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Unidade 1 Livro Didático Digital Thiely Rodrigues Ott Citologia e Embriologia Diretor Executivo DAVID LIRA STEPHEN BARROS Gerente Editorial CRISTIANE SILVEIRA CESAR DE OLIVEIRA Projeto Gráfico TIAGO DA ROCHA Autora THIELY RODRIGUES OTT A AUTORA Thiely Rodrigues Ott Olá. Meu nome é Thiely Rodrigues Ott. Sou formada em Biomedicina, com uma experiência técnico-profissional na área de Citopatologia e Patologia Humana de mais de 8 anos de experiência, sou especialista em Citopatologia e mestre em Saúde, Medicina Laboratorial e Tecnologia Forense, atualmente desenvolvo minha tese de doutorado em Análise de Tecnologias para a Saúde. Tive a oportunidade de trabalhar em hospitais de grande, médio e pequeno porte e participei de projetos de pesquisa na Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Universidade Estadual do Rio de Janeiro e Fiocruz, onde mantenho vínculos profissionais até hoje. Sou apaixonada pelo que faço e adoro transmitir minha experiência de vida àqueles que estão iniciando em suas profissões. Por isso fui convidada pela Editora Telesapiens a integrar seu elenco de autores independentes. Estou muito feliz em poder ajudar você nesta fase de muito estudo e trabalho. Conte comigo! ICONOGRÁFICOS Olá. Esses ícones irão aparecer em sua trilha de aprendizagem toda vez que: INTRODUÇÃO: para o início do desenvolvimento de uma nova compe- tência; DEFINIÇÃO: houver necessidade de se apresentar um novo conceito; NOTA: quando forem necessários obser- vações ou comple- mentações para o seu conhecimento; IMPORTANTE: as observações escritas tiveram que ser priorizadas para você; EXPLICANDO MELHOR: algo precisa ser melhor explicado ou detalhado; VOCÊ SABIA? curiosidades e indagações lúdicas sobre o tema em estudo, se forem necessárias; SAIBA MAIS: textos, referências bibliográficas e links para aprofundamen- to do seu conheci- mento; REFLITA: se houver a neces- sidade de chamar a atenção sobre algo a ser refletido ou dis- cutido sobre; ACESSE: se for preciso aces- sar um ou mais sites para fazer download, assistir vídeos, ler textos, ouvir podcast; RESUMINDO: quando for preciso se fazer um resumo acumulativo das últi- mas abordagens; ATIVIDADES: quando alguma atividade de au- toaprendizagem for aplicada; TESTANDO: quando o desen- volvimento de uma competência for concluído e questões forem explicadas; SUMÁRIO Aspectos Gerais Da Estrutura Celular ................................................ 12 Aspectos Gerais da Estrutura Celular: Compreensão da Organização Estrutural de Células Procarióticas e Eucarióticas ................................................. 12 Membrana Celular ..................................................................................................... 15 Citoesqueleto .................................................................................................................. 16 Núcleo ................................................................................................................................ 16 Retículo Endoplasmático e Ribossomos .................................................... 17 Complexo de Golgi ..................................................................................................... 18 Mitocôndrias .................................................................................................................... 19 Lisossomos ...................................................................................................................... 20 Peroxissomos .................................................................................................................. 21 Diversidade e Semelhança Entre as Células ..............................................................22 Conceitos de Microscopia .......................................................................26 Componentes do Microscópio Óptico e suas Funções ......................................26 Microscopias Especiais ...............................................................................................................29 Descrição dos Princípios Básicos de Microscopia Eletrônica de Transmissão e Varredura ...........................................................................................................29 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ...................................... 30 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ............................................ 30 Métodos Empregados no Estudo de Células e Tecidos .............. 33 Definição de Técnica Histológica .........................................................................................33 Técnicas para Análise do Material Histológico .......................................33 Técnica de Espalhamento ..................................................................33 Técnica de Estiraço..................................................................................33 Técnica de Esmagamento ..................................................................34 Corte Histológico ......................................................................................34 Decalque .........................................................................................................34 Montagem Total .........................................................................................34 Descrição das Etapas Envolvidas para Análise Histológica do Material no Microscópio Óptico ........................................................................................................................35 Técnicas de Coloração de Cortes Histológicos .................................. 36 Técnicas Citoquímicas ................................................................................................................ 38 Biomembranas ............................................................................................. 41 Definição e Aspectos Funcionais das Biomembranas ......................................... 41 Composição Lipídica e Organização Estrutural .....................................45 Fluidez e Assimetria das Bicamadas Lipídicas.......................................45 Composição Proteica ............................................................................................... 46 Carboidratos.....................................................................................................................47 Tipos de Junções Celulares ................................................................................................... 48 Interdigitações ............................................................................................................... 48 Desmossomo ................................................................................................................. 49 Junção Aderente (Zônula Aderente) ............................................................. 49 Junção Comunicante (GAP) ................................................................................. 49 Junção Compacta ....................................................................................................... 49 Junção Septada............................................................................................................ 50 Complexo Juncional ou Unitivo ........................................................................ 50 Disco Intercalar .............................................................................................................. 51 Citologia e Embriologia 9 LIVRO DIDÁTICO DIGITAL UNIDADE 01 Citologia e Embriologia10 INTRODUÇÃO A citologia é uma das áreas fundamentais da área das ciências biológicas e ciências da saúde, é através dela que obtemos um amplo conhecimento sobre a caracterização e o funcionamento das células, estas células trabalham de forma sincronizada e especializada e é desta forma queconstituem os tecidos e, consequentemente, os nossos órgãos. Você consegue entender a importância dessa pequena unidade que constitui o nosso organismo? Na citologia você pode atuar em pesquisas, na área acadêmica ou em laboratórios de análises clínicas. Atualmente existe boa procura de profissionais que possuam habilidade e experiência nas análises citológicas, isso mesmo! Você já se imaginou trabalhando nesse campo de atuação? Então, agora, através deste conhecimento inicial, você poderá buscar e ampliar seus conhecimentos nessa área e ser um profissional excepcional, mas vamos com calma. Nesta unidade você terá a oportunidade de conhecer sobre as características principais das células, identificar e compreender os mecanismos de observação das células e tecidos através da microscopia e iniciará seus estudos sobre a membrana plasmática! Será ao longo desta unidade letiva, portanto, que você vai mergulhar neste universo citológico! Bons estudos! Citologia e Embriologia 11 OBJETIVOS Olá. Seja muito bem-vindo à Unidade 1. Nosso propósito é auxiliar você no desenvolvimento das seguintes objetivos de aprendizagem até o término desta etapa de estudos: 1. Reconhecer os aspectos gerais, organização celular das células procarióticas e eucarióticas e os mecanismos envolvidos no seu funcionamento; 2. Entender a estrutura, funcionamento e diferenças das técnicas de microscopia; 3. Aprender os métodos empregados para o estudo das células e tecidos; 4. Compreender o papel da biomembrana e seus aspectos funcionais. Então? Preparado para uma viagem sem volta rumo ao conhecimento? Ao trabalho! Citologia e Embriologia12 Aspectos Gerais Da Estrutura Celular INTRODUÇÃO: Olá! Iniciaremos os nossos estudos com uma introdução sobre os aspectos gerais da estrutura celular. As células são os menores elementos que compõem os nossos tecidos, responsáveis pela estrutura e função de cada órgão que compõe o nosso organismo. Ao término deste capítulo você será capaz de entender como funciona a organização das células procarióticas e eucarióticas e de diferenciar a sua diversidade e semelhança entre ambos os tipos celulares. Isso será fundamental para o exercício de sua profissão. E então? Motivado para desenvolver essa competência? Então vamos lá. Avante! Aspectos Gerais da Estrutura Celular: Compreensão da Organização Estrutural de Células Procarióticas e Eucarióticas Vamos iniciar nossos estudos na área da citologia e conhecer um pouco das características e organização celular? As células são classificadas em dois tipos celulares primeiramente, essa classificação é oriunda da própria organização interna da célula. Esses dois grupos são chamados de células eucarióticas e procarióticas. Observe a figura 1. Citologia e Embriologia 13 Figura 1: Célula eucariótica x Célula procariótica Legenda: À direita um exemplo de célula eucariótica com a sua complexa organização, demonstrando suas principais organelas. À esquerda temos uma célula bacteriana como exemplo de célula procariótica, nota-se uma estrutura menos complexa, com o material genético exposto diretamente ao citosol. Fonte: adaptado de ALBERTS, Bruce et al. Biologia molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. As células eucarióticas são células que têm uma estrutura mais complexa e apresentam núcleo contendo o seu DNA, delimitado por membranas e possuindo organelas com diversas funções importantes para a vida da célula, o que veremos mais adiante. Já as células procariontes são células que possuem uma estrutura mais simples e o seu DNA encontra-se em contato direto com o citoplasma, não possuindo nenhuma estrutura que delimite esse espaço. Além dessas, existem muitas diferenças marcantes, observe o quadro 1, a seguir: Citologia e Embriologia14 Quadro 1: Comparação entre células eucariontes e procariontes Fonte: Adaptado de ALBERTS, Bruce et al. Biologia molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. A maioria das células procarióticas é pequena e simples na sua aparência externa e vive principalmente isolada ou independente; algumas, como as bactérias, encontram-se em comunidades organizadas de forma livre e não como organismos multicelulares. Essas células possuem normalmente seu formato esférico ou em forma de bastonete e medem poucos micrômetros em dimensão linear. Frequentemente apresentam uma capa protetora resistente, chamada de parede celular, abaixo da qual se encontra a membrana plasmática envolvendo um único compartimento citoplasmático contendo DNA, RNA, proteínas e as muitas moléculas pequenas necessárias à vida. Ao microscópio eletrônico, o interior dessa célula se parece com uma matriz de textura variável, sem nenhuma estrutura interna organizada discernível. As células procarióticas vivem em uma grande variedade de nichos e são Citologia e Embriologia 15 surpreendentemente variadas em suas capacidades bioquímicas — muito mais do que as células eucarióticas. As espécies organotróficas podem utilizar praticamente qualquer tipo de molécula orgânica como alimento, de açúcares e aminoácidos a hidrocarbonetos e gás metano. As espécies fototróficas captam energia luminosa de diferentes maneiras, algumas delas gerando oxigênio como produto secundário, outras não. As espécies litotróficas podem se alimentar de uma dieta simples de nutrientes inorgânicos, adquirindo seu carbono do CO2 e dependendo de H2S para suprir suas necessidades energéticas ou de H2, Fe2+ ou enxofre, ou qualquer um dentre outros compostos químicos que ocorram no ambiente (BROWN, 2013). As células eucarióticas possuem um envoltório nuclear, formando o núcleo, este núcleo protege o material genético (DNA) do próprio movimento intracelular. O citoplasma das células eucarióticas difere das procarióticas, sendo subdividido em compartimentos, aumentando a eficiência metabólica e energética, permitindo que atinja um amplo tamanho sem prejuízo ou alterações das suas funções. Essas células são encontradas nos protozoários, fungos, plantas e animais. Agora vamos conhecer a estrutura e função das células eucarióticas? Membrana Celular Delimitando a célula, há a membrana celular (ou plasmática), que mede de 9 a 10 nm de espessura (nas organelas, a membrana tem cerca de 7 nm) e, portanto, essa membrana não é visível a olho nu. Imagine a membrana plasmática como sendo as paredes de uma casa, essa estrutura serve para proteger e transportar substâncias do meio interno para o meio externo e vice-versa. Quando se observa essa estrutura ao microscópio eletrônico, ela se apresenta como uma estrutura trilaminar, ou seja, possui três lâminas: duas linhas escuras separadas por uma linha central clara, o que é designada unidade de membrana. A membrana celular é uma bicamada lipídica com proteínas, glicoproteínas, glicolipídios e proteoglicanos inseridos (BROWN, 2013). Ficou interessado? Temos um capítulo inteiro para explicar a organização e função dessa bela estrutura da célula. Citologia e Embriologia16 Citoesqueleto O citoesqueleto é responsável por estabelecer, modificar e manter a estrutura da célula, é o responsável pelo movimento da célula e pelo deslocamento das suas organelas internas; é constituído por microtúbulos, filamentos de actina e filamentos intermediários (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016a). Núcleo O núcleo, “o chefe da organização”, é o responsável pelo controle da célula, podemos imaginar que seja o cérebro da célula. Possuímos diferentes tipos celulares e o núcleo variará seu tamanho e forma mediante essas diferentes características celulares. Geralmente o núcleo da célula mede entre 5 e 10 µm, pode ser alongado, ovoide, esférico ou lobulado. O núcleo possui todo o material genético, o ácido desoxirribonucleico (DNA), o qual está enrolado em proteínas básicas; e as histonas, formando a cromatina. Dependendo do grau de condensação dessa proteína, elapode ser classificada em eucromatina (difusa e transcrita) e heterocromatina (condensada e geralmente inativa). O núcleo está presente quando a célula se encontra na interfase do ciclo celular (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016a). O núcleo é circundado pelo envoltório nuclear (ou carioteca), constituído por duas membranas separadas pelo espaço perinuclear. Em alguns momentos, as membranas fundem-se em poros delimitados por complexos proteicos, os complexos de poro. Eles medem de 100 a 125 nm de diâmetro e são constituídos por três conjuntos de anéis proteicos, filamentos citoplasmáticos, um transportador e uma cesta nuclear. É através deles que há o transporte de substâncias entre o núcleo e o citoplasma. A membrana externa do envoltório nuclear é ininterrupta e possui organelas associadas, como o retículo endoplasmático e os ribossomos. Essas organelas sintetizam proteínas transmembranas das membranas nucleares (BROWN, 2013). A membrana interna é associada à cromatina e à lâmina nuclear, uma camada de 80 a 100 nm, constituída principalmente pelos filamentos Citologia e Embriologia 17 intermediários e lâminas A, B e C, arranjados em uma rede. A lâmina nuclear está envolvida na organização nuclear e é muito importante nos processos de regulação do ciclo celular, diferenciação, expressão de genes e replicação e na transcrição do DNA. Serve de suporte para as membranas do envoltório nuclear e para a cromatina. O nucléolo é uma área não circundada por membrana, geralmente esférica, com 1 a 3 µm de diâmetro, onde ocorre a produção dos ribossomos. Nele o DNA ribossômico (DNAr) é transcrito em RNAr, e este é envolvido por proteínas para formar as subunidades ribossômicas (BROWN, 2013). Retículo Endoplasmático e Ribossomos O retículo endoplasmático é constituído por um sistema de membranas em forma de túbulos, vesículas e cisternas. Quando os ribossomos estão associados, o retículo endoplasmático é chamado de retículo endoplasmático rugoso (RER). Se não houver a presença de ribossomos, é dito retículo endoplasmático liso. Os ribossomos são pequenas partículas compostas de proteínas e RNAr. Cada ribossomo é composto por uma subunidade maior e uma subunidade menor, com valores de sedimentação de 60 S e 40 S, respectivamente. Sendo os ribossomos responsáveis pela síntese de proteínas, ele ficam livres no citoplasma quando sintetizam proteínas do citosol, do núcleo, das mitocôndrias e dos peroxissomos (BROWN, 2013). Quando estão processando proteínas, eles se associam a uma fita de RNAm, formando grupos em forma de círculos, espirais ou rosetas, denominados polissomos ou polirribossomos. Após o processamento das proteínas, elas são endereçadas para as demais organelas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016a). O retículo endoplasmático liso contém enzimas para a síntese de lipídios, inclusive dos fosfolipídios da membrana celular e dos hormônios esteroides, para o metabolismo do glicogênio e a destoxificação de certas drogas, inclusive álcool. Ele está, ainda, envolvido na formação e na reciclagem da membrana e, em algumas células, no sequestro de Cálcio, este último sendo importante para a contratilidade celular (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016a). Citologia e Embriologia18 Complexo de Golgi Quando se observa esta organela através da microscopia, nota-se um conjunto de três a dez cisternas achatadas e empilhadas. A cisterna mais próxima ao núcleo e ao retículo endoplasmático, situada no lado convexo da organela, é designada face cis (do latim cis, deste lado), enquanto a que se localiza na região oposta, voltada para o exterior, no lado côncavo, é a face trans (do latim trans, do outro lado). Antes da face cis do Golgi, há a rede cis do Golgi, formada por sáculos e túbulos interconectados que recebem vesículas do retículo endoplasmático e, após a face trans, há a rede trans do Golgi, de onde saem as vesículas de secreção, agora ficou um pouco complicado de entender? Vamos observar a Figura 2. Figura 2: Estrutura do Complexo de Golgi Legenda: Estruturalmente, a formação do complexo de Golgi se dá por bolsas membranosas achatadas e empilhadas. Suas partes externas são denominadas CIS e TRANS, e as internas, “cisternas intermediárias”. Fonte. By Alejandro Porto — Derivada de File: Camillo Golgi.jpg (Domínio público) y de File:Golgi apparatus (borderless version)-es.svg de Kelvinsong, CC BY-SA 3.0, Fonte: @commons. Citologia e Embriologia 19 As proteínas sintetizadas no retículo endoplasmático rugoso vão para o complexo de Golgi, onde são acrescentados resíduos de açúcares, um processo denominado glicosilação. Elas podem ser, ainda, sulfatadas, fosforiladas ou sofrerem processamento proteolítico, que as convertem em proteínas ativas. Lipídios também são glicosilados e sulfatados nessa organela. O Golgi realiza o empacotamento e a distribuição das macromoléculas para a secreção, para a membrana plasmática ou para outras organelas, ou seja, o complexo de Golgi é responsável pela preparação e distribuição das proteínas para as outras organelas celulares (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016a). Mitocôndrias As mitocôndrias evoluíram a partir de procariontes aeróbicos, as bactérias Eubacterium, que foram engolfadas por células eucarióticas primitivas. Essas organelas estão presentes em praticamente todas as células eucarióticas e são responsáveis pelo processo de obtenção de energia da célula. A forma e o tamanho delas variam, podendo ser esféricas, alongadas ou pleomórficas, com 0,5 a 1 µm de diâmetro e 1 a 10 µm de comprimento. Além da morfologia, a quantidade e a localização das mitocôndrias estão relacionadas à necessidade energética das células, sendo que são abundantes naquelas que demandam energia e são concentradas em regiões na célula onde a energia é requerida. As mitocôndrias são responsáveis pela produção de ATP através da oxidação de carboidratos, lipídios e aminoácidos. Além de gerar energia para as atividades da células, as mitocôndrias ainda regulam a concentração de certos íons no citoplasma, auxiliando a função do retículo endoplasmático liso. A mitocôndria apresenta duas membranas, sendo que a membrana interna se invagina nas cristas. O compartimento entre as duas membranas é o espaço intermembranoso. Limitada pela membrana interna, há a matriz mitocondrial (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016a). Citologia e Embriologia20 IMPORTANTE: As mitocôndrias não são encontradas nas hemácias, porque durante o amadurecimento da hemácia, ela perde todos os seus componentes por autofagia e, posteriormente, exocitose, adquirindo a famosa forma conhecida de célula bicôncava. Neste formato, ela aumenta sua superfície de contato e aprimora seu transporte de gases, especialmente o CO2, O2 e CO, devido à presença de íons de ferro, encontrados na hemoglobina, proteína especializada no transporte de gases na hemácia. VOCÊ SABIA? As mitocôndrias possuem características muito comuns com células procarióticas, alguns pesquisadores defendem que as mitocôndrias são oriundas de células procarióticas através da endossimbiose. Lisossomos Os lisossomos são conhecidos como organelas “digestórias”, porque realizam a digestão de componentes celulares, são pequenas organelas membranosas (0,2 a 0,5 µm) com [enzimas hidrolíticas], como, por exemplo, fosfatases, proteases, nucleases, glicosidases, lipases, fosfolipases e sulfatases. Essas enzimas são ativas em pH ácido, e esse pH é mantido por Hidrogênio (H+) e ATPases que bombeiam H+ para a organela. O material a ser digerido pode ser internalizado pela endocitose (processo ativo em que as células absorvem material através da membrana celular) no caso de macromoléculas ou pela fagocitose (processo pelo qual a célula usa a sua própria membrana para englobar partículas grandes) se são partículas grandes ou micro-organismos. Organelas velhas ou em desuso também são digeridas pelos lisossomos e esse processoé denominado autofagia. Enzimas lisossômicas podem Citologia e Embriologia 21 ser liberadas pelas células para realizar digestão extracelular, como é o caso dos osteoclastos na remodelação do osso (BROWN, 2013). NOTA: É um conjunto de proteínas que reconhecem especificamente regiões de determinadas moléculas e, na presença da água, ocorre a quebra (clivagem) em moléculas menores. Peroxissomos A função dos peroxissomos é bem semelhante à dos lisossomos, porém algumas peculiaridades estão presentes no citoplasma de quase todas as células eucarióticas, mas normalmente são encontradas em maior quantidade no fígado e nos rins. São organelas membranosas esféricas ou ovoides, medindo 0,1 a 0,5 µm, com uma matriz granular fina e, em muitas espécies, com um depósito cristalino. São as organelas responsáveis principalmente pelo armazenamento das enzimas citoplasmáticas diretamente relacionadas com o metabolismo do peróxido de hidrogênio, que é uma substância tóxica para as nossas células. Essa organela, portanto, tem a capacidade de degradar compostos tóxicos para a célula e transformá-los em compostos menos tóxicos. Quando há a oxidação dos substratos orgânicos nos peroxissomos, há a retirada de átomos de hidrogênio que são combinados com o O2, produzindo H2 O2 (peróxido de hidrogênio). Essa substância oxidante é prejudicial à célula e é logo degradada pela enzima catalase em água e oxigênio (2H2 O2 → 2H2 O + O2). A catalase pode também utilizar o oxigênio do peróxido de hidrogênio (transformando-o em água) para oxidar diversas substâncias, como o álcool e medicamentos, contribuindo, assim, para a destoxificação da célula (BROWN, 2013) . Citologia e Embriologia22 Diversidade e Semelhança Entre as Células A diversidade celular é de extrema importância para a existência da vida, é importante para a construção, manutenção e regulação dos organismos vivos. Os organismos vivos podem se diferenciar através de diferentes vias metabólicas, estruturas celulares distintas ou localizações específicas, mas a diversidade celular é o que garante o perfeito funcionamento da vida. Como vimos anteriormente, as células são as menores estruturas vivas que estabelecem um conjunto de relações e divisões de trabalho para que os organismos funcionem como um todo; promovem o funcionamento dos tecidos, órgãos e estruturas e, por isso, possuem formas e tamanhos diferentes; são capazes de se adaptar com relação à sua morfologia e função e isso pode ocorrer desde um protozoário até uma célula humana. O tamanho e a forma da célula estão relacionados à sua função e são determinados por fatores extrínsecos e intrínsecos, como, por exemplo, pressões externas, organização do citoesqueleto, quantidade de citoplasma e de organelas e acúmulo de produtos de reserva ou secreção. Veja o exemplo, nosso organismo é revestido por células epiteliais, quando se observa no microscópio, nota-se que essas células epiteliais são geralmente poliédricas, ou seja, com várias faces, uma característica geral desse tipo celular. Quando observamos que a largura e o comprimento da célula são maiores que a sua altura, a célula é dita pavimentosa. Quando a altura é igual à largura e ao comprimento, é denominada cúbica. Quando a altura da célula é maior que a sua largura e o seu comprimento, a célula é colunar (cilíndrica ou prismática). As células pavimentosas facilitam a passagem de substâncias, como ocorre com as células dos vasos sanguíneos (endotélio). As células cúbicas e colunares têm a altura aumentada pela maior presença de organelas para exercer atividade de secreção, absorção ou transporte de íons; observe a Figura 3. Citologia e Embriologia 23 Figura 3 : Tipos de epitélio Legenda: Tipos de epitélio e sua caracterização. Fonte: Adaptado de: Junqueira & Carneiro. Histologia Básica. 2017. O núcleo geralmente reflete a morfologia da célula, pois seu maior eixo é paralelo ao eixo longitudinal da célula. Normalmente não se observa a membrana plasmática celular, por ser muito fina não é possível sua observação num microscópio convencional de luz. Utilizando o núcleo como parâmetro, é possível ter uma ideia da forma da célula pelo núcleo. Essa dica não pode ser utilizada para todos os tipos celulares, pois existem células que retêm seus produtos de secreção ou de reserva e a visualização do núcleo acaba ficando comprometida pela presença dessas substâncias, sendo o caso da célula caliciforme do intestino, que sintetiza e armazena glicoproteínas. No tecido conjuntivo, observa-se uma ampla variabilidade de células e, consequentemente, formas celulares, isso ocorre por conta das mudanças na morfologia que acompanham o estado fisiológico do organismo. Por exemplo, as células adiposas, inicialmente fusiformes, adquirem uma forma esférica com o armazenamento de lipídios e, no tecido adiposo, por causa da compactação, podem ser poliédricas. As células musculares têm uma maior constância na morfologia, sendo adaptadas à atividade contrátil. São alongadas: fusiformes ou cilíndricas e, quando se contraem, promovem o encurtamento do tecido. Citologia e Embriologia24 SAIBA MAIS: Quer se aprofundar nesse tema? Observar a diversidade do formato e especialização das células? Recomendamos o acesso à seguinte fonte de consulta e aprofundamento: Atlas de histologia online, acessível pelo link: https://bit. ly/3kgcukk e https://bit.ly/3ncD8MJ RESUMINDO: E então? Gostou do que lhe mostramos? Aprendeu mesmo tudinho? Agora, só para termos certeza de que você realmente entendeu o tema de estudo deste capítulo, vamos resumir tudo o que vimos. Primeiramente você deve ter aprendido que os organismos vivos podem ser classificados mediante as suas características celulares, portanto podemos classificar as células em dois grandes grupos: as células procarióticas e as eucarióticas. As células procarióticas são células simples e sua principal característica é não possuir membranas internas celulares que possam organizar e separar o material nuclear do resto das organelas. Já as células eucarióticas possuem um sistema robusto de organização celular e possuem diversas organelas responsáveis por manterem as células vivas. Com relação às estruturas e organelas celulares, você foi capaz de entender que células eucarióticas possuem: membrana citoplasmática, que é responsável por delimitar o espaço celular e fazer transporte do meio interno para o meio externo e vice-versa; o citoesqueleto, que é responsável por manter a estrutura celular; o núcleo, que é responsável pela organização de todos os processos celulares, “o chefe das operações”; o retículo endoplasmático e os ribossomos, que são responsáveis pelo processamento de proteínas; e o complexo de Golgi, que é responsável pela modificação e distribuição das proteínas para as organelas correspondentes. https://bit.ly/3kgcukk https://bit.ly/3kgcukk https://bit.ly/3ncD8MJ Citologia e Embriologia 25 Vimos, ainda, a organela responsável pela síntese de energia celular, chamada de mitocôndria; e os desintoxicadores do organismo, os lisossomos e peroxissomos. Ufa! Quanta coisa nós vimos! Mas calma, não terminamos por aí! Finalizamos com a diversidade e semelhança entre as células, observamos que a diversidade e a caracterização celular são cruciais para os organismos vivos e que as diferenças e semelhanças é que fazem as células serem especiais, possuírem funções especializadas e constituírem órgãos diferentes. Agora você é capaz de reconhecer os aspectos gerais, organização celular das células procarióticas e eucarióticas e os mecanismos envolvidos no seu funcionamento. Espero que vocês tenham gostado! E vamos em frente! Citologia e Embriologia26 Conceitos de Microscopia Agora que você aprendeu sobre a constituição das células eucarióticas e procarióticas, você deve estar se perguntando como é possível a identificação e visualização de todasessas estruturas!? É possível graças à criação do microscópio. Acredita-se que o microscópio tenha sido inventado no final do século XVI por dois holandeses fabricantes de óculos, mas somente o neerlandês Antonie Van Leeuwenhoek tenha sido o primeiro a fazer observações microscópicas de materiais biológicos (PICULO, 2014). O objetivo da microscopia é a obtenção de imagens ampliadas de um objeto, em que seja possível visualizar estruturas que não são possíveis a olho nu. Para ampliação do material a ser observado, podemos utilizar uma lupa ou microscópio estereoscópico, seguida do microscópio óptico, que ilumina o objeto com luz visível ou, ainda, luz ultravioleta. O microscópio óptico, amplamente utilizado na área das ciências, possui um limite máximo de resolução. Esse limite é estabelecido pelos efeitos de difração devido ao comprimento de onda da radiação incidente. Podemos dizer que a imagem microscópica é caracterizada por três parâmetros: aumento, resolução e contraste (TANG, 2017). Vamos conhecer os componentes do microscópio? Componentes do Microscópio Óptico e suas Funções Os microscópios permitem a observação da célula e da sua estrutura pelo aumento proporcionado através das suas lentes. O microscópio de luz é composto por uma parte mecânica, que serve de base; uma parte óptica, que amplia o objeto visualizado; e uma fonte de iluminação, que consiste na luz comum, o que justifica o seu nome, observe a Figura 4. Citologia e Embriologia 27 Figura 4: Microscópio óptico Legenda: Componentes do microscópio de luz: 1 - oculares; 2 - tubo (ou canhão); 3 - braço; 4 - parafuso que fixa o tubo; 5 - botão que regula a intensidade luminosa; 6 - interruptor; 7 - parafuso micrométrico; 8 - parafuso macrométrico; 9 - parafuso do charriot (movimento lateral); 10 - parafuso do charriot (movimento anteroposterior); 11 - diafragma do campo luminoso; 12 - suporte da lente condensadora; 13 - alavanca do diafragma do condensador; 14 - lente condensadora (ou condensador); 15 - parafusos de centralização; 16 - platina (ou mesa); 17 – objetivas; e 18 - revólver. Fonte: Carl Zeiss Microscopy. Axiostar transmitted-light microscope — operating manual. Göttingen, 1999. n. B 40-031. p. 1.2. 1. Lentes Oculares: posicionam-se à frente dos olhos do observador e ampliam a imagem formada pelas lentes objetivas. 2. Tubo ou canhão: suporte das oculares. 3. Braço: interliga a base ao conjunto de lentes do microscópio. É utilizado quando se quer mudar o equipamento de lugar. 4. Parafuso que fixa o tubo: este parafuso permite que o tubo não deslize ou fique frouxo. Citologia e Embriologia28 5. Botão que regula a intensidade luminosa: o botão regula a intensidade da luz. 6. Interruptor: serve para desligar e ligar o microscópio. 7. Parafuso micrométrico: utilizado para ajuste fino do foco, a partir da objetiva de 10x. 8. Parafuso macrométrico: move a platina para cima e para baixo, para o ajuste do foco na objetiva de 4x. 9. Parafuso do charriot (movimento lateral): serve para prender e auxiliar na função de movimentação lateral do charriot. 10. Parafuso do charriot (movimento anteroposterior): serve para prender e auxiliar na função de movimentação anteroposterior do charriot. 11. Diafragma do campo luminoso: controla a intensidade da luz projetada sobre a lâmina. 12. Suporte da lente condensadora: serve para manter a parte óptica. 13. Alavanca do diafragma do condensador: permite regular a intensidade da luz que incide no campo de visão do microscópio. 14. Lente condensadora (ou condensador): concentra o feixe de luz para melhor iluminação e visualização do material. 15. Parafusos de centralização: servem para fixar o corpo do microscópio. 16. Platina (ou mesa): é uma plataforma que suporta a lâmina. 17. Objetivas: ampliam a imagem formada pela luz que atravessa o material corado interposto entre lâmina e a lamínula. Ampliam as estruturas 4, 10, 40 e 100x. 18. Revólver: segura as lentes objetivas e pode ser girado facilmente para mudar a lente objetiva desejada. Desde sua invenção, no século XVII, os microscópios passaram por constantes evoluções que os tornaram mais potentes e precisos. Tecnologias ópticas especiais foram desenvolvidas para proporcionar uma observação mais clara e reveladora acerca da estrutura observada. Os aprimoramentos foram aplicados, principalmente, aos sistemas de Citologia e Embriologia 29 iluminação e nos tipos de luz que atravessam os espécimes. Atualmente, existe uma grande variedade de tipos de microscópio para diferentes tipos de aplicações, aqui nós vamos abordar a microscopia eletrônica de transmissão e a microscopia eletrônica de varredura. Microscopias Especiais Os microscópios pertencem, basicamente, a duas categorias: luminoso (ML) e eletrônico (ME). As diferenças estão na radiação utilizada e na maneira como ela é refratada. A microscopia de luz se utiliza da radiação de ondas luminosas, sendo esta refratada através de lentes de vidro. O campo microscópico (ou a área observada) aparece brilhantemente iluminado e os objetos estudados se apresentam mais escuros. Geralmente, os microscópios desse tipo produzem um aumento útil de, aproximadamente, 1.000 vezes. Já na microscopia eletrônica, a radiação empregada é um de feixe de elétrons, sendo ele refratado por meio de lentes eletrônicas. O microscópio eletrônico produz aumentos úteis de 200.000 a 400.000 vezes, sendo seu poder resolvente cerca de 100 vezes maior que o do microscópio de luz. Em termos básicos, classificamos o microscópio eletrônico em dois tipos: de transmissão e de varredura (GALLETI, 2003). Descrição dos Princípios Básicos de Microscopia Eletrônica de Transmissão e Varredura As técnicas de microscopia como a microscopia eletrônica de transmissão (MET) e a microscopia eletrônica de varredura (MEV) utilizam feixes de elétrons como fonte de “iluminação” sobre o espécime a ser ampliado. Essa incidência de elétrons produz diversas interações com as moléculas da amostra, tornando-as passíveis de serem coletadas, fazendo com que essas técnicas possuam a vantagem de oferecerem um alto grau de detalhamento e caracterização das estruturas, que os microscópios convencionais ópticos não possuem. Nos próximos tópicos você compreenderá a diferença entre MET e MEV. Citologia e Embriologia30 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) No MET, o feixe de elétron é focalizado no material através de eletromagnetos análogos às lentes do condensador do microscópio óptico. Os tecidos são corados com metais pesados (urânio ou chumbo) que precipitam nas membranas lipídicas, fazendo com que os elétrons percam parte da sua energia cinética à medida que interagem com o tecido. Os elétrons que deixam os tecidos estão sujeitos aos campos magnéticos de muitos eletromagnetos adicionais, que focalizam o feixe numa placa fluorescente. À medida que os elétrons alcançam a placa, sua energia cinética é convertida em pontos luminosos. É feito um registro permanente da imagem resultante, através da substituição de um filme sensível ao elétron no local da placa fluorescente, com a produção de um negativo a partir do qual pode ser impressa uma fotomicrografia em preto e branco (GALLETI, 2003), resultado da imagem obtida durante a microscopia. Observe a Figura 5. Figura 5: Foto de uma Microscopia eletrônica de transmissão — MET Legenda: Observação de nanotubos em diferentes aumentos. Fonte: https://bit.ly/35hNXXR Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), diferentemente da MET, é utilizada para observar a superfície de um espécime sólido (ao invés de cortes), proporcionando uma imagem tridimensional. O material é preparado com uma camada de metal pesado, como ouro ou paládio, depositada na sua superfície. Conforme o feixe de elétrons varre a Citologia e Embriologia 31 superfície do material, algunsse refletem (elétrons de dispersão) e outros são ejetados (elétrons secundários) a partir da cobertura do metal pesado. Esses elétrons são capturados por detectores, interpretados, coletados e mostrados em um monitor com uma imagem tridimensional (PICULO, 2014). A imagem pode ser fotografada ou digitalizada; observe a Figura 6. Figura 6: Foto de uma Microscopia eletrônica de varredura — MEV Legenda: Imagem por microscopia eletrônica de varredura de cartilagem articular de fêmur de camundongo — aumento de 800x. Fonte: https://bit.ly/3eJBJu2 RESUMINDO: Agora finalizamos o conteúdo sobre microscopia. Espero que você tenha adorado o conteúdo apresentado! Agora vamos recapitular alguns pontos importantes que vimos durante este capítulo? Inicialmente, foi demonstrado a você o objetivo do microscópio, certo? Os microscópios possuem como objetivo a ampliação de qualquer objeto que não conseguimos olhar a olho nu, correto? Usualmente, na área das ciências, utilizamos o microscópio óptico, que possui características específicas, como as peças que o compõem. Você foi capaz de perceber https://bit.ly/3eJBJu2 Citologia e Embriologia32 que para o correto funcionamento do microscópio é necessário o conhecimento da função das peças do microscópio. Além da microscopia óptica, através do desenvolvimento da ciência, foi necessária a evolução também da microscopia e para isso foram criados diversos modelos de microscópio, mas aqui nós demonstramos duas variáveis de microscopia: a microscopia óptica e a microscopia eletrônica. A microscopia eletrônica possui um aumento de 1.000 vezes a mais que a microscopia óptica! Fantástico isso! E atualmente contamos com dois tipos de microscopia eletrônica: a microscopia eletrônica de transmissão (MET) e a microscopia eletrônica de varredura (MEV). Esses dois tipos de microscopia variam com relação ao seu processamento de imagem e possuem características distintas. Na MET é possível observar com mais perfeição as rugosidades e profundidade de algumas estruturas celulares, no entanto, a MEV nos mostra em aspecto tridimensional a superfície das amostras, você conseguiu compreender as diferenças? Agora você é capaz de reconhecer a estrutura, funcionamento e caracterizar as diferenças das técnicas de microscopia. Já que você conheceu o principal equipamento para análise das estruturas biológicas, vamos conhecer os métodos empregados no estudo das células e tecidos? Citologia e Embriologia 33 Métodos Empregados no Estudo de Células e Tecidos Definição de Técnica Histológica INTRODUÇÃO: A histologia é o ramo da anatomia que estuda os tecidos animais e vegetais. Tanto a zoologia quanto a botânica apresentam nomenclaturas especiais. A técnica histológica visa à preparação dos tecidos destinados ao estudo à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado (TANG, 2017). Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes, mas para isso são necessárias técnicas específicas de preparação desses tecidos, vamos conhecer cada uma delas! Técnicas para Análise do Material Histológico As técnicas prévias à análise do material biológico podem ser: espalhamento, estiraço, esmagamento, corte histológico, decalque e montagem total. Técnica de Espalhamento A técnica de espalhamento é uma técnica simples. Consiste em espalhar o material biológico a ser observado em uma lâmina de vidro; esse material, por vezes, deve ser impregnado com algum corante temporário e após isso, ser colocado em uma lamínula para a observação no microscópio. Técnica de Estiraço Também chamada de técnica de extensão, é muito utilizada na análise de sangue. Consiste na extensão de uma fina camada de Citologia e Embriologia34 um material biológico, normalmente o sangue, sobre uma lâmina de microscopia que, após a coloração, é levada ao microscópio para se realizar, então, a análise. Técnica de Esmagamento Esta técnica geralmente é utilizada para materiais que têm as células relativamente bem unidas, mas que, por esmagamento, se separam entre a lâmina e a lamínula. Em alguns casos, o material pode ser ligeiramente fervido para que as células se separem com maior facilidade. Como exemplo, partes vegetais macias, como pontas de raízes e anteras, podem ser fervidas por alguns minutos em corante e esmagadas entre lâmina e lamínula. Corte Histológico Esta técnica geralmente é utilizada quando o material que se deseja estudar é formado por células firmemente unidas entre si. Para tanto, torna-se necessário o corte em fatias finas o suficiente para que a luz do microscópio possa atravessá-las. É possível, em alguns casos, cortar materiais firmes e rígidos, tais como folhas, caules e raízes de plantas, manualmente, com uma lâmina de barbear, e observá-los a fresco, isto é, ainda vivos. Já materiais de origem animal, e muitos materiais vegetais, são geralmente moles demais para permitir cortes manuais finos e a observação a fresco é praticamente impossível. Decalque A técnica de decalque baseia-se na obtenção de núcleos da superfície de corte de um órgão de consistência mole, através do contato direto dessa superfície com uma lâmina de microscopia. Com essa técnica os núcleos ficam inteiros sobre a lâmina de vidro, o que é útil para o estudo da quantidade de DNA, interações moleculares entre complexos DNA/proteína e análise de imagem dos fenótipos nucleares. Montagem Total Citologia e Embriologia 35 A técnica de montagem total consiste no corte do material biológico. Após o corte, deve-se lavá-lo e, diante da lavagem, é necessário mantê- lo em soluções conservadoras para a coloração e montagem do material para a análise microscópica. Veremos essa técnica um pouco mais detalhada no próximo tópico. Descrição das Etapas Envolvidas para Análise Histológica do Material no Microscópio Óptico Segue um passo a passo para a observação de materiais ao microscópio de luz. São necessárias (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2017): 1. Coleta: remoção de pequenas partes do órgão, com auxílio de bisturi, tesoura ou pinça; 2. Fixação: etapa que utiliza procedimentos físicos ou químicos para imobilizar as substâncias constituintes das células e dos tecidos, fornecendo maior resistência para suportar as demais etapas. Além disso, os fixadores, como o formol, retardam os efeitos pós-morte do tecido, mantendo sua arquitetura normal; 3. Desidratação: o principal agente desidratante utilizado no preparo histológico é o etanol. Nesta etapa, utilizam-se concentrações crescentes de etanol (50, 70, 80, 90, 95, 100%) para retirar todo o fixador e água presentes no tecido, preparando-o para os banhos subsequentes com xilol; 4. Clarificação: consiste em impregnar a peça em um solvente de parafina (xilol, benzol ou toluol). Após sucessivos banhos desse solvente, o tecido adquire aparência amarelada e translúcida, daí o nome dado a essa etapa. Com a retirada de todo o etanol, a peça está pronta para a inclusão; 5. Inclusão: consiste na impregnação do tecido com uma substância de consistência firme (sendo a parafina a mais utilizada nesse procedimento) que permita seccioná-lo em camadas delgadas. Essa etapa geralmente é precedida pela desidratação do tecido por adição Citologia e Embriologia36 de crescentes concentrações de álcool etílico. Após a desidratação, o álcool é substituído por xilol (solvente orgânico que é miscível tanto no álcool quanto na parafina), que deixa os tecidos transparentes ou translúcidos. Em seguida, os fragmentos são colocados em parafina derretida e quente (em torno de 58oC). O calor causa a evaporação do solvente e preenche os espaços vazios existentes nos tecidos com a parafina; 6. Microtomia: quando os fragmentos de parafina esfriam, eles se tornam rígidose podem ser levados para secção por uma lâmina de aço, de modo a fornecer sucessivos cortes finos e uniformes. Após essa etapa, os cortes são coletados com pinça e colocados sobre lâminas de vidro previamente limpas, entretanto ainda não se podem evidenciar quaisquer estruturas sem que ocorra a coloração dos cortes; 7. Coloração: a grande maioria dos tecidos é incolor e exige uso de corantes histológicos que evidencie as estruturas. Os componentes dos tecidos se coram com corantes básicos (basófilos) ou ácidos (acidófilos). Dentre todos os corantes, a combinação de hematoxilina e eosina (HE) é a mais comumente usada; 8. Montagem da lâmina: feita com uma lamínula sobre os cortes, utilizando resinas sintéticas ou Bálsamo do Canadá. Essa vedação ajuda a preservar o material. Técnicas de Coloração de Cortes Histológicos A coloração consiste numa etapa muito importante para a visualização das estruturas do tecido. Normalmente são utilizados corantes hidrossolúveis, sendo necessário, desse modo, a remoção da parafina da peça que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que permanece na lâmina de vidro (MONTANARI, 2016). Existem muitos tipos de corantes, mas de um modo geral eles podem ser agrupados em três classes distintas: (observe as Figuras 6,7 e 8): • Corantes que diferenciam os componentes ácidos e básicos das células (exemplo — Figura 6); Citologia e Embriologia 37 • Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular (exemplo — Figura 7); • Sais metálicos que precipitam nos tecidos (exemplo — Figura 8). Figura 7: Coloração do jejuno Legenda: Fotomicrografia do jejuno do ser humano. (1) mucosa, (2) submucosa, (3) vilosidades e (4) criptas intestinais. Fonte: Adaptado de Ross, Michael H.; Pawlina, Wojciech; Barnash, Todd A — Atlas de Histologia Descritiva, 2012. Citologia e Embriologia38 Figura 8: Célula cardíaca Legenda: Fotomicrografia do corte transversal da parede do coração com H&E, evidenciando o citoplasma em rosa e o núcleo em roxo. Fonte: Adaptado de Ross, Michael H.; Pawlina, Wojciech; Barnash, Todd A — Atlas de Histologia Descritiva, 2012. Técnicas Citoquímicas A citoquímica estuda a localização intracelular das diversas substâncias que compõem as células. Pode ser aplicada em nível de microscopia óptica e de microscopia eletrônica. No primeiro caso, o produto da reação citoquímica deve ser corado; e no segundo deve dispersar os elétrons, isto é, possuir “elétron–densidade”. Algumas reações citoquímicas seguem a lei de Lambert-Beer, quer dizer, produzem nas células e tecidos uma intensidade de cor proporcional à concentração da substância a ser estudada. Através desse tipo de técnica podemos Citologia e Embriologia 39 analisar: DNA, RNA, catecolaminas, proteínas, polissacarídeos e enzimas (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2017). Através desse princípio da técnica de citoquímica, podemos trabalhar com a técnica de microscopia de fluorescência e a imunocitoquímica. A microscopia de fluorescência possui a propriedade de emitir luz quando excitada por radiação ultravioleta. Alguns constituintes celulares, como a riboflavina (vitamina B), a vitamina A e as porfirinas, são fluorescentes e podem ser identificados e localizados por meio da microscopia de fluorescência. Já a técnica de imunocitoquímica permite o estudo da localização intracelular de proteínas específicas, ela localiza com precisão um determinado tipo de molécula proteica, excluindo todas as outras existentes na célula (CAPUTO; GITIRANA; MANSO, 2017). RESUMINDO: Dando continuidade aos nossos estudos citológicos, neste momento você acabou de conhecer os métodos empregados no estudo de células e tecidos, correto? É incrível a quantidade de análises que podemos realizar através da utilização do método correto para análise microscópica. Você conseguiu compreender o conteúdo abordado? Vamos rever os pontos principais do capítulo apresentado! Primeiramente definimos o que é a histologia neste universo da citologia e conhecemos alguns dos principais métodos empregados no estudo de células e tecidos, você pode perceber que existem diversas maneiras de se trabalhar com o material, dependendo de suas características estruturais, você pode realizar técnicas como: técnica de espalhamento, estiraço, esmagamento, corte histológico, decalque e finalizar com a montagem total. Ah, sim, a montagem total! A montagem total é a técnica de preparação das amostras para a histologia no “total”, nós vimos no decorrer do capítulo que consiste em: coletar o material, desidratá-lo (pois todo material biológico possui água e ela pode interferir na análise), clarificá-lo, realizar a inclusão e, posteriormente, vem a microtomia (quando o material parafinizado é cortado em tiras Citologia e Embriologia40 muito fininhas) para que, então, ocorra a coloração. A coloração é um dos aspectos fundamentais desse protocolo, pois se ocorrer algum erro, não conseguiremos ver aquelas lindas imagens demonstradas acima! Após a coloração, é realizada a montagem da lâmina para observação no microscópio, é um trabalho árduo para essas lâminas serem analisadas, não acham? Finalizamos o conteúdo demonstrando que existem técnicas baseadas nas características químicas da célula e que também é passível de observação através da microscopia, como a citoquímica — e esta, associada com processos imunológicos, pode ser realizada com o auxílio da imunofluorescência e imunohistoquímica. Neste momento, você é capaz de reconhecer os métodos empregados para o estudo das células e tecidos e reconhecer os seus aspectos gerais. Agora vamos adentrar de forma mais específica num componente celular? Vamos em frente! Citologia e Embriologia 41 Biomembranas Definição e Aspectos Funcionais das Biomembranas INTRODUÇÃO: As membranas presentes nos seres vivos são denominadas biomembranas. As biomembranas são fluidos bidimensionais, constituídos por uma bicamada lipídica, com espessura média de 5 nm e moléculas associadas, como proteínas, lipídios e carboidratos. A união das bicamadas lipídicas é estabelecida através das interações hidrofóbicas entre os lipídeos que constituem as biomembranas. Cerca da metade da estrutura da membrana é constituída por lipídeos. Estima-se, também, que cerca de trinta por cento de todas as proteínas celulares estejam associados às biomembranas (BROWN, 2013). As biomembranas são responsáveis pela compartimentalização celular, observe a Figura 9. Figura 9: Estrutura da biomembrana plasmática Legenda: Composição da biomembrana plasmática. Fonte: Adaptado de Lodish et al. Biologia Celular e Molecular, 2014. Citologia e Embriologia42 A membrana plasmática estabelece o limite celular da célula. Imagine uma parede que separa o conteúdo intracelular do meio externo e se encontra em todos os tipos celulares. As membranas internas formam o sistema de endomembranas. Tais membranas são responsáveis pela compartimentalização intracelular, delimitando as organelas e, consequentemente, os processos celulares que ocorrem em cada uma delas. O sistema de endomembranas é encontrado somente em células eucarióticas. Uma das características mais marcantes das biomembranas é a sua permeabilidade seletiva, ou seja, ela consegue selecionar a partir das características as moléculas que entrarão ou sairão da célula. Apenas pequenas moléculas não carregadas podem se difundir livremente pela bicamada lipídica. De forma geral, a bicamada lipídica é permeável aos gases, como o dióxido de carbono (CO2), o óxido nítrico (NO) e o oxigênio (O2), por exemplo; às pequenas moléculas de caráter hidrofóbico, como os hormônios esteroides; ou moléculas pequenas polares, mas sem carga, como o etanol. A bicamada é muito pouco permeável à água e praticamente impermeável aos íons e às moléculas maiores, polares ou não, tais como a glicose, lactose,frutose, aminoácidos e nucleotídeos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016b). Você percebeu que essa estrutura possui a capacidade de selecionar as moléculas, mas, então, como ocorre o transporte dessas moléculas pela membrana? Esse é o papel de algumas proteínas da membrana, elas são responsáveis por fazer o transporte de íons e moléculas através das bicamadas lipídicas, e isso é feito pelas proteínas chamadas de multipasso. O transporte através das biomembranas é classificado de acordo com a necessidade energética, o quanto de “força” é preciso para que ocorra o processo de realização desse transporte? Assim, temos dois tipos de transporte: passivo e ativo (observe a Figura 10). Citologia e Embriologia 43 Figura 10: Processo de transporte — Membrana Plasmática Legenda: Diagrama ilustrando os tipos de processos de transporte via membrana plasmática (transportadores e proteínas de canal). Fonte: Adaptado de ALBERTS, Bruce et al. Biologia molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. No transporte passivo, como sugere o nome, não há gasto de energia, uma vez que as moléculas ou íons são transportados do compartimento de maior concentração (da molécula ou íon) para o compartimento de menor concentração, ou seja, esse tipo de transporte ocorre a favor do gradiente de concentração e pode ou não ser mediado por proteínas da membrana. Quando o transporte não é realizado por proteínas da membrana, denominamos difusão simples e quando ele é mediado por proteínas, ele é denominado difusão facilitada. Mas porque esse nome no processo, difusão facilitada? Como diz o nome, alguém está facilitando esse processo e quem facilita, novamente, são as nossas proteínas. A difusão facilitada pode ser mediada por proteínas carreadoras, como, por exemplo, a proteína GLUT-4, que é o transportador de glicose encontrado no tecido adiposo e muscular cardíaco e esquelético; ou por canais iônicos, que, como o nome sugere, são proteínas envolvidas no transporte de íons através das biomembranas, íons estes que apresentam uma distribuição bastante característica entre o meio extra e intracelular (MONTANARI, 2016). Citologia e Embriologia44 Os canais iônicos podem ser regulados de diversas formas: por interação com ligantes extracelulares; por interação com ligantes intracelulares; por meio de alterações na voltagem da membrana; ou mecanicamente (estiramento da membrana). A velocidade do transporte na difusão facilitada depende de uma série de fatores. O caráter químico da molécula a ser transportada é determinante. Para moléculas sem carga, a velocidade de transporte é diretamente proporcional ao gradiente de concentração da molécula, ou seja, quanto maior a diferença na concentração da molécula entre os dois compartimentos separados pela membrana, maior será a velocidade do transporte. No entanto, para íons ou moléculas carregadas, dois fatores são decisivos: o gradiente de concentração e o potencial da membrana, que juntos constituem o gradiente eletroquímico (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016b). Moléculas carregadas positivamente, por exemplo, são atraídas com maior velocidade para um compartimento com predominância de cargas negativas. No transporte ativo, as moléculas ou íons são transportadas contra o seu gradiente de concentração. Esse tipo de transporte requer um gasto energético, uma vez que promove a diminuição da entropia e, consequentemente, o aumento da energia livre do sistema. O transporte ativo pode ser dirigido por hidrólise de ATP (trifosfato de adenosina), sendo classificado como Transporte Ativo Primário, ou pode ser dirigido por gradiente eletroquímico, denominado Transporte Ativo Secundário, uma vez que o gradiente eletroquímico utilizado nesse tipo de transporte é gerado por um transporte ativo primário dependente do ATP (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016b). As proteínas que realizam o transporte ativo primário são conhecidas como ATPases de membrana ou Bombas. Dentre essas proteínas podemos destacar: a) a Na+K + -ATPase, que, para cada molécula de ATP hidrolisada, realiza o transporte de 3 íons Na+ para o meio extracelular e 2 íons K+ para o interior da célula; b) as proteínas da superfamília ABC (do inglês ATP-binding cassetes), que constituem a maior família de proteínas de membrana, sendo encontradas desde bactérias até seres humanos, e estão envolvidas no transporte de uma série de moléculas, Citologia e Embriologia 45 desde hormônios, nucleotídeos, pequenos peptídeos até xenobióticos; c) a bomba de Ca2 da membrana plasmática e da membrana do retículo sarcoplasmático, responsáveis pelos baixos níveis citosólicos deste íon; d) a bomba de próton da membrana lisossomal, que mantém o pH ácido desta organela (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016b). No caso dos transportadores secundários, destacamos os trocadores iônicos, o cotransportador Glicose-Na+, responsável pela absorção de glicose no trato digestório, e os cotransportadores de aminoácidos e Na+. Composição Lipídica e Organização Estrutural As biomembranas são compostas por lipídeos, proteínas e carboidratos ligados covalentemente às proteínas (glicoproteínas ou proteoglicanos) ou lipídeos (glicolipídios). Os lipídeos que constituem a membranas biológicas são moléculas anfipáticas, ou seja, apresentam tanto um caráter hidrofílico (afinidade pela água — caráter polar) quanto hidrofóbico (aversão à água — caráter apolar). A composição das biomembranas varia imensamente de acordo com o tipo celular e com o compartimento intracelular delimitado por elas. Células vegetais e organismos procariotos, por exemplo, não apresentam colesterol na constituição das suas membranas. Fluidez e Assimetria das Bicamadas Lipídicas As bicamadas lipídicas são assimétricas, apresentando uma composição diferente entre as duas monocamadas, ou faces, que a constituem. Na membrana plasmática, essa assimetria é notável em relação aos lipídeos presentes na face exoplasmática (localizada na superfície celular) e na face citosólica (voltada para o citosol). A fluidez das biomembranas depende de alguns fatores cruciais, tais como a temperatura na qual se encontra a membrana e a própria composição lipídica da membrana. As biomembranas podem estar em dois estados físicos: paracristalino (gel) ou fluido (líquido). A mudança de um estado físico para o outro é conhecida como transição de fase e é determinante Citologia e Embriologia46 para a fluidez da membrana. Quanto mais elevada for a temperatura, mais fluida será uma biomembrana. Com relação à composição lipídica, a presença de fosfolipídios ricos em ácidos graxos poli-insaturados, ou de cadeia curta, favorece a fluidez das membranas. O colesterol também é importante na manutenção da fluidez da membrana em condições de baixa temperatura, uma vez que impede uma associação hidrofóbica mais forte entre as caudas dos ácidos graxos dos fosfolipídios, e previne, assim, a transição de fase para o estado gel. A fluidez da membrana é fundamental para diversos processos celulares, tais como transporte de moléculas e sinalização celular. As balsas lipídicas, domínios da membrana ricos em esfingolipídios, colesterol e proteínas associadas, dependem da fluidez da membrana para a sua participação em processos de sinalização e endocitose. Composição Proteica As proteínas presentes nas biomembranas podem ser classificadas em: Integrais (intrínsecas) ou periféricas (extrínsecas). Essa classificação se baseia no procedimento necessário para promover a dissociação de uma proteína da membrana. Proteínas integrais só se dissociam da membrana através do uso de detergentes, tais como o dodecil sulfato de sódio ou o Triton-X-100, ao passo que proteínas periféricas podem ser dissociadas da membrana na presença de soluções hipersalinas ou soluções de pH extremos. As proteínas periféricas se associam à membrana mediante interações iônicas com proteínasintegrais ou com os fosfolipídios da membrana. Por outro lado, as proteínas integrais da membrana se associam com esta mediante interações hidrofóbicas fortes com os lipídeos da membrana e podem ser subdivididas em três tipos: a) Proteínas transmembrana — São proteínas que atravessam completamente a bicamada lipídica, apresentando, pelo menos, três regiões bem definidas: domínio extracelular, domínio transmembrana (TM) e domínio citosólico. Tais proteínas podem cruzar a bicamada lipídica uma Citologia e Embriologia 47 única vez (proteína integral unipasso) ou diversas vezes (proteína integral multipasso) (MONTANARI, 2016). A interação das proteínas transmembrana com as biomembranas se dá por meio de interações hidrofóbicas entre as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos dos domínios TM das proteínas e a cauda dos ácidos graxos dos fosfolipídios da membrana. b) Proteínas ancoradas por lipídeos — São quatro tipos de âncoras de lipídeos que promovem a interação dessas proteínas com a membrana plasmática: âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI), âncora de miristato, âncora de palmitato e âncora de prenilato. A ancoragem por GPI só ocorre no domínio extracelular da membrana plasmática, enquanto que a ancoragem pelos ácidos graxos é restrita à face citosólica da membrana plasmática (MONTANARI, 2016). A interação dessas proteínas com as membranas se dá pela interação hidrofóbica dos lipídeos ligados covalentemente às proteínas com a cauda dos ácidos graxos dos fosfolipídios da membrana. c) Proteínas ancoradas por →-hélice — Tais proteínas são ancoradas na membrana plasmática a partir da interação dos fosfolipídios da membrana com um domínio lateral hidrofóbico em →-hélice da proteína. Essas proteínas são encontradas somente na face citosólica da membrana plasmática. As proteínas de membrana estão envolvidas em uma série de processos biológicos fundamentais para a fisiologia celular, tais como: transporte de moléculas, atividade enzimática, adesão celular, comunicação celular, reconhecimento celular e formação das junções celulares (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016b). Carboidratos Os carboidratos são o terceiro maior componente da membrana plasmática. Em geral, eles são encontrados na superfície externa das células e estão associados às proteínas (formando as glicoproteínas) ou aos lipídios (formando os glicolipídios). Essas cadeias de carboidratos podem consistir em 2-60 unidades de monossacarídeo e podem ser simples ou ramificadas. Citologia e Embriologia48 Juntamente às proteínas de membrana, esses carboidratos formam marcadores celulares distintos, um tipo de identidade molecular que permite que as células reconheçam umas às outras. Esses marcadores são muito importantes para o sistema imune, permitindo que células imunitárias diferenciem entre as células do organismo, as quais não devem ser atacadas; e células ou tecidos estranhos, os quais devem ser atacados (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016b). Tipos de Junções Celulares As células animais, ao final do processo divisional, tornam-se únicas, com algumas raras exceções. Você já se perguntou como todas as células com a mesma especialização unem-se para formar tecidos? Para formar os tecidos, existe uma necessidade de comunicação e trabalho em conjunto de célula com célula. Com esse objetivo, surge uma grande variedade de especializações de contato entre as células animais, através de elaboradas formas de junções para a troca de informações, ancoragem, seleção do trânsito extracelular, de sincronização de processos — como a absorção, secreção ou contração, dentre outros. As junções celulares animais podem ser classificadas como: ancoradouras, comunicantes ou bloqueadoras. Obviamente que em processos fisiológicos, como nos processos de multiplicação e morte programada e alguns processos patológicos, essas junções devem ser desfeitas. Vamos aprender um pouco sobre essas junções celulares? Interdigitações As interdigitações realizadas pelas membranas plasmáticas de duas células pareadas são especializações de comunicação celular que têm como missão aumentar a superfície de contato entre as células que as realizam. Não é incomum que essa região de membranas interdigitadas seja local de ocorrência de alguma junção. Podem ser descritas na literatura como evaginações e invaginações complementares para o interior do corpo de uma e de outra célula pareada. Seu local de ocorrência predominante é a região lateral das células em proximidade (MONTANARI, 2016). Citologia e Embriologia 49 Desmossomo A junção desmossômica é uma junção ancoradoura que serve para adesão célula–célula, portanto é necessário que exista uma proximidade entre as membranas de duas células vizinhas. (MONTANARI, 2016). Junção Aderente (Zônula Aderente) A junção aderente ou zônula aderente é similar a um desmossomo por sua função de ancoragem entre as membranas e ancoragem do citoesqueleto, entretanto sua distribuição na membrana difere dele por dispor-se em cinturão ao redor do corpo da célula, fazendo a união desta com várias células vizinhas. (MONTANARI, 2016). Junção Comunicante (GAP) Nos vertebrados, a junção comunicante ou GAP é uma junção que pode ter formas e tamanhos variados, pois pode ser construída e desfeita pela simples concentração ou dispersão de proteínas, estas proteínas são denominadas “conexinas” em qualquer ponto de aproximação entre as membranas de células vizinhas. Nos invertebrados, a junção é formada por proteínas similares, denominadas “inexinas”. O objetivo dessa junção é a sinalização celular por meio de íons ou por meio de pequenos peptídeos sinalizadores que atravessam do citoplasma de uma célula diretamente para o citoplasma da célula vizinha, sem passar pelo meio extracelular. (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016b). Junção Compacta A junção compacta ou zônula oclusiva é uma junção do tipo bloqueadora. Como diz o nome, uma das suas principais funções é bloquear o espaço extracelular, impedindo, assim, o trânsito de substâncias por entre as células em união. Nesse caso, as substâncias que permeiam o meio extracelular só ultrapassam a zona de bloqueio sendo transportadas pelo citoplasma das células unidas. Mas essa junção não possui somente uma função, sua segunda função é impedir a dispersão ou migração dos elementos que integram as membranas plasmáticas Citologia e Embriologia50 e que não conseguem fluir pela região do cinturão de bloqueio. Isso permite à célula criar dois microambientes de membrana plasmática com composição distinta nos polos apical e basal (MONTANARI, 2016). Junção Septada A junção septada é uma junção bloqueadora típica de epitélios dos invertebrados. Essa junção tem disposição em cinturão circundando o corpo de cada célula em união. Seu nome é sugestivo de sua função, pois ela é facilmente identificada em eletromicrografias pela presença de inúmeros septos eletrodensos que atravessam o espaço extracelular entre as membranas plasmáticas pareadas. Esses septos se dispõem como fitas que bloqueiam o trânsito extracelular e, portanto, atribuem ao epitélio a propriedade de seletor das trocas entre a cavidade ou superfície, revestida pelo epitélio, e o tecido conjuntivo. Pode ser comparada, funcionalmente, à junção compacta (zônula oclusiva) dos vertebrados (BROWN, 2013). Complexo Juncional ou Unitivo O denominado complexo juncional ou complexo unitivo corresponde a um conjunto de junções celulares de ocorrência obrigatória entre os enterócitos (células do intestino) que compõem o epitélio do tubo digestório (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2016b). Esse conjunto deve respeitar a seguinte sequência no sentido do ápice para a base celular, ou seja, para que tenhamos aquele formato, visto nas lâminas de histologia é necessário que as junções ocorram na ordem abaixo: a. junção compacta (zônula ocludente); b. junção aderente (zônulaaderente); c. desmossomos Quando encontradas em outros tipos celulares, essas junções não precisam necessariamente seguir essa ordem. Com a exceção do epitélio intestinal, o complexo juncional pode ser seguido das mais variadas formas de junções, como interdigitações, GAP, outros desmossomos (MONTANARI, 2016). Citologia e Embriologia 51 Disco Intercalar O disco intercalar é, na verdade, o local de ocorrência de um complexo de três junções celulares: a. desmossomos; b. zônulas de aderência; c. junções comunicantes (GAP). É possível observar entre as fibras cardíacas (células musculares estriadas cardíacas). Nesse conjunto do tecido muscular suas células se unem de forma paralela na formação dos fascículos do músculo. Várias células se justapõem, também, pelas extremidades em forma de disco, denominadas discos intercalares. Nessa região de contato terminal, as células mostram interdigitações. (MONTANARI, 2016). RESUMINDO: Nosso conteúdo chegou ao fim nesta primeira unidade, espero que vocês tenham gostado! Conseguiram aprender este capítulo sobre biomembranas? Um pouco complicado, não? Mas vamos fazer um breve resumo para revermos os pontos mais importantes deste capítulo. As membranas plasmáticas, chamadas de biomembranas, são caracterizadas por possuírem uma bicamada, esta é composta por lipídios, proteínas e carboidratos, essa composição da membrana plasmática é responsável por: manter a estrutura da célula íntegra, selecionar as substâncias que entram e saem da célula e realizar os transportes passivos e ativos do meio interno para o meio externo e vice-versa, diante dos diferentes gradientes de concentração. Quando você imaginar essa membrana plasmática, você pode imaginar como se fosse a porta da sua casa. Sendo a primeira estrutura da célula e orientada, então, a realizar esse contato entre os diferentes meios, ela é também responsável pela comunicação entre as células, afinal de contas, as células, para formarem Citologia e Embriologia52 tecidos que posteriormente farão parte de órgãos, precisam estar conectadas, certo? Mediante essa interação entre as células, nós possuímos diversos tipos de conexão entre elas, como as junções comunicantes, bloqueadoras e ancoradouras, cada uma com vários subtipos! Agora você compreende a complexidade das células e é através das junções que ocorre, então, essa comunicação celular; claro que isso depende de uma série de moléculas sinalizadoras, mas vamos deixar esse assunto para mais adiante! Neste momento você é capaz de identificar e reconhecer o papel da biomembrana e seus aspectos funcionais! Olha quanto conteúdo novo e quantas competências você adquiriu ao longo desta primeira unidade! Espero que vocês tenham gostado! Bons estudos! Citologia e Embriologia 53 REFERÊNCIAS ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. BROWN, R. A Célula — Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan p. 14–15, 2013. CAPUTO, L. F. G.; GITIRANA, L. DE B.; MANSO, P. P. DE A. Capítulo 3 Técnicas histológicas Técnicas histológicas Técnicas histológicas Técnicas histológicas Técnicas histológicas. Conceitos e Métodos para a formação de Profissionais em Laboratórios de Saúde - Técnicas histológicas, v. 3, p. 89–188, 2017. MICROSCOPY, C. Z. Axiostar transmitted-light microscope - operating manual. Göttingen - n. B 40-031. p. 1.2.1999. GALLETI, S. R. Introdução à microscopia eletrônica. Biológico, São Paulo, v.65, n.1/2, p.33–35, 2003. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. Tecnologia da Biologia Celular e Molecular: Alguns Exemplos — Biologia Celular e Molecular, 2016a. JUNQUEIRA, L. C. U.; CARNEIRO, J. Biologia e Fisiologia Celulares. Biologia e Fisiologia Celular. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan p. 21–31, 2016b. JUNQUEIRA, L. C. U.; CARNEIRO, J. Histologia Básica. 13. ed. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan, 2017. LODISH, H. et al. Biologia celular e molecular. 7. ed. Porto Alegre : Artmed, 2014. MONTANARI, T. Histologia: texto, atlas e roteiro de aulas práticas, 2016 Disponível em: http://www.ufrgs.br/livrodehisto/pdfs/livrodehisto.pdf. PICULO, F. Metodologia e equipamentos. In: Guia ilustrado da morfologia do tecido uretral de ratas [online]. São Paulo: Editora UNESP, 2014. ROSS, M. H.; PAWLINA, W.; BARNASH, T. A. Atlas de Histologia Descritiva. 1. ed. Porto Alegre. Artmed., 2012. TANG, Z. M. Field and radiation of an accelerating charge obtained by GR. Kexue tongbao, Scientia, v. 34, n. 11, p. 964–965, 2017. Thiely Rodrigues Ott Citologia e Embriologia _GoBack Aspectos Gerais Da Estrutura Celular Aspectos Gerais da Estrutura Celular: Compreensão da Organização Estrutural de Células Procarióticas e Eucarióticas Membrana Celular Citoesqueleto Núcleo Retículo Endoplasmático e Ribossomos Complexo de Golgi Mitocôndrias Lisossomos Peroxissomos Diversidade e Semelhança Entre as Células Conceitos de Microscopia Componentes do Microscópio Óptico e suas Funções Microscopias Especiais Descrição dos Princípios Básicos de Microscopia Eletrônica de Transmissão e Varredura Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Métodos Empregados no Estudo de Células e Tecidos Definição de Técnica Histológica Técnicas para Análise do Material Histológico Técnica de Espalhamento Técnica de Estiraço Técnica de Esmagamento Corte Histológico Decalque Montagem Total Descrição das Etapas Envolvidas para Análise Histológica do Material no Microscópio Óptico Técnicas de Coloração de Cortes Histológicos Técnicas Citoquímicas Biomembranas Definição e Aspectos Funcionais das Biomembranas Composição Lipídica e Organização Estrutural Fluidez e Assimetria das Bicamadas Lipídicas Composição Proteica Carboidratos Tipos de Junções Celulares Interdigitações Desmossomo Junção Aderente (Zônula Aderente) Junção Comunicante (GAP) Junção Compacta Junção Septada Complexo Juncional ou Unitivo Disco Intercalar
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