mais próxima possível da forma
natural, sem que dessa forma se transformem em resíduos ainda mais poluentes,
como acontecem com alguns compostos em estações de tratamento de resíduos
líquidos (TRINDADE, 2002).
Com a grande necessidade de se encontrar formas de mitigar os impactos
ambientais causados pelas ações antrópicas, muitas tecnologias foram criadas no
intuito de solucionar a questão da poluição nos solos, atmosfera, rios, lagos, mares e
oceanos. Porém o que ocorre com alguns tipos de tratamentos químicos é que
surtem efeitos subsequentes podendo gerar outro tipo de fonte poluidora
continuando a causar tais impactos ao ambiente (CUNHA E AUGUSTIN, 2014).
Atualmente, estudos na biologia vem se intensificando cada vez mais no
tocante a encontrar soluções biológicas que aceleram os processos de degradação
se utilizando de espécies que conseguem decompor determinadas substâncias e até
mesmo criar ambientes em que esses compostos sejam inseridos no processo da
cadeia trófica de determinadas espécies, de forma que ocorra total ou quase total
decomposição desses poluentes. Podendo solucionar graves problemas de
10
contaminantes que antes não se era possível tratar, ou demandavam custos
elevados para produções industriais (ZABOTTO, 2019).
A biorremediação se trata de um ramo na ciência que busca através de
processos bioquímicos, degradar poluentes em diversos ambientes, sejam eles
aquáticos, terrestres ou atmosféricos a partir da utilização de microrganismos
aplicados ou presentes no ambiente contaminado (BERNOTH et al., 2000). Segundo
Lacerda (2019), biorremediação é um processo biotecnológico que se baseia no uso
de microrganismos ou enzimas com a finalidade de eliminar contaminantes ou
reduzir sua toxicidade.
A biorremediação ocorre de forma que o ambiente natural não sofra graves
impactos além disso, possa ocorrer a reversão desses impactos. Muitas técnicas são
utilizadas na biorremediação, onde são inseridas espécies vegetais, fungos ou
bactérias, para a mitigação dos poluentes, em que muitas pesquisas já realizadas
mostram uma alta eficácia na reversão de ambientes contaminados. Esse método
proporciona uma maior probabilidade de existir qualidade dos ecossistemas e
devolver efluentes com um baixo ou nenhum nível de toxicidade a partir da
metabolização dos microorganismos, resultando na degradação natural de
determinados compostos (BALAN, 2002).
1.6Lacases
As lacases foram descritas pela primeira vez no Japão em 1883, por Yoshida,
através do estudo da árvore Rhus vernicifera e foi caracterizada como uma enzima
oxidase que possuía metal em sua composição, em 1985, por Bertrand (SILVA,
2006).
Mesmo tendo sido uma das primeiras enzimas descobertas, não se atentou
para o aprimoramento e estudos detalhados dessa enzima por muitos anos. Porém
na última década, esses estudos têm sido intensificados e esta enzima hoje possui
uma significativa importância e aplicação em inúmeros nichos do mercado, entre
alguns, se destacam: a indústria farmacêutica, indústria têxtil, indústria petroquímica,
cosmética, papeleira, entre outras, para diversos fins, como na alimentícia, por
exemplo, para diminuir a turbidez de cervejas, para retirar o amargor de vinhos, (silva,
2006). Também é usado na biorremediação dos efluentes destas indústrias, onde a
11
grande diversidade de tipos de lacases possibilitam variadas formas de uso dessa
enzima para o tratamento de diferentes tipos de efluentes (ARREGUI 2019).
A lacase é uma p-difenol oxidase, pertencentes à família das multicobre
oxidases (MCOs) que possui a capacidade de oxireduzir compostos aromáticos e
fenólicos. São encontradas em vários tipos de organismos, entre eles, bactérias,
vegetais, insetos e fungos. Com tamanhos sequenciais entre 220 à 800 aminoácidos
provenientes de aproximadamente 7.300 fontes de organismos celulares diversos,
até então, dando uma estimativa de várias possibilidades de aplicações em vários
substratos. (Arregui, 2019). As lacases possuem variadas isoformas e diferentes
massas molares que estão associadas às condições de cultivo, ao estado fisiológico
do microrganismo ou a algum indutor no meio de cultivo (MOROZOVA et al., 2007;
PEZZELA et al., 2009).
Algumas características de lacases como, peso molecular, pH ótimo de
atividade e substrato específico são extremamente diversos (MAYER & STAPLES,
2002). As lacases que possuem átomos de cobre em sua constituição e no caso da
lacase, são 4 átomos de cobre em cada molécula, formando 3 tipos de sítios ativos,
que reduzem os substratos a partir das funções desses cobres, sendo o cobre tipo I
responsável por aceptar elétrons do substrato, possuindo como ligantes duas
histidinas imidazóis e o grupo sulfidrila da cisteína, formando uma estrutura trigonal.
Como ligantes equatoriais, e um ligante axial variável, comumente sendo a metionina
em bactérias e leucina ou fenilalanina em lacases fúngicas, possui coloração azul,
dada pela ligação covalente entre cobre e cisteína. E devido ao alto potencial redox
(790 mV), é no sítio I onde ocorre a oxidação do substrato (ARREGUI,2019).
Os átomos de cobre do sítio ativo da lacase são classificados por suas
características espectrais, por exemplo, o sítio I é caracterizado por uma banda de
absorção óptica distintamente pronunciada no comprimento de onda de 600 nm. E
possui uma distância de 12Å em relação aos sítios II e III. Os sítios tipo II e tipo III,
atuam de forma conjunta, formando um centro trinuclear com 4Å de distância entre
eles. Nesses sítios, ocorre a redução de O2 em água (Arregui, 2019). O cobre tipo II
possui duas histidinas, é mononuclear da enzima e invisível nos espectros de
absorção de elétrons. Enquanto o sítio III é binuclear, possui íons de cobre pareados
antiferromagneticamente através de uma ponte de hidróxido que torna este sítio
diamagnético e impede sua detecção nos espectros EPR. Este local pode ser
identificado pela presença de um ombro a 330 nm na região UV do espectro, possui
12
seis histidinas e dois átomos de cobre que são interligados por uma ponte hidroxila.
Essas enzimas são constituídas de 220 a 800 aminoácidos, potencial redox variante,
de acordo com o tipo de lacase, onde as lacases fúngicas são as que possuem maior
Eº e as vegetais, o menor (Arregui 2019). A figura 2 ilustra o sítio ativo de atuação
dos átomos de cobre.
As lacases mais comumente encontradas, possuem três domínios homólogos,
onde o sítio I está localizado no domínio 3, e o cluster trinuclear localizado entre os
domínios 1 e 3, em lacases desta tipologia. O domínio 2 possui a função de unir e
posicionar os domínios 1 e 3, formando assim, o cluster trinuclear. Em praticamente
todos os tipos de lacase há uma característica fixa em relação a posição relativa
entre os sítios de cobre, sendo conservadas as distâncias entre o cobre T1 e o
cluster trinuclear. Os resíduos do domínio 2 e 3, estão envolvidos na formação do
bolsão de ligação ao substrato (onde ocorre a ligação do substrato doador de
elétrons). (MAROZOVA, 2007).
Figura 2 - Ilustração representativa do perfil das interações intramoleculares dos átomos de cobre da
enzima Lacase.
Fonte: Morozova, 2007.
13
Há uma semelhança muito próxima entre as estruturas das lacases de
diferentes microrganismos. Em análises realizadas com mais de 100 lacases de
espécies diferentes, foi observado que seus sequenciamentos, em quatro regiões
são conservadas e específicas em todas as lacases. Sendo uma cisteína e dez
resíduos de histidina, formando um ambiente onde ocorrem as ligações dos átomos
de cobre do sítio ativo da lacase, presentes em quatro sequências de aminoácidos
que se mantém conservadas (MAROZOVA, 2007). Pela tabela 2, percebe-se a
elevada semelhança entre as sequências primárias dos sítios de variados tipos de
lacase
As lacases aplicadas à biotecnologia, possuem hoje um alto valor não só
comercial, como científico, pois devido a sua diversidade de possíveis aplicações em
inúmeros eixos industriais, ela é utilizada para a fabricação de insumos e produtos,
além de ser atualmente uma das mais promissoras fontes de mitigação da poluição
em corpos hídricos e solos, podendo reverter a situação de vários tipos de
contaminantes (ALEXANDRINO et al., 2007).
Tabela 2 - Semelhança sequenciais nos sítios multicobres de diferentes tipos de lacases.
Ligantes dos íons de cobre do sítio ativo representados por resíduos de histidina e cisteína que são
conservadores para todas as lacases são mostrados em cor cinza. Ab, A. bisporus lcc1 Ap, A.
pseudoplatanus; Cc, C. cinereus lcc1; Lt, L. tulipifera lac2-1; Ma, M. albomyces lac1; Nt, N. tabacum;
14
Pc, P. cinnabarinuslcc3-1; PM1, basidiomiceto PM1; Po, P. ostreatus pox2; Rv, R. vernicifera; Th, T.
hirsuta; Tl, T. villosa lcc1; Tt, T. trogii lcc1; Tv, T. versicolor lcc1. Fonte: Marozova, 2007.
1.7 Decomposição do corante vermelho Congo por lacases dos fungos
filamentosos Pycnoporus sanguineus e Trametes versicolor
As lacases fúngicas possuem um importante papel na natureza,
especificamente em degradar a lignina, esse que é o segundo mais abundante
biopolímero existente no planeta, e possui a função de dar sustentação às plantas.
Uma lacase fúngica possui entre 60 a 70 KDa com um ponto isoelétrico com pH 4,0.
São glicosiladas e possuem aumento de massa entre 10 a 25%, seu percentual de
carboidratos, e assim demonstrado em pesquisas sua estabilidade conformacional,
protegendo a enzima da proteólise e da inativação por radicais. Possui um alto
potencial redox em relação às outras tipologias de lacase (Eº 400 Mv), porém com a
peculiaridade de que seu potencial redox possui relação direta com a energia
necessária para subtrair um elétron do substrato. Sendo interessantes para a
biorremediação por ter a capacidade de catalisar substratos com alto Eº (SILVA,
2006).
Segundo Mikolasch & Schauer (2009), lacases provenientes de fungos de
podridão branca possuem alto potencial redox. Enquanto as existentes em bactérias,
insetos e plantas possuem um potencial redox mais baixo.
As lacases fúngicas possuem uma ampla aplicação na biotecnologia, utilizada
para a degradação de fármacos, biorremediação nas indústrias têxtil, petroquímica,
na degradação de agrotóxicos, na utilização de biossensores, e outras atividades
industriais diversas (ARREGUI, 2019).
O fungo Trametes versicolor (conhecido popularmente como cogumelo cauda
de peru) é um dos mais importantes fungos da podridão branca, capaz de produzir
enzimas importantes para a biodegradação, tendo um papel importante na
biorremediação de ambientes aquáticos, de solos, decompondo resíduos fenólicos
(PINKOSKI, 1997). A região de interação com o substrato é delimitada por diversos
resíduos hidrofóbicos conservados (PHE162, LEU164, PHE265, PHE332 e PRO391),
15
formando assim, um ambiente que favorece o encaixe de moléculas hidrofóbicas, em
especial compostos aromáticos, fenóis e aminas, que serão oxidados pela lacase
(ARREGUI, 2019).
O fungo Pycnoporus Sanguineus (conhecido popularmente como orelha de
pau) possui uma lacase capaz de degradar a lignina, biopolímero que dá sustentação
às plantas, transformando dióxido de carbono em água. É muito sensível à salinidade,
porém possui alta tolerância a temperaturas elevadas, superiores a 50ºC, sintetizam
diversos esterois (Marques, 2001). A massa molecular das lacases de Pycnoporus
sanguineus foi consistente com os valores da maioria das lacases fungicas descritas
na literatura, que variam entre 60 e 80 KDa (THURSTON, 1994) e alto potêncial
redox, em seu sítio mononuclear I, em torno de 600nm (ZIMBARD, 2016). O corante
vermelho Congo é um corante sintético que possui uma complexa estrutura
molecular, o que dificulta a sua degradação possui maior dificuldade de ser
executada, até mesmo por enzimas lacases encontrada em vegetais, insetos,
bactérias e fungos. Estes últimos citados são bastante utilizados na biorremediação,
no tratamento de efluentes industriais de diversos nichos, e no tocante a indústria
têxtil traz uma larga escala de possibilidades para a degradação de determinados
corantes que não eram decompostos ou o resultado dessas decomposições parciais
causavam subprodutos tóxicos o que não era interessante para as indústrias
poluentes (ARREGUI, 2019).
Segundo SATISH et al (2009), as lacases possuem a capacidade de
degradarem corantes azo sem clivagem direta das ligações azo através de um
mecanismo de radical livre não específico, evitando a formação de aminas
aromáticas tóxicas.
Até o momento, as lacases mais frequentemente utilizadas na degradação e
desintoxicação de corantes sintéticos, incluindo o Vermelho do Congo, são as
obtidas dos fungos de podridão branca, incluindo o Trametes versicolor e
Pycnoporus sanguineus (PERALTA et al., 2017; IARK et al., 2019). Essas espécies
apresentam grande aplicabilidade no tratamento de resíduos industriais por
apresentar descoloração sobre outros corantes, como o laranja de metilo, azul de
bromofenol, azul de metileno, vermelho de fenol e verde de metilo. O Pycnoporus
sanguineus se destaca pelo seu potencialna descoloração do azul de bromofenol
(LYRA et al., 2009).
16
1.8 Modelagem molecular
A modelagem molecular é uma tecnologia aplicada, onde o aperfeiçoamento
da biotecnologia pôde trazer avançados resultados sobre a interação de moléculas,
assim otimizando pesquisas e diminuindo custos expressivos para a realização
destas, sabendo que pesquisas experimentais muitas vezes são dispendiosas, no
tocante ao tempo e aos custos elevados dependendo do contexto de cada estudo
realizado. A modelagem computacional permite a simulação da estrutura, dinâmica e
interações das proteínas com outras moléculas, complementando técnicas
experimentais, trazendo um detalhamento atômico mais preciso, em medidas
nanométricas, diminuindo as limitações existentes nas pesquisas experimentais.
Essas simulações são baseadas em cálculos da química molecular, mais
precisamente a partir da equação de Schrödinger. E devido a complexidade dos
sistemas biológicos esses cálculos são baseados na mecânica molecular, a partir de
parâmetros empíricos pré-definidos, em que os átomos se movem em uma superfície
energética, fornecendo informações mais precisas. A biotecnologia vem ao longo do
tempo sendo cada vez mais aprimorada, desenvolvendo novas tecnologias e
softwares mais complexos e completos, bancos de dados que armazenam
informações de proteínas e moléculas, como, por exemplo, o Protein Data Bank,e o
Pubchem, entre outros, permitindo aos seus usuários e pesquisadores, novas
possibilidades de se obter respostas em relação a elementos ainda não identificados.
A maior parte desses estudos são aplicados na área da farmacologia, para a
simulação de possíveis interações de substâncias com enzimas que possam trazer
respostas para a cura ou compreensão de patologias diversas.
Porém, tendo em vista essas interações biológicas, ligante/proteína, estudos
recentes, mostram a aplicação dessa tecnologia na área da biorremediação, já que a
base desses estudos está voltada para o uso de soluções biológicas e produtos
químicos que podem ser decompostos. Assim podendo trazer soluções a partir das
análises das interações de determinados poluentes e enzimas catalisadoras, por
exemplo.
No ano de 2003, Zhang e Zhang, desenvolveram um método aplicado aos
sistemas biológicos baseados na química molecular, denominado de Molecular
Fractionation with Conjugate Caps (MFCC), traduzido para o português como
Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas. Esse método possibilita calcular
17
a energia de interação entre aminoácidos/ligante, proteína/ligante, somando todas as
densidades eletrônicas de cada elemento. E que ao se obter tal informação sobre a
densidade eletrônica e potencial eletrostático, é possível a melhor compreensão das
estruturas químicas, das reações e ligações realizadas entre as moléculas, a catálise
e solvatação dos sistemas biológicos em análise.
Este método que apesar de ser embasado na equação de Schrödinger,
aperfeiçoou a forma de calcular essas interações ao modo em que anteriormente
esses cálculos eram realizados por método ab initio, com a equação de Hartree-Fock,
esta que é uma solução aproximada da equação de Schrödinger, porém por esse
método a correlação eletron-eletron, não era realizada. Em contraposto a esse
método, a teoria funcional da densidade (DFT), traz a solução para esse problema
corrigindo essa questão, baseando-se no teorema de Kohn-Sham determinando o
potencial externo e o número total de elétrons de um determinado sistema, através
da densidade eletrônica do sistema (ALBUQUERQUE et al., 2014).
18
2 JUSTIFICATIVA
Na atualidade existe uma grande problemática em torno da poluição causada
pelas ações antrópicas, em que não somente o próprio ser humano é prejudicado,
tanto no tocante à saúde como escassez de alimento, assim como é algo prejudicial
a todas as outras espécies viventes. Por sua vez, os corantes são propriedades
utilizadas em vários segmentos industriais, e um dos mais utilizados no mundo é o
corante vermelho Congo, por fornecer uma grande disponibilidade de cores, o que
propicia a alta usabilidade, como por exemplo, na indústria têxtil, que é o segundo
segmento que mais polui, perdendo apenas para a indústria petroquímica. Tendo
como embasamento essa questão, há a importância de mitigar esses processos
industriais que são altamente poluidores, e que com o avanço dos estudos no âmbito
da biotecnologia, há descobertas de espécies biológicas capazes de degradar
determinados compostos complexos, que até então, não se era possível degradar
com tanta facilidade ou existiam processos que eram dispendiosos, se tornando
inviáveis. No âmbito biológico algumas espécies de fungos e bactérias são capazes
de degradar compostos fenólicos e aromáticos, inclusive àqueles de difícil eliminação,
como é o caso do corante vermelho Congo.
Essas enzimas, contribuem para a catabolização destes compostos, como é o
caso da enzima lacase, que é encontrada em várias espécies de fungos, bactérias,
vegetais e insetos. Essa enzima apesar de ter sido descoberta no século XIX, até a
última década não tinha sido atentada no tocante ao seu uso para a degradação de
poluentes, principalmente no uso de corantes, já que a produção de corantes
sintéticos só surgiu no século XX e até então os corantes utilizados eram orgânicos,
ou seja, provenientes de folhas, sementes, caules e alguns minerais encontrados
19
naturalmente na natureza. Atualmente, contudo, os corantes sintéticos são
predominantes, o que põe em risco nossos ecossistemas, afinal são de difícil
degradação ambiental, tendo em vista a complexidade da estrutura química destes.
Este trabalho tem a importância de avaliar qualitativamente e quantitativamente os
contatos intermoleculares do corante vermelho Congo com as enzimas lacase dos
fungos Trametes versicolor e Pycnoporus sanguineus, as quais são capazes (até
certo nível) de degradar compostos sintéticos. Nesse estudo, a análise das
interações energéticas é realizada para simular a degradação que essas enzimas
são capazes de causar nesse determinado composto, este que por sua vez causa
uma série de prejuízos ao meio ambiente, e prejuízos econômicos às indústrias,
devido a sua complexidade de degradação.
Sendo assim, nesta pesquisa, os resultados e simulações dessas interações
são de extrema importância não apenas para a ciência em si, como para a indústria
e para o meio ambiente como um todo, pelo fato de se viabilizar possibilidades de
degradação para uma substância complexa e melhor compreender tais interações
ligante/receptor, e conseguinte o comportamento de fato dessas interações, de uma
forma que traga resultados benéficos à baixos custos, sem a necessidade de gastos
com experimentações, contribuindo para o aprofundamento dos estudos no âmbito
da biorremediação, mitigando a poluição em vários ambientes, sejam estes aquáticos
ou terrestres.
20
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivos gerais
Descrever as interações energéticas intermoleculares da lacase de
Pycnoporus sanguineus e de Trametes versicolor acopladas ao corante Vermelho
Congo.
3.2 Objetivos específicos
● Calcular as interações energéticas individuais e totais entre as lacases de
Pycnoporus sanguineus e Trametes versicolor com o corante vermelho Congo,
enfatizando o acoplamento mais estável em termos de afinidade;
● Caracterizar a natureza química das interações intermoleculares existentes
entre o corante e as lacases nos complexos CR-LacPs e CR-LacTv;
● Identificar as regiões do ligante (corante) mais importantes para o seu
acoplamento nos sítios de ligação das enzimas lacases em questão;
● Determinar o raio de convergência de estabilização dos complexos ligante-
receptor, consequentemente o tamanho real dos sítios ativos.
21
4 METODOLOGIA
4.1 Construção dos complexos CR-LacTv e CR-LacPs
Nesse trabalho, por não haver dados cristalográficos do corante vermelho
Congo ligado a lacases, as enzimas da lacase do Trametes versicolor (PDB ID:
1KYA - Figura 3) e doPycnoporus sanguineus (PDB ID: 5NQ7 - Figura 4) foram
previamente obtidos do Protein Data Bank (RSPDB).
Previamente, o estado de protonação/desprotonação da molécula do CR
(ChemSpider ID 10838) e dos aminoácidos das lacases em pH 7,2 (neutro) foram
calculados pelo software Marvin Sketch e Propka, respectivamente. Assim, foi
mimetizado o ambiente biológico da forma mais fidedigna possível, inclusive
conservando o estado de atividade da enzima. Então a geometria espacial do CR foi
otimizada tendo por base a Teoria do Funcional da Densidade (DFT),
especificamente o funcional B97D.
Então, a técnica de ancoramento molecular foi utilizada para elucidar a
orientação e geometria assumidas por esse corante nessas enzimas de
biodegradação. O ligante foi acoplado em seu bolso de ligação na LacTV e LacPs
utilizando um protocolo de proteína rígida, através da ferramenta Autodock4
(MORRIS et al, 2009; HUEY et al, 2007; MORRIS, 1998), tendo como posição inicial
(eixos XYZ) as coordenadas do corante 2,5-xylidina presente no cristal 1KYA.
Uma vez que os algoritmos de ancoramento molecular normalmente
apresentam problema de repetibilidade (um erro típico de ± 2,0 kcal/mol), a execução
do procedimento repetidas vezes permite a obtenção de um número grande de
estruturas, garantindo a amostragem adequada dos possíveis resultados
(COSCONATI et al., 2010). Assim sendo, o docking foi executado 20 vezes utilizando
22
o algoritmo genético Lamarckiano, além de 25.000.000 avaliações de energia por
corrida, tamanho populacional definido para 150 e um máximo de 27.000 gerações
por corrida. Ao final, mil poses foram obtidas (50 poses por saída) e agrupadas
usando uma tolerância RMSD de 1,0 Å através do Autodock Tools (MORRIS et al,
2009).
As 20 conformações com melhor autodock score foram otimizadas
geometricamente por mecânica clássica em duas etapas consecutivas: (i) apenas os
átomos de hidrogênio ficaram livres para se mover durante a otimização; (ii) os
átomos de hidrogênio do receptor e a molécula do ligante ficaram livres para se
mover durante a otimização. O procedimento de otimização clássico foi realizado
pelo campo de força CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics),
uma vez que possui um bom desempenho para moléculas orgânicas, sejam elas
pequenas como os fármacos estudados ou macromoléculas como as proteínas
atuantes como receptores (MOMANY; RONE, 1992), com tolerância de convergência
de 2,0 x 10-5 kcal/mol (variação de energia total), 0,001 kcal/mol.Å (força máxima por
átomo) e 1,0 x 10-5 Å (deslocamento atômico máximo).
Destacamos que o protocolo de docking adotado neste trabalho foi validado
por trabalhos anteriores através do redocking de ligantes em diferentes cristais de
proteína (ZANATTA et al, 2016; ZANATTA et al, 2014; MOHAMED et al, 2008;
HALPERIN et al, 2002).
Posteriormente, o binding score dessas 20 estruturas foram validadas através
de um cálculo clássico de energia de ligação (E.ligação), conforme descrito abaixo:
E.ligação = E.R+L – (E.R + E.L) (1)
onde o primeiro termo, E.R+L, é a energia total do sistema formado pela ligação do
CR na lacase; E.R é a energia total do receptor lacase sozinho; enquanto E.L é a
energia total da molécula do corante vermelho congo isolado.
Os estados acoplados ligante-receptor, no caso CR-LacTV e CR-LacPs, com
maior estabilidade e afinidade de ligação foram selecionados para etapa
subsequentes.
23
Figura 3 - Estrutura tridimensional da Lacase de Pycnoporus sanguineus co-cristalizada com o
corante vermelho Congo (em laranja) (PDB ID: 5NQ7).
Fonte: Autoria Própria
Figura 4 - Estrutura tridimensional da Lacase de Trametes versicolor co-cristalizada com o corante
vermelho Congo (em laranja) (PDB ID: 1KYA).
24
Fonte: Autoria Própria
4.3 Otimização geométrica por QM/MM
Os complexos CR-LacTv e CR-LacPs mais estáveis re-otimizados através de
um protocolo de refinamento geométrico consideravelmente preciso e eficiente
utilizando um método híbrido de Mecânica Quântica e Mecânica Molecular (QM/MM).
A otimização QM/MM foi realizada dentro do framework ONIOM de 2 camadas: o CR
foi considerado como pertencente à camada QM, enquanto todo o receptor lacase
foi tratado como pertencente à camada MM. O campo de força AMBER foi utilizado
para realizar os cálculos de MM dentro de um esquema eletrônico de embedding e
para atribuir as cargas atômicas dos átomos do CR. Todos os resíduos de
aminoácidos dentro de um raio de 10,0 Å do centroide de CR foram autorizados a se
mover livremente durante a otimização da geometria. O funcional B97D e o conjunto
de base AUG-cc-pVTZ forma utilizados na camada QM.
Dessa forma, em sumário, as energias finais de QM/MM relatadas são
baseadas em cálculos de ponto único de incorporação eletrônica no nível de teoria
ONIOM(B3LYP/6-311+G(d,p):AMBER) usando as geometrias otimizadas. Todos os
cálculos do ONIOM foram realizados com a versão de desenvolvimento do Gaussian.
4.4 Cálculo das interações intermoleculares
25
Os cálculos energéticos utilizados para obtenção das energias de interação
entre o CR e os resíduos de aminoácidos das enzimas LacTv e LacPs foram
executados a partir da técnica de Fracionamento Molecular com Caps Conjugadas
(do inglês Molecular Fractionation with Conjugate Caps - MFCC) e do formalismo da
Teoria do Funcional da Densidade (DFT), especificamente utilizando o funcional
B97D e o conjunto de base cc-pvtz, incluindo termos de dispersão para melhorar a
descrição das interações não covalentes (ESMAILE et al., 2021)..
Através do MFCC, o biocomplexo ligante-receptor é particionado em
fragmentos de aminoácidos acoplados ou não ao ligante. Subsequentemente, as
energias dessas subunidades serão calculadas (via DFT) e, posteriormente, obtém-
se a afinidade total do ligante pelo bolsão de acoplamento (SANTOS et al, 2022;
BARBOSA, et al, 2021a; BARBOSA, et al, 2021b; VIANNA et al, 2021; ESMAILE et
al, 2021; ZHANG et al, 2003). Desse modo, calcula-se a energia de um número
considerável de resíduos sem que a qualidade seja perdida e o tempo de
processamento seja pequeno. O MFCC propicia um meio ágil e prático para a
obtenção dos cálculos moleculares, auxiliando o fornecimento de uma informação
quantitativa e extremamente útil para a compreensão do complexo proteína-ligante
(ZHANG et al, 2005).
Antes da realização dos cálculos de energia de interação, esferas de raios (r)
subsequentes (com variação 0,5 Å) a partir do ligante foram desenhadas, de forma a
englobar de forma crescente os aminoácidos do receptor. À cada novo raio,
adicionava-se as energias de interação individual dos aminoácidos incorporados à
somatória dos raios anteriores. No momento, que a variação de energia entre três ou
mais raios consecutivos é menor que 10%, afirma-se que o sistema atingiu um
estado de convergência energética; o que evita, pois, a perda de interações
importantes (PEREIRA et al, 2021; CAMPOS et al, 2020).
Nessa perspectiva, a metodologia de fragmentação MFCC foi executada em
um total de 59 (48) aminoácidos do complexo LacTv (LacPs) . Criou-se, então,
quatro cortes/subsistemas/subunidades para cada resíduo - A, B, C e D (Figura 9). É
importante evidenciar que, quando o corte é feito em cada resíduo (dentro do
determinado raio), as valências das ligações covalentes ficam abertas. Sendo assim,
é necessário o uso de “capas” (ou caps) para o fechamento das valências para
recriar um microambiente parecido com o da proteína antes de ser cortado (ZHANG;
ZHANG, 2003). Assim sendo, para cada um desses 107 resíduos estudados, os
26
primeiros subgrupos (ou subunidade A) eram formados pelo ligante (L), o resíduo (R)
que está sendo analisado, além dos caps anterior (C1) e posterior (C2) a ele (L + C1
R C2). Nos subgrupos B, o ligante e os caps foram considerados no cálculo, todavia
o resíduo analisado foi removido (L + C1 C2). Apenas os caps e o resíduo que está
sendo estudado (C1 R C2) foram considerados no subgrupo C. Por fim, o quarto e
último subgrupo(D) apresentaram apenas os caps conjugados (C1 C2).
Após definir a nomenclatura do ligante (L), das capas, antecessora (C1) e
sucessora (C2) e do resíduo em questão (R), aplicaremos na equação abaixo para
obtenção apenas da energia de interação do ligante com cada resíduo de
aminoácido do receptor proteico:
E (L – R) = E (L + C1 R C2) – E (C1 R C2) – E (L + C1 C2) + E (C1 C2)
onde, E (L – R) corresponde a energia de interação entre o resíduo-ligante; E (L +
C1 R C2) corresponde a energia total do sistema; E (C1 R C2) corresponde a
energia das capas antecessoras, sucessoras e o resíduo; E (L + C1 C2)
corresponde a energia do ligante e as capas antecessora e sucessora; e, por fim, E
(C1 C2) corresponde a energia apenas das capas antecessora e sucessora. Vale
ressaltar que as moléculas de água foram consideradas quando estabeleceram
ligações de hidrogênio com alguma capa ou resíduo de interesse e adicionadas aos
cortes.
A representação do ambiente molecular é um passo essencial para o estudo
de propriedades moleculares em biomoléculas. Recentemente, modelos de
solvatação implícitos, especificamente o CPCM (Conductor-like Polarizable
Continuum Model) (TAKANO et al., 2005), foi introduzido nos cálculos quânticos das
energias de interação em sistemas do tipo ligante-proteína (OURIQUE et al., 2016;
DANTAS et al., 2015). Comumente, diferentes valore de constante dielétrica (ε) para
representar o efeito do ambiente na avaliação das energias eletrostáticas são
levados em consideração. Neste trabalho, nós empregamos a aproximação MFCC
junto com o modelo CPCM, utilizando uma constante dielétrica de 40 (ε=40), de
forma a aumentar a similaridade entre o ambiente eletrostático de cada fragmento e
27
àquele encontrado na proteína, além de estimar os efeitos na energia, tais como a
polarização do meio promovido pelo solvente (DANTAS et al., 2015).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Levando em consideração que em tempos remotos, até a metade do século
XIX, a maior parte dos corantes têxteis utilizados para colorir tecidos eram
provenientes de compostos orgânicos, os impactos ambientais eram bem menores
se comparado à problemática enfrentada atualmente pela indústria têxtil que carrega
o título do segundo segmento industrial que mais causam impactos ambientais em
diversos âmbitos, principalmente aos ambientes e espécies aquáticas. No final do
século XIX e início do século XX, foram criados e intensificados o uso de corantes
sintéticos que possuem moléculas muito mais complexas e que existe uma maior
dificuldade de serem degradadas. Com o aprofundamento dos estudos em
biotecnologia aplicada a biorremediação, a descoberta da família das lacases como
enzimas capazes de oxidar compostos fenólicos, aromáticos e não aromáticos
permitiu uma alternativa viável para estudos que visam encontrar soluções
mitigadoras de despoluição de corpos hídricos e solos contaminados.
A partir do pressuposto que as lacases fúngicas possuem capacidade de
degradação de compostos aromáticos distintas e que apresentam pequenas
peculiaridades conformacionais, este estudo tem a responsabilidade de averiguar a
28
complexidade das interações comparativas entre duas lacases do tipo fúngicas,
tentando compreender seu perfil energético de interação e afinidade em relação a
um mesmo substrato.
Os complexos LacTv/LacPs, mostraram interações intermoleculares
relevantes na oxirredução do corante Vermelho Congo, resultados estes que são
importantes para estudos realizados no âmbito da biorremediação, e alguns setores
industriais, em especial a indústria têxtil. Esses resultados trazem um detalhamento
do que ocorre quando os complexos LacTv/LacPs entram em ação decompondo o
corante de tipo Azo: Vermelho Congo. O presente estudo demonstrou que a enzima
LacPs possui maior afinidade energética com o substrato CR, do que com LacTv,
apesar da similaridade estrutural e funcional. Isso ocorre pois apresentam um perfil
de interações intermoleculares distintos entre si, em especial ligações de hidrogênio
e hidrofóbicas do tipo � �.
A ligação de hidrogênio é um dos tipos mais importantes de contato
intermolecular para a estabilidade de sistemas biológicos; sendo, por exemplo,
responsável pelas propriedades da água, estabilidade da dupla fita de DNA. Esse
tipo de ligação ocorre devido ao átomo de hidrogênio, positivo, que para manter sua
estabilidade química, precisa perder, ganhar ou compartilhar 1 elétron do outro
átomo, tendo uma alta probabilidade de se unir com átomos muito eletronegativos,
como é o caso do N, Cl, F e O, promovendo uma grande polarização da ligação,
tornando o polo positivo demasiadamente intenso, interagindo com os elétrons da
molécula que estiver mais próxima. Que segundo (GRABOWSKI, 2004). Ligações de
hidrogênio são simbolizadas por X−H···Y e são resultados da interação entre um
segmento doador de próton (X-H) e um segmento receptor de próton (Y), onde X e Y
são átomos eletronegativos, geralmente O, N e Cl.
O átomo de hidrogênio, quando ligado covalentemente a pequenos átomos de
alta eletronegatividade, acarreta em uma ligação dipolo permanente de alta
magnitude, devido a nuvem eletrônica tender a ficar concentrada em torno da parte
da molécula onde estão os núcleos atômicos, ficando então desprotegido o átomo de
hidrogênio carregado positivamente, surgindo interações dipolo-dipolo, que possuem
magnitude maior que as forças dipolo-dipolo permanentes, onde os átomos de
hidrogênio se ligam aos átomos de O de outros átomos, fazendo as moléculas se
ligarem entre si, possuindo uma energia de ligação de 30 kj/mol (JUNQUEIRA, 2017).
29
As ligações do tipo Pi ou ligações � , são ligações covalentes que ocorre em
átomos capazes de realizar ligações duplas ou triplas entre átomos sendo que, em
uma ligação dupla, por exemplo, sempre haverá uma ligação sigma e uma ligação �,
e em uma ligação tripla, sempre haverá uma ligação sigma e duas ligações � . Que
ocorre quando há a interpenetração de dois orbitais, do átomo, incompletos, sendo
esses do subnível p, sendo que cada átomo da ligação possua ao menos um orbital
paralelo ao orbital p do outro átomo (Rocha, 2019).
5.1 Estado de protonação
As análises do estado de protonação por meio do software Marvin Sketch
demonstrou a carga negativa do corante Vermelho Congo, identificada com carga -2
no pH neutro de 7.2. O corante vermelho Congo foi dividido em três regiões para
melhor descrever as interações (Figura 5). As cargas se encontram nas regiões i e iii
do corante que confere carga -1 aos dois átomos de oxigênio em suas duas
extremidades de enxofre, se comportando como óxido sulfônico. A região i e iii
apresentam a mesma estrutura, com um óxido sulfônico carregado negativamente
nas suas extremidades (= sulfonato), uma benzoamina e um anel benzênico,
enquanto a região ii apresenta dos anéis benzênicos que conectam as regiões 1 e 3
pelos nitrogênios.
Figura 5 - Análise da conformação espacial (E1-E13) predominante em cada pH (1-14), com
destaque à representação esquemática da conformação mais abundante do corante vermelho Congo
em pH 7,2.
30
Fonte: autoria própria.
5.2 Análise de convergência
Seguindo o critério de convergência, analisamos as interações energéticas de
59 (48) aminoácidos da enzima lacase do Trametes versicolor - LAcTv (Pycnoporus
sanguineus - LacPs) que interagem com o corante vermelho Congo em um raio de
convergência de 10 Å (Tabelas 3 e 4). A convergência ocorreu a partir do raio de 4,5
Å no CR-LacTv e 6,0 Å no CR-LacPs, em que o sistema foi estabilizado (raio
subsequente não variou mais de 10%), mostrando o tamanho do sítio de ligação
desses complexos. A energia total do complexo CR-LacTv foi de -19.26 kcal/mol,
enquanto que o LacPs apresentou -38.26 kcal/mol, indicando uma maior afinidade
do corante vermelho Congo com a lacase Pycnoporus sanguineus.
31
No Gráfico 1, pode-se observar que os declives das curvas energéticas dos
raios no complexo CR-LacTv, a partir de 2,5Å até 4Å; emε=40, dos resíduos
inseridos: ALA393 e ASP266 que são mais atrativos energeticamente no bolso de
acoplamento.
Gráfico 1 - Energia de interação total (em kcal/mol) do corante vermelho Congo com a lacase de
Trametes versicolor (CR-LacTv, em rosa) e de Pycnoporus sanguineus (CR-LacPs, em laranja) em
função do raio do bolso de ligação r (em Å). Resultados foram obtidos utilizando o funcional GGA
B97D e constante dielétrica de 40 no esquema MFCC.
Fonte: Autoria Própria.
Já no complexo CR-LacPs ocorre o declive a partir de 2,5Å; 3Å; 4,5Å e 5Å;
em ε=40 e aclive em caráter repulsivo em: 3,5Å e 4Å nos respectivos resíduos
incluídos: PHE162 e ASP266, também mais interativos energeticamente no bolso de
acoplamento. Essas oscilações observadas demonstram as atrações e repulsões
energéticas que ocorrem entre o ligante, que neste caso corresponde ao corante
vermelho Congo/CR e aminoácidos pertencentes aos complexos LacTv e LacPs. O
gráfico da análise de convergência mostra as variações energéticas e o ponto em
que ocorre a convergência, e é dada as energias totais dos sistemas.
32
Tabela 3 - Descrição dos 59 aminoácidos da enzima lacase do Trametes versicolor (LacTv)
interagindo com o corante vermelho Congo. A região e os átomos do ligante interagindo com cada
aminoácido do receptor, além do raio (em Å) onde eles estão localizados estão destacados.
Fonte: Autoria Própria.
33
Tabela 4 - Descrição dos 48 aminoácidos da enzima lacase do Pycnoporus sanguineus (LacTV)
interagindo com o corante vermelho Congo. A região e os átomos do ligante interagindo com cada
aminoácido do receptor, além do raio (em Å) onde eles estão localizados estão destacados.
Fonte: Autoria Própria.
5.3 Perfil de interação do corante vermelho Congo nos complexos CR-LacTv e
CRLacPs
Posteriormente à realização dos cálculos energéticos, foram comparadas as
principais interações dos complexos CR-LacTv/CRLacPs, sendo perceptível que as
interações ocorridas na região i e iii possuem uma resposta mais expressiva em
relação à região ii, que não é mostrada nos gráficos devida às baixas interações
existentes (Gráfico 2). No entanto o complexo CR-LacPs, obteve melhores
resultados devido aos tipos de ligações que nele ocorrem, sendo ligações de
hidrogênio.
34
Gráfico 2 - Painel gráfico destacando, em ordem crescente de distância (Å), os resíduos mais
relevantes que contribuem para os complexos formados pelo corante vermelho Congo e a lacase de
Trametes versicolor (CR-LacTv, em pink) e de Pycnoporus sanguineus (CR-LacPs, em laranja). A
região e os átomos do ligante interagindo com cada aminoácido estão destacados. A marcação ‘*’
indica que a interação está presente somente em CR-LacPs
Fonte: Autoria Própria.
Percebe-se que os resíduos mais importantes que constituem o sítio de
ligação do complexo CR-LacTv, são, em ordem decrescente: PHE162 (-5,20
kcal/mol); ALA161 (-4,62 kcal/mol); GLY266 (-4,01 kcal/mol); ALA393 (-3,81
kcal/mol); PHE265 (-2,94 kcal/mol); PRO391 (-0,93 kcal/mol); PRO160 (-0.58
kcal/mol); GLY392 (-0,55 kcal/mol) (Figura 6). Em relação ao complexo CR-LacPs,
seus resíduos mais importantes são: ARG161 (-9,66 kcal/mol); PHE162 (-8,58
kcal/mol); GLY392 (-7,81 kcal/mol); GNL160 (-7,03 kcal/mol); SER393 (-6,59
Kcal/mol); PRO391 (-3,11 kcal/mol); PHE265 (-0,21 kcal/mol). Foi observado que o
único aminoácido em comum aos dois complexos proteicos que possuem alta
afinidade com o substrato corante Vermelho Congo, é o PHE162.
35
Figura 6 - Visão detalhada dos resíduos mais importantes envolvidos na ligação do corante vermelho
Congo com a lacase de Trametes versicolor (Pycnoporus sanguineus) em rosa (laranja).
36
Fonte: Autoria Própria
O Gráfico 2 demonstra as energias totais de ambos os sistemas, os
aminoácidos que mais se destacam em termos energéticos, incluindo as regiões dos
contatos intermoleculares ligante-receptor. De forma complementar, as Tabelas 5 e
6 destacam e comparam a natureza química dessas interações.
Corroborando com nossos resultados, estudos anteriores da enzima lacase
com diferentes ligantes demonstraram que resíduos como Arg161 (Ala161), PHE162,
Phe265, Pro391, GLY392, ALA393 (SER393) têm contribuições significativas para a
energia de ligação por ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Além disso,
eles formam uma parte importante da cavidade de ligação do substrato. Dentre
esses resíduos, se destaca ARG161, PHE162 e PHE265 como resíduos chave, que
aumentaram a ligação ao substrato e a eficiência catalítica enzimática.
Tabela 5 - Principais contatos intermoleculares de natureza hidrofóbica existentes nos complexos CR-
LacTv e CR-LacPs
Fonte: Autoria Própria
Tabela 6 - Sumário dos principais tipos de contatos intermoleculares existentes nos complexos CR-
LacTv e CR-LacPs.
37
Fonte: Autoria Própria
REGIÃO I
Região do ligante que interage mais fortemente com a CR-LacTv,
especificamente -12,26 kcal/mol, ou seja, 63,60% da energia total do sistema
(Tabela 7 e Figura 8). E se trata da segunda região com maior interação no tocante
ao complexo CR-LacPs atingindo um total de -15,58 kcal/mol, e uma porcentagem
de 40,70%. Os aminoácidos que mais possuem destaque nas interações no
complexo CR-LacTv são: GLY266 possuindo (-4,01 kcal/mol), ALA393 (-3,81
kcal/mol) e PHE265 (-2.95 kcal/mol). No complexo CR-LacPs obteve-se destaque os
aminoácidos: GLY392 possuindo (-7,81 kcal/mol), SER393 com (-6,59 kcal/mol),
PRO391 (-3,11 kcal/mol) e ASP206 com (4.95 kcal/mol) este, apresentando repulsão.
E apesar de haver uma maior porcentagem energética do complexo CR-LacTv, o
complexo CR-LacPs apresenta uma maior interação, como é visto nos dados
anteriores onde CR-LacTv possui -12,26/Kcal/mol e CRLacPs -15,59 kcal/mol.
Sendo assim o complexo CR-LacPs, possui uma maior capacidade em degradar o
ligante. Que ocorre devido a repulsão em seu aminoácido ASP266, na região i.
Esses resíduos, com exceção do ALA393 do CR-LacTV, interagem com a
região i(S), uma cadeia lateral de óxido sulfônico carregada negativamente na
estrutura do corante vermelho Congo, variando o oxigênio. Por outro lado, ALA393
de LacTv interage com a região i(C7)NH.
No ligante quando acoplado à LacTv, o óxido sulfônico(SO3-), está voltado
para cima, enquanto que o grupo amina (NH2), está voltado para baixo. No LacPs,
ocorre o oposto, o grupo amina (NH2) voltado para cima e o óxido sulfônico(SO3-)
para baixo, representando um giro de 180º, propiciando interações nesta região com
diferentes aminoácidos, sendo salientado que a LacPs possui maior interação que
LacTv (-15,58 kcal/mol vs. -12,26 kcal/mol).
Em CR-LacTv, GLY266 forma duas ligações h com a região i(S)O5 (2,74 Å) e
i(S)O4 (2,94 Å); ALA393 forma uma ligação h com i(C7)NH (2,37 Å); e PHE265
forma uma ligação h não convencional com i(S)O4 (2,19 Å). Além disso, PHE265
forma Pi-Stacking com anel aromático da região i (5,94 Å). Para CR-LacPs, GLY392
e SER393 formam ligações h com a mesma região i(S)O- (1,79 Å e 1,74 Å,
38
respectivamente). Além disso, SER393 e PRO391 formam ligações de hidrogênio
não convencionais com a região i(S)O4 (2,37 Å) e i(S)O5 (3,7 Å), respectivamente.
O resíduo SER393 (-6,59 kcal/mol) do CR-LacPs possui maior afinidade
referente a ALA393 (-3,81 kcal/mol) do complexo CR-LacTv ocasionando em uma
ligação de hidrogênio mais forte e próxima (1,74Å contra 2,37Å), ocorrendo o
acréscimo de uma ligação de hidrogênio não convencional. O aminoácido que
também possui destaque é o GLY392, com uma interação de (-7,81 kcal/mol),
ambos interagindo com o oxigênio carregado negativamente do óxido sulfônico.
REGIÃO II
Embora a região ii apresente algumas interações hidrofóbicas do tipo Pi-Alquil
(Leu164 em LacTv) e Pi Stacking (PHE162, PRO391 em LacTv; PHE162 em LacPs),
em geral, é uma região repulsiva (LacTv 2,59 kcal/mol, LacPs 1,52 kcal /mol)
(Figura 9). Como o foco é analisar qual enzima é mais efetiva, esta região do
corante não se mostrou relevante.
REGIÃO III
Nesta região obteve-se bons resultados