Botucatu - parte 2

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O teste de genotipagem disponível atualmente no Brasil, na RENAGENO − Ministério
da Saúde, determina as mutações no genoma viral pelo sequenciamento de uma porção da
região pol do HIV−1, que inclui o gene completo da protease e cerca de dois terços do gene
que codifica a transcriptase reversa, principais alvos da TARV.
1.1.1 Mutações de Resistência
As mutações associadas a resistências podem ser classificadas em principais ou
primárias e acessórias ou secundárias. Mutações principais são capazes por si só de reduzir a
suscetibilidade à determinada droga. As acessórias são capazes de reduzir a suscetibilidade
viral à droga quando em combinação com a mutação principal ou melhoram a capacidade de
replicação do vírus, o fitness viral. No entanto, esta definição pode ser alterada, podendo
determinada mutação ser principal para uma droga e acessória para outra (SHAFER, 2002).
As mutações de resistência são descritas utilizando um número para indicar o códon
mutante com letras antes e depois que indicam os aminoácidos associados respectivamente
ao vírus selvagem e mutante, como a mutação M184V da TR. A letra inicial representa o
aminoácido da proteína do vírus selvagem (M: metionina), o número representa o códon
(184) e a letra final representa o aminoácido mutante (V: valina). (ANEXO A)
1.1.1.1 Mutações de Resistência aos ITRNs
A resistência aos ITRNs é mediada por dois mecanismos bioquímicos (Figura 13), a
discriminação aumentada pela TR e diminuição da incorporação do ITRN em favor dos
nucleosídeos autênticos, provocada por mutações como a M184V, Q151M, L74V e K65R
(DEVAL et al., 2002; SHAFER; SCHAPIRO, 2008), e o processo de excisão do análogo
incorporado, pela promoção da reação de pirofosforólise, mediada pelo ATP, impulsionada
principalmente pelas TAMs, inserções no códon 69 e mutações acessórias (BOYER et al.,
2001).
ATP
A
B
TR
TAMs permitem a
ligação do ATP na TR
DNA
Análogo de
nucleosídeo
incorporado
Cadeia de DNA viral não
terminada
Mutação Análogo de
Nucleosídeo
TR RNA
Excisão do análogo de
nucleosídeo do DNA
DNA viral pelo ATP
RNA
Figura 13- Mecanismos de resistência aos ITRNs. (A) discriminação do análogo de nucleosídeo pela
presença de mutações. (B) Excisão do análogo mediada por ATP. Determinam a continuidade da
transcrição pela TR (CLAVEL; HANCE, 2004)
Mutações relacionadas aos ITRNs incluem M184V, mutações associadas aos análogos
de timidina (thymidine analog mutations − TAM), mutações de resistência multi−nucleosídeoe
mutações acessórias não−polimórficas (SHAFER, 2002; SHAFER; SCHAPIRO, 2008). Mesmo na
presença de mutações de resistência, a atividade das drogas dessa classe não se extingue,
permanecendo uma atividade residual (DEEKS et al., 2005).
As TAMs são selecionadas pelos análogos da timidina AZT e d4T e possuem duas vias
mutacionais. A via mutacional TAM I inclui as mutações M41L, L210W e T215Y e causa níveis
elevados de resistência para os análogos da timidina e resistência cruzada para o ABC, ddI e
TDF e a via TAM II inclui as mutações D67N, K70R, T215F e K219Q/E, sendo a mutação D67N
também encontrada com o tipo I. Conferem susceptibilidade reduzida a todos os ITRNs
aprovados e o grau de resistência cruzada é observado dependendo do número e de
mutações específicas envolvidas (WHITCOMB et al., 2003). A presença de três ou mais
TAMs, inclusive M41L e/ou L210W reduzem a resposta ao Tenofovir (MILLER et al., 2004).
Outras substituições no códon 215 conferem maior risco de falha virológica ao AZT e d4T em
pacientes virgens de terapia, podendo o mutante T215Y surgir rapidamente a partir de uma
das variantes na presença destas drogas (COZZI−LEPRI et al., 2005; SHAFER; SCHAPIRO,
2008).
M184V é a mutação de resistência relacionada aos ITRNs mais comum, selecionada
rapidamente durante o uso de 3TC, além do ABC e ddI. Provoca alto nível de resistência ao
3TC e FTC, baixo nível de resistência ao ddI e ABC e aumento da susceptibilidade ao AZT, d4T
Ligação
do ITRNN
bloquada
ITRNN
TR
Bolso
Hidrofóbico
DNA
Polimerização
Normal do DNA
RNA
e TDF (WHITCOMB et al., 2003). Quando associada com a mutação K65R ou L74V confere
alto nível de resistência ao ABC e ddI (RHEE et al., 2004). A mutação M184V também está
associada com fitness viral diminuído, aumento da fidelidade da TR, e hipersensibilização a
vários outros ITRNs (PETRELLA; WAINBERG, 2002; TURNER; BRENNER; WAINBERG, 2003).
Mutações de resistência multi−nucleosídeo associadas aos ITRNs levam a falência de
toda uma classe. Envolve as inserções no códon 69, que geralmente ocorrem na presença de
múltiplas TAMs, levando a resistência intermediária ao 3TC e FTC e alto nível de resistência
as demais drogas desta classe, e a mutação Q151M, geralmente acompanhada por duas ou
mais das mutações A62V, V75I, F77L e F166Y, num complexo que causa alto nível de
resistência ao AZT, d4T, ddI e ABC e resistência intermediária ao TDF, 3TC e FTC (IVERSEN et
al., 1996; VAN VAERENBERGH et al., 2000; MASQUELIER et al., 2001).
1.1.1.2 Mutações de Resistência aos ITRNNs
As mutações responsáveis pela resistência aos ITRNNs localizam−se no bolso
hidrofóbico da enzima TR (Figura 14), local de ligação dos inibidores, reduzindo a afinidade
aos ITRNNs e evitando sua ligação (SARAFIANOS et al., 2004).
Altos níveis de resistência cruzada existem entre os ITRNNs, possibilitando que
presença de apenas uma mutação de resistência, como a K103N, leve à resistência completa
a toda classe, demonstrando uma barreira genética baixa, além de não exibir atividade
residual. As mutações da transcriptase reversa K103N e Y181C são as mutações de
resistência aos ITRNNs mais encontradas (SHAFER; SCHAPIRO, 2008).
Figura 14- Mecanismo de resistência aos ITRNNs: alterações estruturais dificultam a acessibilidade
dos ITRNN à enzima (CLAVEL; HANCE, 2004)
As mutações aos ITRNNs podem desaparecer rapidamente na ausência da droga. Em
indivíduos experimentados, mesmo sem mutação relacionada aos ITRNNs detectável no
teste de genotipagem de rotina, variantes virais minoritárias com mutações de resistência
aos ITRNNs podem permanecer e emergir na reintrodução de drogas da mesma classe,
levando à falha terapêutica. Os testes de genotipagem convencionais são pouco sensíveis e
exigem uma frequência de mutações em 20−30% da população para a detecção (MELLORS et
al., 2003). Deste modo, pacientes com falha virológica atual ou prévia (carga viral detectável)
durante o uso de esquemas compostos por ITRNNs devem ser considerados como
portadores de vírus resistentes a essas drogas (BRASIL, 2008).
1.1.1.3 Mutações de Resistência aos IP
A resistência aos IP ocorre devido a mutações que alteram a estrutura dos locais de
ligação do substrato na enzima, reduzindo a afinidade da PR pelo inibidor, ou por mutações
que alteram a estabilidade do dímero, a cinética de ligação do inibidor ou a conformação do
centro ativo, havendo uma vantagem a favor do substrato natural, as poliproteínas virais, na
competição pelo sítio ativo da protease (WEBER; FANG; AGNISWAMY, 2008; WEBER;
AGNISWAMY, 2009). Entretanto, a estrutura alterada da fenda de ligação, principalmente
pelas mutações principais, tem um efeito indireto, diminuindo a capacidade da protease
viral se unir ao seu substrato natural e levando à redução do fitness viral, que pode ser
revertida com o surgimento de mutações acessórias (CHEN et al., 1995; NIJHUIS et al., 1998).
O estabelecimento da resistência aos IPs ocorre de forma gradual e depende do acúmulo
de múltiplas mutações principais e acessórias (Figura 15), possuindo alta barreiragenética, e
sendo menos associados à falha virológica (SHAFER, 2002). Mais mutações sãoselecionadas
durante o uso dos IPs do que por qualquer outra classe de ARV (SHAFER;
SCHAPIRO, 2008).
Figura 15- Sítios das mutações de resistência no dímero da protease. O dímero da protease está
representado nas fitas cor de rosa ligado ao Darunavir (verde). Mutações principais e acessórias são
representadas como esferas vermelhas e azuis,respectivamente. As mutações estão distribuídas em
ambos os monômeros para aumentar a visibilidade (WEBER; AGNISWAMY, 2009)
1.2 Rede Nacional de Genotipagem do HIV-1 – RENAGENO
A detecção da ocorrência de resistência genotípica (mutações do HIV−1) em pacientes
em uso de TARV possibilita uma reorientação do tratamento e seleção de uma terapia de
resgate. Partindo desta necessidade, o Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
implantou, a partir do segundo semestre de 2001, a Rede Nacional de Genotipagem −
RENAGENO, com o objetivo de estimar, nas diferentes áreas geográficas e subtipos virais
circulantes, a prevalência de mutações e sua associação com o estadiamento clínico,
exposição prévia aos ARV e aos esquemas terapêuticos em uso no momento da coleta, pelo
exame de genotipagem, atuando na orientação da terapia de resgate dos pacientes com
falha terapêutica. Atualmente, a rede é composta por 23 laboratórios executores e 1 de
resgate (Figura 16) (BRASIL, 2009b).
Figura 16- Rede Nacional de Laboratórios de Genotipagem: mapa representando a distribuição dos23
laboratórios da rede (BRASIL, 2009a)
1.2.1 Critérios de inclusão no exame
A realização do teste de genotipagem logo após a confirmação da falha virológica
orienta a mudança precoce do esquema antirretroviral, reduzindo a chance de acúmulo
progressivo de mutações e de ampla resistência antirretroviral. Para a realização do exame
de genotipagem em crianças, adolescentes e adultos nos laboratórios da RENAGENO são
obedecidos os seguintes critérios: falha virológica confirmada; carga viral com pelo menos
2.000 cópias/ml; uso regular de TARV (há seis meses, para pacientes em geral; há três
meses, para gestantes) (BRASIL, 2008). Em todas as crianças e adolescentes é indicada a
realização de teste de genotipagem antes do início do tratamento (BRASIL, 2009c).
1.2.2 Fluxo da RENAGENO
O médico responsável pelo paciente com falha virológica, atendendo aos critérios
mencionados, preenche a solicitação do exame em formulário padrão. Este pedido é
encaminhado para a avaliação de profissionais capacitados pelo Departamento de DST, Aids
e Hepatites Virais, os Médicos de Referência em Genotipagem (MRG), grupo composto por
mais de trezentos profissionais, entre infectologistas e pediatras. A partir do deferimento da
solicitação pelo MRG, realiza−se a coleta da amostra e o envio aos laboratórios da
RENAGENO. Após a realização do exame, o resultado do teste de genotipagem é
encaminhado ao MRG, que realiza a interpretação clínica do exame e emite sugestões
quanto às possíveis condutas terapêuticas. Esse resultado de exame e a sugestão clínica do
MRG são enviados aos médicos solicitantes e uma nova terapia é estabelecida (BRASIL, 2001).
2 OBJETIVOS
2.1 Ob¡etivo Geral
▪ Avaliar o perfil de resistência aos ITR e IP em pacientes com infecção pelo HIV, em
falha terapêutica, acompanhados em serviços públicos de saúde das regiões de Botucatu,
Sorocaba, Bauru, Assis, Marília, Araraquara e São José do Rio Preto.
2.2 Ob¡etivos específicos
▪ Analisar o perfil de mutações do HIV−1 em pacientes submetidos ao exame de
Genotipagem, realizado no Laboratório de Biologia Molecular, Hemocentro de Botucatu −
UNESP, ponto executor da Rede Nacional de Genotipagem do HIV−1.
▪ Analisar o perfil de suscetibilidade e resistência aos ITR e IP dos pacientes frente aos
antirretrovirais utilizados.
▪ Avaliar o impacto da introdução do Teste de Genotipagem como parâmetro
laboratorial para auxiliar a escolha da terapêutica de resgate mediante falha do esquema
antirretroviral.
3 CASUÍSTICA
Pesquisa retrospectiva em que foram analisadas sequências genômicas da região pol
do HIV−1 provenientes de todos os pacientes com exame de genotipagem realizados durante
os anos de 2008 e 2009 no Laboratório de Rotinas Diagnósticas em Biologia Molecular do
Hemocentro de Botucatu − Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, ponto executor da
Rede Nacional de Genotipagem do HIV − RENAGENO.
Os critérios de inclusão no estudo dos exames de genotipagem foram a solicitação
médica deferida pelo MRG após comprovada falha virológica (pacientes em geral), ou antes
do início do tratamento (crianças e adolescentes), e carga viral plasmática do HIV−1 acima de
2.000 cópias de RNA/mL. Os critérios de exclusão compreenderam a ausência de dados
referentes aos esquemas ARVs utilizados pelos pacientes, e nos casos em que os pacientes
apresentavam mais de um exame de genotipagem realizado no período do estudo, apenas o
mais recente foi considerado.
Foram incluídos pacientes de ambos os sexos que apresentavam diferentes níveis de
contagem de células T CD4+ e Carga Viral plasmática, sendo provenientes das regiões de
Botucatu, Bauru, Marília, Assis e Araraquara, além das regiões de Sorocaba durante o ano de
2008 e de São José do Rio Preto durante o segundo semestre de 2008 e primeiro de 2009.
Dois grupos distintos foram formados, tendo como base a idade do paciente no
momento do exame; aqueles com idade ≥ 18 anos foram colocados no grupo ”Adulto”,
sendo formado por 386 indivíduos, e os demais, incluídos no grupo ”Pediátrico”, formado
por 45 pacientes menores de 18 anos de idade, totalizando 431 pacientes. A tabela 1
apresenta a caracterização dos grupos do estudo. Os Apêndices A e B mostram os dados de
ARVs e esquemas mais detalhadamente.
Tabela 1- Análise descritiva das características demográficas, clínicas, virológicas e
imunológicas dos indivíduos incluídos no estudo (n=431)
Variáveis Grupos
Adulto (n=386) Pediátrico (n=45)
média DP mediana média DP mediana
Idade (anos) 43,38 9,13 42 10,22 4,38 11
Tempo de diagnóstico (anos) 9,38 4,02 10 8,74 3,67 9
Contagem T CD4+ (céls/mm³) 258,08 204,01 211 446,73 308,78 384
T CD4+ Nadir (céls/mm³) 149,37 136,72 111 267,53 200,19 195
Carga Viral (cópias/mL) 51.746,91 82.333,07 18.593 129.233,71 348.245,39 41.052
Exposição aos ARVs* 6,22 2,59 6 4,81 2,89 5
n % n %
Gênero
Masculino 222 57,51 23 51,11
Feminino 164 42,49 22 48,89
Região
Botucatu 30 7,8 2 4,44
Bauru 61 15,8 7 15,56
Marília 16 4,1 2 4,44
Assis 33 8,5 1 2.22
Araraquara 35 9,1 2 4,44
Sorocaba 38 9,8 1 2.22
São José do Rio Preto 173 44,8 30 66,67
Estágios da doença**
Aids
Sim 236 62,93 22 53,66
Não 139 37,07 19 46,34
Sintomas
Sim 58 15,30 9 20,45
Não 321 84,70 35 79,55
Esquema ARV em uso
2 ITRN + 1 IP 178 46,1 16 35,56
2 ITRN + 1 ITRNN 127 32,9 17 37,78
Outros 81 21,0 8 17,78
DP: desvio padrão; ARVs: antirretrovirais; ITRN: inibidor de transcriptase reversa análogo de nucleosídeo; ITRNN: inibidor
de transcriptase reversa não−análogo de nucleosídeo; IP: inibidor de protease.
*Dado referente apenas aos pacientes em uso de ARVs (41 indivíduos)
**dado definido segundo critérios clínicos, informação retirada do formulário de solicitação do exame de genotipagem.
4 MÉTODOS
4.1 Processamento das amostras
Amostras de sangue total em tubos de ensaio com EDTA foram coletadas nos pontos
de coleta da Renageno e enviadas ao Laboratório de Rotinas Diagnósticas em Biologia
Molecular segundo protocolo estabelecido no POP (Procedimento Operacional Padrão) do
referido laboratório. Depois da centrifugação do tubo primário a 2500 rpm (1000g) por 15
minutos, duas alíquotas de plasma foram separadas em microtubos do tipo eppendorf de
1,5mL DNase/RNase Jree (Axygen Scientific, Union City, California) e armazenadas a −70˚C
para posterior processamento.
4.2 Extração de RNA, Amplificação e Sequenciamento
O RNA viral foi extraído do plasma utilizando o QIAamp Viral RNA mini kit (Qiagen
Inc., CA) segundo especificações do fabricante. A amplificação da região genômica pol do
HIV−1 foi realizada por RT−PCR, utilizando o kit comercial Trugene HIY−t
Genotyping Kit (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, USA), utilizando
primers específicos para amplificar o gene completo da protease e os primeiros 250 códons
da transcriptase reversa como um único amplicon, resultando em um fragmento de 1,3Kb, o
qual foi sequenciado em 16 reações, baseadas noprincípio ClIP (YAGER et al., 1999),
utilizando quatro módulos de primers, Protease, P2, RTBeggining e RTMiddle (Figura 17).
Proteasepermite obter uma sequência bidirecional do gene da protease (do códon 10 a 99)
e uma sequência em pelo menos uma direção do códon 1 a 9; P2 permite obter uma
sequência bidirecional da região da protease (códons 21 a 99) e uma sequência em pelo
menos uma direção do códon 7 a 20. RT Beginning permite obter uma sequência
bidirecional da região da transcriptase reversa (códons 41 a 139) e uma sequência em pelo
menos uma direção do códon 140 a 142 e códon 40; RT Middle permite obter uma
sequência bidirecional da região da transcriptase reversa (códons 148 a 237) e uma
sequência em pelo menos uma direção do códon 138 a 147, e do códon 238 a 247. A
eletroforese foi conduzida no long Read Tower Sequencers (Siemens Healthcare Diagnostics,
Inc. Tarrytown, NY, USA). Todas as reações foram realizadas segundo especificações do
fabricante.
A aquisição e análise das sequências foi realizada pelo software OpenGene DNA
Sequencing System (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, USA), segundo
instruções do fabricante.
Figura 17- Sequenciamento do gene da polimerase (pol) do HIV−1 (Trugene HIV−1 Genotyping Kit). A
ilustração mostra as etapas do teste, retrotranscrição, amplificação e as posições dos primers no
produto, delimitando os fragmentos que serão sequenciados: Protease (laranja) e P2 (preto) − gene
da protease; e RT beggining (azul) e RT middle (vermelho) − gene da transcriptase reversa (SIEMENS,
2008)
4.3 Identificação das mutações de resistência
As sequências obtidas foram submetidas ao Algoritmo
Resistência Genotípica da Universidade de Stanford (HIVdb:
de Interpretação de
Genotypic Resistance
Interpretation Algorithm) (http://hivdb.stanford.edu), versão 6.0.7, que analisa as diferenças
nas sequências de aminoácidos de acordo com a declaração do Painel de resistência da
International AIDS Society−USA.
O relatório resultante deste algoritmo origina dados, analisados pelas regiões do
gene pol, PR e TR, sobre mutações principais e acessórias na região da PR, relacionadas aos
IP, e mutações de resistência da TR, relacionadas aos ITRNs e ITRNNs. Além disso, os dados
relacionados à resistência aos ARVs destas classes são divididos em ”alto nível de
resistência”, ”resistência Intermediária”, ”baixo nível de resistência”, ”potencial baixo nível
de resistência” e ”suscetível“. Para este trabalho as categorias ”baixo nível de resistência” e
”potencial baixo nível de resistência” foram reunidas em uma nova categoria, a de ”possível
resistência”.
4.4 Determinação do subtipo
O subtipo viral foi utilizando as sequências em formato fasta (posição 2253 − 3290 no
HXB2) pelo REGA HIY−t Subtyping Tool, versão 2.0, (http://www.bioafrica.net/subtypetool),
uma ferramenta que utiliza análises filogenéticas para identificar o subtipo de uma
sequência específica e analisa a recombinação usando métodos de bootscanning, e pelo
programa RIP 3.0 − los Alamos Recombinant Identification Program
(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/RIP/RIP.html), que identifica a recombinação
em uma sequência por meio do cálculo de sua similaridade com o alinhamento de
sequências de diferentes subtipos do HIV−1.
4.5 Coleta e análise dos dados
Dados sócio−demográficos, imunovirológicos, esquemas ARVs em uso atual ou
anterior foram extraídos dos Formulários de solicitação de genotipagem A (ANEXO B) e B
(ANEXO C). As sequências genômicas foram utilizadas em arquivos de formato Fasta. Alguns
dados imunovirológicos foram coletados pelo SISCEL.
Foi criado um banco de dados informatizado no programa Excel 2007 composto por
291 variáveis, incluindo as mutações na TR e PR, resistência aos ARVs e dados clínicos. Para a
análise, os dados gerados foram exportados para o pacote estatístico SAS for Windows
versão 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). O teste utilizado para estudar a associação
entre as variáveis foi o Quiquadrado de Pearson e nos casos em que as pressuposições do
teste não foram satisfeitas, usou−se o teste Exato de Fisher.
http://www.bioafrica.net/subtypetool)
http://www.bioafrica.net/subtypetool)
http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/RIP/RIP.html)
http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/RIP/RIP.html)
3
BF
1 ,47%
1,30% 0,52% 0,26%
F1
8,81%
BD
SUBTIPOS HIV-1
C
BC
B
75,65%
5 RESULTADOS E DI
5.1 Grupo Adulto
5.1.1 Subtipo viral
CUSSÃO
A subtipagem do H V−1, realizada pelas regiões da PR e TR viral revelou que o subtipo
B foi o mais frequente, encontrado em 292/386 (75,65%) das amostras, seguido pelas
formas híbridas B e F (BF ou FB) (13,47%) e subtipo F1 (8,81%). As outras formas híbridas
(mosaicos) encontrados f ram D/B (1,3%) e B/C (0,26%). O subtipo C foi encontrado em
apenas 2/386 (0,52%) amostras (Figura 18). As sequências determinadas como subtipo B
representaram 75,65% e as não−B, 24,35% do total.
Figura 18- Distribuição dos subtipos e formas híbridas do HIV−1 circulantes nos pacientes do grupo
Adulto, atendidos pelo Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu, ponto
executor da Rede Nacional de Genotipagem, nos anos de 2008 e 2009
Os resultados correspondem a outros relatos nacionais, que encontraram maior
prevalência do subtipo B, com valores muito próximos aos aqui obtidos, como os estudos
conduzidos no Rio de Janeiro, com 117 pacientes com falha na terapia, onde 73,5% eram
pertencentes ao subtipo B (VARELLA et al., 2008), em São Paulo, com 306 pacientes e 70%
de subtipo B (RODRIGUES et al., 2005), e em Minas Gerais com 882 pacientes e 72% de
subtipo B (WALERIA−ALEIXO et al., 2008). Outros estudos encontraram prevalência um
pouco superior do subtipo B, como os conduzidos no Nordeste por Cavalcanti et al. (2007)
em 576 pacientes, com prevalência de 84,4% de subtipo B; em São Paulo por Sucupira et al.
(2001) com 791 pacientes e 87% de subtipo B e no Rio de Janeiro por Couto−Fernandez et al.
(2005) com 547 pacientes e 91,2% de subtipo B. Estudos realizados em Santos (DE SA−FILHO
et al., 2008) encontraram frequência um pouco inferior, com 65% de sequências
classificadas como subtipo B.
A frequência do subtipo F no presente estudo foi semelhante a encontrada na
maioria das regiões do Brasil, oscilando entre 4,8% a 12,2% (SUCUPIRA et al., 2001; COUTO−
FERNANDEZ et al., 2005; RODRIGUES et al., 2005; CAVALCANTI et al., 2007; DE SA−FILHO et
al., 2008; VARELLA et al., 2008). Em Minas Gerais esta prevalência foi superior, com 22,5%
de amostras do subtipo F (WALERIA−ALEIXO et al., 2008). As formas híbridas B e F
apresentaram diferentes vias de recombinação entre as regiões PR e TR e são responsáveis
por 13,47% dos casos na região estudada, número um pouco inferior ao encontrado em São
Paulo, 18% (RODRIGUES et al., 2005) e superior aos encontrados por Waléria−Aleixo et al.
(2008), 6,3% e por Couto−Fernandez et al. (2005), 3,3%.
A frequência encontrada do subtipo B/D 1,3% é semelhante a outros estudos
realizados no Rio de Janeiro (VARELLA et al., 2008), Minas Gerais (WALERIA−ALEIXO et al.,
2008) e Região Nordeste (CAVALCANTI et al., 2007), onde este mosaico possui uma baixa
frequência entre as sequências analisadas.
O subtipo C apresentou frequência similar a maior parte dos estudos brasileiros, que
possui grupos com ausência deste subtipo, como os realizados por Varella et al. (2008) e
Rodrigues et al. (2008) e grupos com frequências que variam de 0,1% a 1,2% (SUCUPIRA et
al., 2001; COUTO−FERNANDEZ et al., 2005; CAVALCANTI et al., 2007; DE SA−FILHO et al.,
2008; WALERIA−ALEIXO et al., 2008), com exceção da alta frequência deste subtipo nos
estados do Sul do Brasil, podendo chegar a 69% (BRINDEIRO et al., 2003; INOCENCIO et al.,
2009).
5.1.2 Mutações de resistência
Foi identificada a presença de uma ou mais mutações de resistência em 97,15%
(375/386) dos pacientes e, portanto, 2,85% de vírus selvagem, sendo encontradas até 27
mutações de resistência em um mesmo indivíduo (Tabela2). Esta proporção de pacientes
sem mutações na PR e TR é similar a outros estudos brasileiros, que detectaram entre 4,9 e
6,8% de vírus selvagem (CAVALCANTI et al., 2007; VARELLA et al., 2008; WALERIA−ALEIXO et
al., 2008; TOLEDO et al., 2010).
Tabela 2- Frequência do número de mutações de resistência na PR e TR (total e classes)
Mutações na PR e TR associadas à Resistência
Total de Mutações Protease
Principais Acessórias
n % n % n %
0 11 2,85 0 182 47,15 135 34,97
1 19 4,92 1 25 6,48 78 20,21
2 21 5,44 2 26 6,74 54 13,99
3 24 6,22 3 35 9,07 60 15,54
4 18 4,66 4 47 12,18 35 9,07
5 23 5,96 5 34 8,81 17 4,40
6 22 5,70 6 27 6,99 5 1,30
7 21 5,44 7 8 2,07 2 0,52
8 21 5,44 8 2 0,52 − −
9 13 3,37
10 17 4,40 Transcriptase Reversa
11 16 4,15 ITRN ITRNN
12 21 5,44 n % n %
13 24 6,22 0 38 9,84 100 25,91
14 22 5,70 1 58 15,03 72 18,65
15 15 3,89 2 37 9,59 94 24,35
16 12 3,11 3 27 6,99 55 14,25
17 15 3,89 4 35 9,07 35 9,07
18 11 2,85 5 43 11,14 21 5,44
19 9 2,33 6 42 10,88 4 1,04
20 12 3,11 7 37 9,59 5 1,30
21 4 1,04 8 29 7,51 − −
22 3 0,78 9 24 6,22 − −
23 2 0,52 10 12 3,11 − −
24 1 0,26 11 3 0,78 − −
25 8 2,07 12 1 0,26 − −
27 1 0,26
PR: Protease; TR: Transcriptase Reversa; ITRN: Inibidor de Transcriptase Reversa análogo de Nucleosídeo; ITRNN: Inibidor
de Transcriptase Reversa Não−análogo de Nucleosídeo
Mutações de resistência a uma, duas e as três classes de ARVs foram encontradas em
8,55, 39,9 e 48,7% dos pacientes, respectivamente. Estes valores são semelhantes aos dados
de exposição às drogas; a exposição a uma droga, apenas ITRN, foi encontrada em dois
(0,52%) pacientes, portanto todos os pacientes foram expostos a esta classe; a duas drogas
41, 97%, sendo distribuídos igualmente em ITRN + ITRNN e ITRN + IP, e às três drogas, em
57,51% dos pacientes (Tabela 3).
Tabela 3- Frequência da exposição aos antirretrovirais e presença de mutações deresistência
por classe de droga
Variáveis
Exposição aos ARVs Mutações de Resistência
n (386) % n (386) %
Nenhum 0 - 11 2,85
1 Classe
ITRN 2 100,0 11 33,33
ITRNN 0 − 8 24,24
IP 0 − 14 42,42
Total 2 0,52 33 8,55
2 Classes
ITRN + ITRNN 81 50,0 85 55,19
ITRN + IP 81 50,0 64 41,56
ITRNN + IP 0 − 5 3,25
Total 162 41,97 154 39,9
3 Classes
ITRN + ITRNN + IP 222 57,51 188 48,7
ARVs: Antirretrovirais; ITRN: Inibidor de Transcriptase Reversa análogo de Nucleosídeo; ITRNN: Inibidor de Transcriptase
Reversa Não−análogo de Nucleosídeo; IP: Inibidor de protease.
As mutações de resistência relacionadas aos ITRNs foram as mais frequentes,
atingindo 348 (90,16%) pacientes, seguidas às relacionadas aos ITRNNs, em 286 (74,09%)
pacientes. As mutações principais e acessórias da protease ocorreram em 204 (52,85%) e
251 (65,03%) pacientes estudados, respectivamente. A grande proporção de indivíduos com
a presença de mutações de resistência no gene da transcriptase reversa, principalmente
aquelas relacionadas ao uso dos ITRNs é esperada, devido ao amplo uso destas drogas
durante a HAART, as primeiras a serem desenvolvidas e utilizadas durante a infecção pelo
HIV−1.
5.1.2.1 Mutações de resistência aos ITRNs
A mutação M184V da TR, relacionada à falha virológica precoce durante a terapia
utilizando a Lamivudina (3TC), droga amplamente utilizada no Brasil, foi a mais frequente
neste estudo, presente em 314 (81,35%) pacientes, semelhante aos encontrados na
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
81,87%
59,33%
40,67% 38,60%
35,49%
30,05%
27,72%
24,87%
19,43% 17,62%
14,25% 14,25%
6,99%
4,40% 3,11% 2,07% 1,30%
0,78%
0,26%
0,26%
literatura brasileira em todo território nacional, na qual esta mutação aparece como a mais
frequente, oscilando entre 60,4 e 68,3% (COUTO−FERNANDEZ et al., 2005; RODRIGUES et al.,
2005; CAVALCANTI et al., 2007; MEDEIROS et al., 2007; VARELLA et al., 2008; TOLEDO et al.,
2010) e 88% (DE SA−FILHO et al., 2008) na população de estudo. Entre os pacientes com esta
mutação, 98,41% estavam em uso de 3TC. Esta mutação confere alto nível de resistência
fenotípica aos análogos da citidina 3TC e FTC, porém, em um esquema de resgate, estes
ARVs ainda geram benefício e devem continuar sendo administrados, pois a M184V pode
aumentar a susceptibilidade aos análogos de timidina AZT, d4T e ao TDF (WHITCOMB et al.,
2003), e causar uma diminuição da capacidade replicativa do vírus, fitness viral (WEI et al.,
2002). A frequência das mutações de resistência relacionadas aos ITRNs é apresentada na
figura 19.
Figura 19- Frequência das mutações de resistência aos ITRNs
O segundo grupo mais frequente foi das mutações associadas aos timidínicos (TAMs)
(Tabela 2), com a presença de uma ou mais das mutações M41L, D67N, K70R, L210W,
T215Y/F e K219Q/E, detectadas em 67,1% das amostras, estando de acordo com a alta
frequência encontrada por Rodrigues et al. (2005), Couto−Fernandez et al. (2005), Varella et
al. (2008), Sa−Filho et al. (2008) e Waléria−Aleixo, et al. (2008). Estas mutações são
selecionadas pelos análogos da timidina AZT e d4T e podem conferir redução da
suscetibilidade a todos os ITRNs e resistência cruzada ao ABC, DDI e TDF (WHITCOMB et al.,
2003). Entre os pacientes com a presença de TAMs, 60,23% estavam em uso desta classe de
drogas, e 98,46% já haviam sido expostos a análogos de timidina durante a terapia.
A análise das vias mutacionais das TAMs, representadas pela via 1 − M41L, L210W e
T215Y, e via 2 − D67N, K70R, T215F e K219Q/E, mostrou que 56,37% das sequências que
apresentavam TAMs possuíam mutações pertencentes a apenas uma dessas vias
mutacionais, sendo estas distribuídas em 49,32% na via TAM 1, e 50,68% na via TAM 2. Os
43,63% restantes possuíam mutações das vias TAM 1 + 2 (Tabela 4) Dentre os
representantes que pertenciam as duas vias, 44 (38,94%) amostras eram compostas por
TAMs 1 associadas apenas a TAM 2 D67N, padrão comumente encontrado (COZZI−LEPRI et
al., 2005). As TAMs K70R e L210W, que raramente ocorrem no mesmo genoma, foram
encontradas juntas em 12 (3,11%) amostras, concordando com a literatura (YAHI et al.,
2000).
Tabela 4- Frequência das mutações TAMs e perfil das vias na população de estudo
Mutações TAM vias 1 e 2 Perfil - vias TAM
n % n %
TAM 1
M41L 157 40,67 TAM 1 72 27,80
L210W 96 24,87 TAM 2 74 28,57
T215Y 149 38,60 TAM 1 + 2 113 43,63
TAM 2
D67N 132 34,20
K70R 110 28,50
T215F 71 18,39
K219Q 59 15,28
K219E 51 13,21
TAM:Mutações associadas aos timidínicos
A mutação de multirresistência Q151M da TR foi encontrada em 7 (1,81%) amostras,
sempre acompanhada por uma ou mais destas mutações A62V (85,71%), V75I e F77L, ambas
com 57,17%, e F116Y (71,53%), como descrito na literatura (SHAFER; SCHAPIRO, 2008). Este
complexo causa alto nível de resistência a ZDV, d4T, ddI e ABC e resistência intermediária ao
TDF, 3TC e FTC (PRADO et al., 2004). Foi encontrada em uma amostra a inserção no códon
69 da TR, ins69_SG, que geralmente ocorre na presença de múltiplas TAMs, como foi o caso
desta variante, que carregava as mutações M41L, L210W e T215F e neste cenário, são
associadas com a resistência intermediária ao 3TC e FTC e alto nível de resistência a todos os
outros ITRNs (WINTERS et al., 1998; PRADO et al., 2004). A deleção no códon 67 da TR del67,
que contribui com a redução da susceptibilidade de cada um dos ITRN, foi encontrada em
um paciente que apresentava simultaneamente as TAMs M41L, K70R, L210W, T215Y, K219E,
exibindo o perfil TAM 1+2, além das mutações E44D, T69G, L74I e M184V, levando a
resistência completa a toda classe dos ITRNs.
A mutação K65R da TR, encontrada em 12 (3,11%) pacientes, não ocorreu em
combinação com TAMs 1, concordando com a literatura, que estabelece este fato como
incomum, devido a um antagonismo bidirecional entre essas mutações, em que K65R
interfere com a mediação das TAMs na remoção do análogo incorporado e as TAMs
interferem com a mediação da K65R na discriminação dos ITRNs (MCCOLL et al., 2004;
PARIKH et al., 2006). As mutações K65R e a L74V não foram encontradas juntas no mesmo
genoma viral, este duplomutante teria sua capacidade replicativa reduzida, configurando
este evento como raro (SVAROVSKAIA et al., 2007).
A combinação da mutação de resistência M184V com as mutações K65R ou L74V
confere alto nível de resistência ao ABC e ddI. O perfil M184V + K65R foi encontrado no
presente estudo em 8 (2,07%) amostras, representando 66,67% das sequências com a
presença da mutação K65R, e todos estavam em uso do esquema contendo 3TC/TDF, perfil
frequentemente relatado (SHAFER; SCHAPIRO, 2008). As mutações M184V + L74V
ocorreram no mesmo genoma em 15 (3,89%) amostras, reunindo todos os representantes
com a mutação L74V, no entanto, os esquemas contendo 3TC em combinação com ABC ou
ddI foram pouco frequentes (20%), diferente do encontrado na literatura, estando a maioria
em uso de 3TC/TDF (53,33%).
As mutações V118I e E44A/D, presentes em 24,87% e 17,62% das amostras, são
mutações acessórias que ocorrem geralmente com TAMs 1, reduzindo a suscetibilidade e
atividade clínica da maioria dos ITRNs (ROMANO et al., 2002; GIROUARD et al., 2003). Neste
estudo, a associação de V118I + TAM 1 ocorreu em 82,29% das amostras contendo V118I
(p<0,0001). Todas as amostras com a presença das mutações E44A/D estavam associadas à
pelo menos uma TAM 1 (p < 0,0001).
50%
45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
45,85%
18,91% 18,39%
12,69% 11,92% 11,66% 11,66%
8,81%
6,99% 6,99% 5,96% 5,18%
4,92%
4,66%
4,66%
1,55% 1,30%
0,26%
A presença da mutação M184V foi associada ao uso de ddI (p<0,0001) e 3TC
(p<0,0001). A mutação V118I foi associada ao uso de ddI (p=0,0076), d4T (p=0,0093), TDF
(p=0,0209) e AZT (p<0,0001). A presença da mutação K65R foi associada ao uso de TDF
(p<0,0001); L74I foi associada ao uso de ABC (p=0,0086). Estas mutações são selecionadas
durante o uso destas drogas, causando diminuição da suscetibilidade a estas e a outras
drogas da mesma classe.
5.1.2.2 Mutações de resistência aos ITRNNs
A mutação mais frequente associada aos ITRNNs, individualmente, foi a mutação
primária K103N, presente em 162 (41,97%) pacientes, como em outros estudos brasileiros,
que encontraram frequências de 26,7% a 62% desta mutação (COUTO−FERNANDEZ et al.,
2005; CAVALCANTI et al., 2007; MEDEIROS et al., 2007; DE SA−FILHO et al., 2008; VARELLA et
al., 2008). Esta mutação de resistência primária aos ITRNNs é selecionada pelo uso de DLV,
NVP e preferencialmente EFV, levando à resistência a estas drogas (RHEE et al., 2006). Entre
os pacientes com a presença desta mutação 63,58% estavam em uso de EFV ou NVP, 81,55 e
18,45% respectivamente; no entanto, 97,53% já haviam sido expostos a estas drogas
durante a terapia. A frequência das mutações de resistência relacionadas aos ITRNNs está
representada na figura 20.
Figura 20- Frequência das mutações de resistência aos ITRNNs
A mutação K103N foi encontrada em combinação com as mutações secundáriasL100I,
em todos (18 amostras) os representantes com esta mutação e K101P em 5 (45,45%)
amostras, sendo neste contexto responsáveis por uma acentuada diminuição na
suscetibilidade a NVP e EFV, além da combinação K103N com L100I levar a uma diminuição
na suscetibilidade a ETR (VINGERHOETS et al., 2005; RHEE et al., 2006). Esta mutação
geralmente ocorre em combinação com P225H, encontrada em 45 (93,75%) amostras e
K238T em 22 (84,62%) amostras e sinergicamente também reduzem a suscetibilidade a NVP
e EFV.
A mutação V106A ocorreu em combinação com a mutação secundária F227L em duas
(50%) amostras levando a reduções na suscetibilidade a NVP (BALZARINI et al., 1998). A
mutação V179F ocorre apenas em combinação com mutações no códon 181, como ocorreu
com a única amostra que exibiu esta mutação neste estudo, que carregava a mutação Y181C,
sendo responsável por um grande aumento na resistência a ETR (VINGERHOETS et al.,
2005).
A presença das mutações K103N (p<0,0001), G190S (p=0,0052) e Y188L (p=0,0038)
foi associada ao uso de EFV, enquanto a presença de Y181C (p=0,0217) e V106A (p=0,0176)
foi associada ao uso de NVP, concordando com a literatura (REUMAN et al., 2010). Estas
mutações são selecionadas durante o uso destas drogas, causando diminuição da
suscetibilidade a estas e resistência cruzada.
O perfil de mutações de resistência a ETR, frente ao uso dos ITRNNs, foi analisado e
está descrito na tabela 5. A frequência de cada mutação é apresentada segundo as drogas
(EFV e NVP) em uso no momento do teste (último esquema), e tendo como base a exposição
prévia a estes ITRNNs em qualquer esquema de TARV prévio à genotipagem. O acúmulo
destas mutações leva à diminuição da suscetibilidade a ETR, assim como a presença isolada
das mutações 181C/I/V, 101P, 100I e 230L (VINGERHOETS et al., 2005; VINGERHOETS et al.,
2010). Estudos tem mostrado que vírus de pacientes com falha virológica após tratamento
com NVP são mais propensos a ter mutações de resistência associadas à ETR quando
comparado com vírus de pacientes que falharam com EFV, o que ocorre devido a Y181C/I/V,
uma mutação principal para ETR, ocorrer mais comumente com NVP do que com EFV, e
porque as mutações nesta posição fornecem a base para alto nível de resistência a etravirina
(REUMAN et al., 2010).
Tabela 5- Mutações de resistência à ETR de acordo com o uso dos ITRNNs no último esquema
de TARV e exposição prévia
ITRNN - Esquema em uso ITRNN - Exposição
Mutação TR EFV (n=116) NVP (n=36)
n % n %
EFV (n=182) NVP (n=55) EFV + NVP (n=66)
n % n % n %
V90I 13 11,21 4 11,11 15 8,24 4 7,27 5 7,58
A98G 12 10,34 5 13,89 22 12,09 7 12,73 8 12,12
L100I 7 6,03 1 2,78 14 7,69 1 1,82 3 4,55
K101E 12 10,34 6 16,67 15 8,24 10 18,18 7 10,61
K101H 1 0,86 0 − 2 1,10 3 5,45 2 3,03
K101P 8 6,9 1 2,78 7 3,85 1 1,82 3 4,55
V106I 12 10,34 4 11,11 12 6,59 5 9,09 6 9,09
E138A 7 6,03 1 2,78 10 5,49 1 1,82 4 6,06
V179F 1 0,86 0 − 1 0,55 0 − 0 −
Y181C 13 11,21 8 22,22 10 5,49 14 25,45 13 19,70
Y181I 0 - 3 8,33 0 - 3 5,45 0 -
G190A 23 19,83 8 22,22 24 13,19 18 32,73 16 24,24
G190S 7 6,03 1 2,78 8 4,40 0 − 2 3,03
M230L 4 3,45 0 − 5 2,75 1 1,82 0 −
TR: Transcriptase Reversa; ITRNN: Inibidor de Transcriptase Reversa Não−análogo de Nucleosídeo; EFV: Efavirenz; NVP:
Nevirapina.
A análise das 100 sequências virais com ausência de mutações relacionadas aos
ITRNNs mostrou que 52% destes pacientes nunca foram expostos a esta classe, porém 48%
já usaram estas drogas em algum momento da terapia, sendo 12% no esquema ARV atual,
no momento da genotipagem, e 87,5% apenas em esquemas anteriores. As mutações aos
ITRNNs podem desaparecer rapidamente na ausência de medicação, permanecendo nas
populações minoritárias e podendo emergir rapidamente quando a droga é reintroduzida,
levando à falha terapêutica. O Consenso de Terapia do Ministério da Saúde estabelece que
pacientes com falha virológica atual ou prévia (carga viral detectável) durante o uso de
esquemas compostos por ITRNN devem ser considerados como portadores de vírus
resistentes a essas drogas, ainda que mutações de resistência aos ITRNNs não tenham sido
detectadas no teste de genotipagem, não devendo ser mantidas no esquema terapêutico, já
que não possuem atividade residual e ainda podem levar ao surgimento de novas mutações
e prejudicar uso futuro de novos ITRNNs, como a etravirina (BRASIL, 2008).
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
5.1.2.3 Mutações de resistência aos IP
As mutações primárias ou principais associadas aos IP mais frequentes foram I54V e
V82A, com 23,32% cada, seguidas pelas mutações M46I e L90M, presentes em 22,28% e
22,02% das amostras, respectivamente (Figura 21) Esta análise na maioria dos estudos
nacionais tem como mutação principal mais frequente a L90M, porém, a maioria com
frequência semelhante ao nosso estudo, de 19,6% (VARELLA et al., 2008), 24,8% (MEDEIROS
et al., 2007), 25,2% (CAVALCANTI et al., 2007) e 29,6% (COUTO−FERNANDEZ et al., 2005) e
um estudo com valor superior, 41% (RODRIGUES et al., 2005) de frequência desta mutação.
Figura 21 - Frequência das mutações de resistência principais aosIP
A mutação I54V, selecionada durante o uso de IDV/r, LPV/r e TPV, contribui para a
resistência a cada um dos IPs, exceto o inibidor de protease de segunda geração DRV/r. A
mutação V82A, selecionada por IDV/r e LPV/r, reduz a susceptibilidade a estas drogas e,
associada a outras mutações, reduz a susceptibilidade ao NFV, ATV/r, SQV/r e FPV/r. A
mutação M46I diminui a suscetibilidade ao IDV/r, NFV, FPV/r, LPV/r, e ATV/r quando
presente com outras mutações (JOHNSON et al., 2009).
A mutação L90M é selecionada durante o uso de NFV, SQV/r, ATV/r, e IDV/r, levando
à resistência viral a estas drogas, além de diminuir a atividade de FPV/r e LPV/r (resistência
cruzada). D30N provoca alto nível de resistência ao NFV e pode diminuir a suscetibilidade ao
ATV/r, sendo muito específica para a PR resistente ao NFV (PATICK et al., 1998). Estas
31,1% 30,3% 29,5%
22,0%
16,3%
9,6% 8,8% 8,3%
8,0% 7,0% 6,5%
6,5%
6,0%
3,6%
3,4% 1,3%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
mutações formam vias distintas de resistência ao NFV, e a existência destas duas mutações
no mesmo genoma viral é raramente encontrada, pois leva à diminuição da infecciosidade e
capacidade de replicação destas variantes, e quando presentes, mutações adicionais são
encontrados, principalmente a N88D, atuando na restauração destes fatores (SUGIURA et
al., 2002). O duplo mutante D30N/L90M foi encontrado em apenas oito sequências,
correspondentes a 9,41% daquelas que apresentavam a mutação L90M, e a maioria (87,7%)
havia sido exposta ao NFV em esquemas de TARV. Em todas as variantes com este perfil, a
mutação N88D estava presente, confirmando a necessidade desta mutação compensatória
neste duplo mutante.
A presença das mutações I50L (p<0,0001) e N88S (p<0,0001) foi associada ao uso de
ATV ou ATV/r. A presença das mutações V82A (p=0,0410) e I54V (p=0,0410) foi associada ao
uso de IDV ou IDV/r. A presença das mutações V82A (p<0,0001), V82F (p=0,0173), V82T
(0,0121), I54V (p<0,0001), M46I (p<0,0001) e M46L (p=0,0031), foi associada ao uso de LPV
ou LPV/r. A presença da mutação L90M (0,0447) foi associada ao uso de SQV ou SQV/r.
As mutações secundárias ou acessórias da protease mais frequentes (Figura 22)
foram nas posições 10 (55,70%), associado à resistência a maioria dos IPs, quando presentes
com outras mutações, e 71 (38,86%), sendo A71T/V polimorfismos que ocorrem em 2−3%
das pessoas não tratadas, mas que aumentam em pessoas que recebem inibidores de
protease, e A71I/L mutações não−polimórficas que ocorrem em vírus com múltiplas
mutações de resistência aos IP (RHEE et al., 2003).
Figura 22- Frequência das mutações acessórias de resistência aos IP
55,70%
38,86%
12,44%10,62% 9,84% 8,81%
4,66% 3,63% 3,63% 3,11% 2,59% 1,30% 1,30% 1,04% 0,78% 0,26% 0,26% 0,26% 0,26%
As mutações G73C/S/T, presentes em 12,44% das amostras, são selecionadas pela
maioria dos IPs, e seu efeito sobre SQV/r e NFV, além de possivelmente ATV/r, parece ser
maior do que sobre outros IPs. Com a introdução dos novos IPs, várias destas mutações
tornaram−se parte dos escores de sensibilidade genotípica, E35G, K43T, Q58E, T74P e N83D
(TPV/r) e V11I, T74P e L89V (DRV/r), sendo importantes na evolução da resistência a estas
drogas (BAXTER et al., 2006; DE MEYER, S. et al., 2008).
Tabela 6- Número de Mutações de resistência ao DRV/r
Número de Mutações* Frequência
n %
0 266 68,91
1 66 17,10
2 31 8,03
3 13 3,37
4 5 1,30
5 3 0,78
6 2 0,52
≥3 23 5,96
*As mutações consideradas foram: V11I, V32I, L33F, I47V, I50V, I54L/M, T74P, L76V, I84V e L89V.
Segundo os estudos baseados em ensaios clínicos (POWER 1, 2 e 3) relacionados ao
uso do DRV/r, onze mutações na PR estão relacionadas a resistência a esta nova droga, V11I,
V32I, L33F, I47V, I50V, I54L/M, T74P (no lugar de G73S), L76V, I84V e L89V, sendo o número
de mutações de resistência e a magnitude do fold−change fenotípico para o DRV/r altamente
preditivo para a resposta, consistindo em diminuição da resposta virológica na presença de 3
ou mais destas mutações (DE MEYER, S et al., 2008; JOHNSON et al., 2009). No presente
estudo, 120 (31,09%) amostras apresentavam uma ou mais mutações relacionadas à
resistência ao DRV/r, no entanto apenas 5,96% do total de pacientes exibiam três ou mais
mutações, refletindo a alta barreira genética relacionada a esta droga, com baixo nível de
resistência cruzada, dado que se trata de pacientes multiexperimentados, inclusive com IPs
(Tabela 6).
Os resultados mostram que as drogas em uso pela maioria dos pacientes ainda
possuem potenciais benefícios, principalmente os ITRNs, que mesmo com a diminuição à
suscetibilidade ainda mantém uma atividade residual, além das mutações relacionadas a
esta classe que levam a reversão da resistência, assim como os IPs que devido a sua grande
barreira genética, é a classe que apresenta a menor frequência de mutações. As mutações
relacionadas às novas drogas, ETR, DRV e TPV apresentaram baixa frequência, mostrando o
grande potencial da introdução destas drogas em esquemas de resgate.
5.1.3 Resistência aos ARVs
5.1.3.1 Resistência geral
A resistência total a uma classe de ARVs foi definida pela classificação, para todas as
drogas da classe, nas categorias resistência alta e/ou resistência intermediária, que podem
impossibilitar a utilização posterior dessas drogas. Portanto, a sensibilidade total a classe é
definida pela ausência da classificação nestas categorias para todas as drogas da classe.
A classe dos ITRNs apresentou a maior frequência de indivíduos com resistência total
(32,28%) às sete drogas analisadas, seguidos pelos ITRNNs, com 27,98% de resistência total
às quatro drogas da classe. Os IPs apresentaram o melhor desempenho, com apenas 4,15%
dos indivíduos com resistência total às oito drogas da classe, mostrando seu grande
potencial de uso na terapia de resgate (Tabela 7).
Tabela 7- Suscetibilidade as classes dos ITRNs, ITRNNs e IPs (suscetibilidade e resistência
totais)
Classes Sensibilidade total Resistência total
n (386) % n (386) %
ITRN (7) 46 11,92 125 32,38
ITRNN (4) 135 34,97 108 27,98
IP (8) 185 47,93 16 4,15
3 classes 28 7,25 4 1,04
ITRN: Inibidor de Transcriptase Reversa análogo de Nucleosídeo; ITRNN: Inibidor de Transcriptase Reversa Não−análogo de
Nucleosídeo; IP: Inibidor de Protease
A resistência total às três classes foi baixa, encontrada em 1,04% das amostras, sendo
fundamental para estes pacientes a introdução de novas drogas como o Raltegravir e a
Enfuvirtida, aliado a drogas que ainda mantêm uma atividade residual, como os ITRNs e IPs.
A mediana do número de drogas sem nenhuma atividade antirretroviral (Resistência Alta) foi
100%
80%
60%
40%
20%
0%
3TC FTC AZT D4T ABC DDI TDF
Suscetível Possível Resistência Resistência Intermediária Resistência Alta
elevada, 6 (P25 = 4, P75 = 9), considerando as 19 drogas em análise (7 ITRNs, 4 ITRNNs e 8
IPs).
5.1.3.2 Resistência aos ITRNs
A análise da resistência aos ARV mostrou que os ITRNs (Figura 23) foram os que
apresentaram maior nível de resistência, resultado do alto número de mutações de
resistência relacionadas a esta classe, principalmente os análogos de citosina 3TC e FTC cada
um com 316/386 (81,87%) na categoria resistência alta, exibindo um perfil de resistência
idêntico. O FTC, análogo da citidina, ainda não foi aprovado para uso durante a TARV no
Brasil, porém já exibe enorme porcentagem de resistência, o que ocorre pela seleção pelo
amplo uso do 3TC, pertencente à mesma classe de análogos, principalmente da mutação da
transcriptase reversa M184V, que confere alto nível de resistência fenotípica a estas drogas.
Figura 23- Perfil de Resistência aos Inibidores de Transcriptase Reversa análogos de Nucleosídeos:
Lamivudina (3TC), Emtricitabina (FTC), Zidovidina (AZT), Estavudina (d4T), Abacavir (ABC), Didadosina
(ddI), e Tenofovir (TDF)
Os análogos de timidina AZT e d4T apresentaram perfis de resistência muito
semelhantes, como pode ser observado na figura 23, que ocorre devido a presençade
mutações que interferem na suscetibilidade de ambos, como as TAMs, muito frequentes
neste estudo.
O Tenofovir foi o ITRN que menos apresentou altos níveis de resistência, 7/386
(1,81%), resultado da presença das mutações K65R (71,43%) e/ou e das TAMs 2,
principalmente K70R (57,14%) e K219E (42,86%), além da del67 e ins69, cada uma
100%
80%
60%
40%
20%
0%
EFV NVP DLV ETR
Suscetível Possível Resistência Resistência Intermediária Resistência Alta
encontrada em uma sequência viral, e da presença do complexo Q151M em 57,14% das
amostras. Entre os que apresentaram alto nível de resistência a esta droga, 85,71% estavam
em uso do TDF no último esquema terapêutico. O TDF foi o último ITRN aprovado para uso
durante a TARV, em 2002 (FDA, 2010) sendo aprovado no Brasil em 2004 e desde então,
amplamente utilizado. A baixa frequência de resistência completa a esta droga, deve ser
vista com atenção, devido ao grande número de amostras que apresentam três ou mais
TAMs, incluindo M41L ou T210W que reduzem a resposta ao Tenofovir (MILLER et al., 2004),
entretanto, foi a droga pertencente à classe dos ITRNs com os melhores níveis de
suscetibilidade completa, mostrando seu potencial de uso durante os esquemas de resgate.
5.1.3.3 Resistência aos ITRNNs
Os ITRNNs de primeira geração NVP, EFV e DLV apresentaram−se na categoria
resistência alta respectivamente em 63,47, 57,77 e 53,89% dos pacientes. A delavirdina (DLV)
não está mais disponível no Brasil devido a sua posologia desfavorável, porém mantémaltos
níveis de resistência, resultado da baixa barreira genética dessa classe, pois a presença de
apenas uma mutação de resistência pode levar à resistência completa a toda classe, havendo
altos níveis de resistência cruzada relacionada a estes ARVs (Figura 24).
Figura 24- Perfil de Resistência aos Inibidores de Transcriptase Reversa Não−análogos de
Nucleosídeos: Efavirenz (EFV), Nevirapina (NVP), Delavirdina (DLV) e Etravirina (ETR)
A Etravirina (ETR), aprovada no Brasil em 2009, apresentou os menores índices de
resistência alta, apenas 27/386 (6,99%), com 96,29% destes, apresentando a mutação Y181C
e, 77,78% a mutação G190A, acompanhadas de outras mutações na TR relacionadas à
100%
80%
60%
40%
20%
0%
SQV_r NFV IDV_r ATV_r FPV_r LPV_r TPV_r DRV_r
Suscetível Possível Resistência Resistência Intermediária Resistência Alta
resistência a ETR. Devido à alta barreira genética deste ITRNN de segunda geração, ele
representa uma alternativa fundamental na TARV atual, principalmente em pacientes
multiexperimentados.
5.1.3.4 Resistência aos IP
A classe dos inibidores de protease (IP) apresentou o menor número de resistência
alta, sendo o Nelfinavir (NFV), a droga que mais se apresentou nesta categoria 45,08%, e o
Darunavir (DRV) a que menos se apresentou nesta categoria, apenas 2/386 (0,52%). Os
resultados mostram a alta barreira genética desta classe, sendo necessário um grande
número de mutações para o desenvolvimento de resistência completa (Figura 25).
Figura 25- Perfil de Resistência aos Inibidores de Protease: Atazanavir/r (ATV/r), Darunavir/r (DRV/r),
Fosamprenavir/r (FPV/r), Indinavir (IDV/r), Lopinavir/r (LPV/r), Nelfinavir (NFV), Saquinavir/r (SQV/r),
e Tipranavir/r (TPV/r) ; r: potencializados com Ritonavir
O NFV, muito utilizado anteriormente, não está mais disponível no Brasil pela
posologia desfavorável e baixa eficácia quando comparado com outros IP. Muitas mutações
da PR reduzem a suscetibilidade ao nelfinavir como L23I, D30N, M46I/L, G48V/M, I84V,
N88D/S e L90M, o que pode explicar a resistência cruzada presente nesta droga, pois a
maior parte delas pode ser selecionada pelos outros IP em uso atualmente, além disso,
35,49% dos pacientes deste estudo utilizaram Nelfinavir em esquemas anteriores, o que
pode ter selecionado estas mutações.
O LPV/r, SQV/r e FPV/r, drogas empregadas em esquemas de resgate apresentaram
valores de resistência completa entre 17−19% e suscetibilidade superior a 50%, devido à
maior barreira genética desses IPs, representando ainda alternativas durante a elaboração
de um esquema de resgate, permitindo a prorrogação da introdução de novos IPs como o
DRV/r ou TPV/, ou drogas pertencentes a outras classes como a Enfuvirtida e Raltegravir,
possibilitando a utilização destes ARVs em esquemas futuros.
O DRV/r, aprovado no Brasil desde 2007, apresenta potência antiviral elevada mesmo
na presença de mutações de resistência aos IPs em uso atualmente (CLOTET et al., 2007). As
duas amostras que apresentaram resistência a este ARV carregavam as mutações de
resistência V32I, I47V, I50V e I54L associadas a L89V no primeiro, totalizando cinco
mutações, e associadas a L33F e T74P no segundo paciente, com total de seis mutações
relacionadas à resistência a esta droga, mesmo sem a prévia exposição a este ARV pelos
pacientes, que foram, no entanto, expostos a outros IP, como o NFV, SQV, ATV, IDV e LPV.
Devido à sua comprovada eficácia como droga de resgate e ao seu alto custo, o DRV é
considerado uma droga reservada para casos de multirresistência, devendo ser utilizada
apenas nas terapias de resgate (BRASIL, 2008).
O último inibidor de PR aprovado no Brasil, em meados de 2009, o Tipranavir,
também apresentou uma pequena proporção de alta resistência, apenas 9 (2,33%)
pacientes, todos com a presença de pelo menos uma mutação principal de resistência a esta
droga, I47V (41,67%), I54V (33,33%), V82L (16,67%), V82T (16,67%), I84V (25%), além das
mutações acessórias Q58E (41,67%) e T74P (8,33%). No estudo, nenhum paciente
apresentava histórico de uso de TPV, portanto essas mutações foram selecionadas sem a
pressão seletiva deste IP. No entanto, devido a sua alta barreira genética e grau de
suscetibilidade, este medicamento pode ser introduzido nos esquemas terapêuticos de
resgate.
5.1.4 Evolução imunovirológica
A análise da evolução imunovirológica foi realizada a partir da comparação entre o
resultado de contagem de Linfócitos T CD4+ e de carga viral plasmática antes (definidor da
Falha terapêutica) e 6 (±3) e 12 (±3) meses após o exame de genotipagem (Tabelas 8 e 9).
Tabela 8- Frequência dos valores de contagem de carga viral plasmática no momento do
exame de genotipagem (Falha terapêutica) e após 6 e 12 meses
Quantificação da Carga Viral
Categorias* Falha Terapêutica 6 meses PG 12 meses PG
n (386) % n (276) % n (304) %
<50 0 − 91 32,97 172 56,58
50 - 1.000 0 − 50 18,12 33 10,86
1.001 - 10.000 124 32,12 35 12,68 23 7,57
10.001 - 50.000 150 38,86 51 18,48 35 11,51
50.001 - 100.000 55 14,25 25 9,06 15 4,93
>100.000 57 14,77 24 8,70 26 8,55
Ausência 0 − 110/386 28,50 82/386 21,24
*Categorias de contagem de Carga viral plasmática do HIV-I (cópias/mL); PG: pós genotipagem.
Após o exame de genotipagem houve uma queda significativa dos níveis de carga
viral, com 51,09% dos pacientes que possuíam resultados após 6 meses, atingindo contagem
inferior a 1.000 cópias RNA/mL. Entretanto, a maior supressão da replicação viral foi
encontrada após 12 meses, quando 44,72% dos pacientes (com contagem nesse período)
alcançaram níveis de carga viral indetectáveis (<50 cópias/mL), atingindo os objetivos da
TARV, que mesmo em pacientes com falha após múltiplos esquemas, com a introdução das
novas drogas ARVs e importantes resultados nesse grupo, visa a supressão viral completa
(carga viral indetectável) (STEIGBIGEL et al., 2008; YAZDANPANAH et al., 2009; THOMPSON
et al., 2010). A supressão viral completa está associada à resposta imunológica mais robusta
e duradoura e, além de interromper o acúmulo progressivo de mutações, tem impacto na
progressão da doença e morte (MURRI et al., 2006; ZACCARELLI et al., 2009).
Tabela 9- Frequência dos valores de contagem de Linfócitos T CD4+, Nadir, no momento do
exame de genotipagem (Falha terapêutica) e após 6 e 12 meses.
Contagem T CD4+
Categorias* Nadir Falha Terapêutica 6 meses PG 12 meses PG
n (379) % n (386) % n (271) % n (304) %
>500 8 2,11 46 11,92 42 15,50 59 19,41
350-50025 6,60 55 14,25 54 19,93 69 22,70
200-349 78 20,58 100 25,91 76 28,04 83 27,30
50-199 157 41,42 140 36,27 67 24,72 70 23,03
<50 111 29,29 45 11,66 32 11,81 23 7,57
Ausência 7/386 1,81 0 − 115/386 29,79 82/386 21,24
*Categorias de contagem de Linfócitos T CD4+ (células/mm3); PG: pós genotipagem.
Um ganho progressivo de Linfócitos T CD4+ após a genotipagem foi observado, sendo
mais significativo após 12 meses, quando 42,11% dos pacientes (com contagem nesse
período) estavam com os níveis superiores a 350 células/mm3, mostrando uma resposta da
função imune, com forte impacto na sobrevida, aparecimento de doenças oportunistas e
progressão para aids (MELLORS et al., 1997).
Figura 26-Média de contagem de T CD4+ (células/mm3) e carga viral (log10 cópias/mL) no momento
do exame de genotipagem (FT− Falha terapêutica) e 6 e 12 meses após o teste
A figura 26 apresenta as médias de contagem de T CD4+ e carga viral, mostrando os
eventos de diminuição da carga viral e aumento dos valores de T CD4+ concomitantes, após
o teste de resistência genotípico e instalação de uma terapia de resgate. Após 12 meses, as
respostas virológica (carga viral) e imunológica (T CD4+) concordantes ocorreram na maioria
dos pacientes, com 74,09% dos pacientes com diminuição dos níveis de carga viral
plasmática (média de perda= 2,16 log10 cópias/mL) também apresentando aumento de
células T CD4+ (média de ganho= 158,74 células/mm3).
A evolução imunovirológica encontrada neste trabalho, principalmente 12 meses
após a genotipagem, mostra os grandes benefícios da terapia de resgate nesses pacientes,
que foi otimizada pelo teste de genotipagem, levando a uma supressão completa da
replicação viral e preservação da função imunológica, os principais objetivos da TARV.
4,34
343,67
304,94
258,08 3,12
2,67
400 4,5
350 4,0
300 3,5
250 3,0 TCD4+
log10
200 2,5
150 2,0
FT 6 meses 12meses
Co
nt
ag
em
de
TC
D4
+
(c
él
ul
as
/m
m
3 )
Ca
rg
a
vi
ra
l
(lo
g1
0
có
pi
as
/m
L)
SUBTIPOS HIV-1
BF
17,78%
F1
8,89%
BB
73,33%
5.2 Grupo Pediátrico
O grupo foi composto por um total de 45 crianças, das quais quatro eram virgens de
tratamento, e 41 apresentavam falha na terapia ARV.
5.2.1 Subtipo viral
A subtipagem do H V−1, realizada pela região da PR e TR viral revelou que o subtipo B
foi o mais frequente, encontrado em 33/45 (73,33%) das amostras, seguido pelas formas
híbridas B e F (BF ou FB) (17,78%) e subtipo F1 (8,89%). O subtipo C não foi encontrado neste
grupo (Figura 27). As sequências determinadas como subtipo B representaram 73,33% e as
não−B representaram 26,67% do total.
Figura 27- Distribuição dos subtipos e formas híbridas do HIV−1 circulantes nos pacientes do grupo
Pediátrico, atendidos pelo Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu, ponto
executor da Rede Nacional de Genotipagem, nos anos de 2008 e 2009
O subtipo B do HIV−1 em estudos brasileiros incluindo crianças apresentou uma
frequência de 67,3 a 78,7%, e o subtipo F, uma frequência de 6 a 15,4% (BRINDEIRO et al.,
2002; MACHADO et al., 2004; ALMEIDA et al., 2009), similares aos nossos resultados. Os
mosaicos B e F (PR e TR), presentes em 17,78% dos pacientes deste estudo, possuem uma
frequência de 4,4 a 13,7% nos estudos realizados em crianças, com um expressivo aumento
da circulação destes mosaicos (BRINDEIRO et al., 2002; DE OLIVEIRA et al., 2008; ALMEIDA et
al., 2009).
5.2.2 Mutações de resistência
Nos pacientes com genotipagem utilizada para indicação à terapia, virgens de
tratamento (4 pacientes), foram encontradas apenas mutações de resistência acessórias ou
secundárias. A ausência de mutações primária neste grupo está de acordo com estudos
anteriores, que exibem baixa prevalência de mutações primárias em virgens de tratamento
(ALMEIDA et al., 2009). Em um paciente houve ausência total de mutações de resistência;
dois pacientes apresentaram a mutação V106I na TR, um polimorfismo comum, que
correlacionado com outras mutações que já foi associado com uma diminuição na resposta a
ETR , no entanto, não diminui a susceptibilidade aos ITRNNs (VINGERHOETS et al., 2007), e
um destes também apresentava a mutação da PR L10V, que ocorre em 5−10% das pessoas
não tratadas, e está associada à resistência a maioria dos IPs apenas na presença de outras
mutações (RHEE et al., 2003; SHAFER; SCHAPIRO, 2008). A mutação V118I da TR encontrada
em um paciente ocorre em aproximadamente 2% das pessoas não tratadas, levando a um
baixo nível de resistência ao 3TC e possivelmente a outros ITRNs, quando presente com
outras mutações (SHAFER et al., 2007).
Foi identificada a presença de uma ou mais mutações de resistência em todos os
pacientes deste grupo com falha na terapia (41 pacientes), sendo encontradas até 25
mutações de resistência em um mesmo indivíduo (Tabela 10). As mutações de resistência
relacionadas aos ITRNs foram as mais frequentes, atingindo 92,68% dos pacientes, seguidas
às relacionadas aos ITRNNs, em 78,05% dos pacientes. As mutações principais e acessórias
da protease ocorreram em 43,9 e 58,54% dos pacientes, respectivamente.
Tabela 10- Frequência do número de mutações de resistência na PR e TR (total e classes)
Mutações na PR e TR associadas à Resistência
Total de Mutações Protease
Principais Acessórias
n % n % n %
0 − − 0 23 56,10% 17 41,46%
1 2 4,88% 1 2 4,88% 11 26,83%
2 3 7,32% 2 1 2,44% 4 9,76%
4 3 7,32% 3 2 4,88% 6 14,63%
5 4 9,76% 4 4 9,76% 0 −
6 5 12,20% 5 4 9,76% 2 4,88%
7 1 2,44% 6 4 9,76% 0 −
8 2 4,88% 7 1 2,44% 1 2,44%
9 1 2,44%
10 2 4,88%
11 4 9,76% Transcriptase Reversa
12 1 2,44% ITRN ITRNN
13 1 2,44% n % n %
15 1 2,44% 0 3 7,32% 9 21,95%
17 1 2,44% 1 4 9,76% 8 19,51%
18 2 4,88% 2 0 − 6 14,63%
19 4 9,76% 3 6 14,63% 7 17,07%
20 2 4,88% 4 5 12,20% 8 19,51%
21 1 2,44% 5 6 14,63% 2 4,88%
25 1 2,44% 6 5 12,20% 0 −
7 4 9,76% 1 2,44%
8 5 12,20%
9 2 4,88%
12 1 2,44%
PR: Protease; TR: Transcriptase Reversa; ITRN: Inibidor de Transcriptase Reversa análogo de Nucleosídeo; ITRNN: Inibidor
de Transcriptase Reversa Não−análogo de Nucleosídeo
Mutações de resistência a uma, duas e as três classes de ARVs foram encontradas em
12,2, 39,02 e 48,78% dos pacientes. Estes valores são semelhantes aos dados de exposição
às drogas pelo grupo de pacientes em falha (Tabela 11).
Tabela 11- Frequência da exposição aos antirretrovirais e presença de mutações deresistência
por classe de droga no grupo de pacientes com falha na terapia
Variáveis
Exposição aos ARVs Mutações de Resistência
n (41) % n (41) %
Nenhum 0 - 0 -
1 Classe
ITRN 4 100,0 3 60,00%
ITRNN 0 − 1 20,00%
IP 0 − 1 20,00%
Total 4 9,76 5 12,20%
2 Classes
ITRN + ITRNN 14 73,68 10 62,50%
ITRN + IP 5 26,32 5 31,25%
ITRNN + IP 0 − 1 6,25%
Total 19 46,34 16 39,02%
3 Classes
ITRN + ITRNN + IP 18 43,90% 20 48,78%
ARVs: Antirretrovirais; ITRN: Inibidor de Transcriptase Reversa análogo de Nucleosídeo; ITRNN: Inibidor de Transcriptase
Reversa Não−análogo de Nucleosídeo; IP: Inibidor de protease.
5.2.2.1 Mutações de resistência aos ITRNs
As mutações T215Y e M184V da TR foram as mais frequentes neste estudo, ambas
com 60,98% (Figura 28), semelhante aos encontrados por Almeida e colaboradores (2009),
no qual mutações nestes códons aparecem com frequência de 69,6 e 56,5% nas crianças em
falha na TARV, respectivamente. Esta grande proporção ocorre, pois estas mutações são
selecionadas pelos ARVs mais utilizados na população pediátrica, o AZT e 3TC. Entre os que
apresentaram a mutação T215Y, 40% estavam em uso de AZT, porém 96% já haviam sido
expostos a esta droga, e todos os pacientes com a presença da mutação M184V estavam em
uso de 3TC no momento do exame de genotipagem (p<0,0001).
78,05%
60,98% 58,54%
48,78%
39,02% 39,02%
36,59%
21,95% 21,95% 19,51%
19,51% 12,20%
4,88% 2,44%
2,44%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Figura 28- Frequência das mutações de resistência aos ITRNs
As TAMs, mutações selecionadas pelos análogos da timidina AZT e d4T, foram muito
frequentes neste grupo, com a presença de uma ou maisdestas mutações detectadas em
85,37% das amostras, semelhante à alta frequência encontrada por Puthanakit et al. (2010).
Entre os pacientes com a presença de TAMs, 71,43% estavam em uso de análogos de
timidina, e 97,14% já haviam sido expostos durante a terapia.
A análise das vias mutacionais das TAMs, mostrou que 54,29% das sequências que
apresentavam TAMs possuíam mutações pertencentes a apenas uma dessas vias
mutacionais, sendo estas distribuídas em 68,42% na via TAM 1, e 31,58% na via TAM 2. Os
45,71% restantes possuíam mutações das vias TAM 1 + 2 (Tabela 12) Dentre os
representantes que pertenciam as duas vias, 56,25% das sequências eram compostas por
TAMs 1 associadas apenas a TAM 2 D67N, padrão comumente encontrado (COZZI−LEPRI et
al., 2005). As TAMs K70R e L210W, que raramente ocorrem no mesmo genoma, foram
encontradas juntas em apenas uma amostra, concordando com a literatura (YAHI et al.,
2000).
Tabela 12- Frequência das mutações TAMs e perfil das vias na população de estudo
Mutações TAM vias 1 e 2 Perfil - vias TAM
n (41) % n (35) %
TAM 1
M41L 24 58,54% TAM 1 13 37,14%
L210W 15 36,59% TAM 2 6 17,14%
T215Y
TAM 2
25 60,98% TAM 1 + 2 16 45,71%
D67N 18 43,90%
K70R 9 21,95%
T215F 0 0,00%
K219Q 6 14,63%
K219E 3 7,32%
TAM:Mutações associadas aos timidínicos
As mutações de multirresistência aos ITRNs, Q151M, inserção no códon 69 da TR, e
deleção no códon 67 não foram encontradas neste grupo de pacientes, beneficiando o uso
desta classe de drogas. O mesmo ocorreu com a mutação K65R da TR, o que pode ser
explicado pela alta frequência de TAMs nesse grupo, pois a presença de ambas na mesma
variante pode levar a uma reversão da resistência conferida por estas mutações, através da
interferência mútua no mecanismo de resistência causado por elas (MCCOLL et al., 2004;
PARIKH et al., 2006).
As mutações V118I e E44A/D, são mutações acessórias que ocorrem geralmente com
TAMs 1, reduzindo a suscetibilidade e atividade clínica da maioria dos ITRNs (ROMANO et al.,
2002; GIROUARD et al., 2003). Neste estudo, a associação de V118I + TAM 1 ocorreu em
87,5% das amostras contendo V118I. Todas as amostras com a presença das mutações
E44A/D estavam associadas à pelo menos uma TAM 1.
5.2.2.2 Mutações de resistência aos ITRNNs
As mutações mais frequentes associadas aos ITRNNs, foram nos códons 190 e 103,
sendo G190A e K103N as principais, encontradas em 24,39% das amostras. As mutações
K103 são encontradas em maior frequência na literatura em grupos pediátricos em falha,
variando de 35 a 52,5% (DE OLIVEIRA et al., 2008; ALMEIDA et al., 2009; PUTHANAKIT et al.,
2010), e as mutações G190 foram encontradas por Puthanakit et al. (2010) com valores
muito semelhantes aos nossos, 31% na população de estudo. Estas mutações são
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
selecionadas durante o uso de EFV e NVP, levando a uma diminuição da suscetibilidade a
estas drogas. Entre os pacientes com a presença de K103N, 60% estavam em uso de EFV
(p=0,0029), e 20% estavam em uso de NVP, além disso, todos haviam sido expostos a estas
drogas durante a terapia. Entre os pacientes com a presença de G190A, nenhum estava em
uso de EFV, e 50% estava em uso de NVP (p=0,0301); no entanto, 90% já haviam sido
expostos a estas drogas durante a terapia. A frequência das mutações de resistência
relacionadas aos ITRNNs está representada na figura 29.
Figura 29- Frequência das mutações de resistência aos ITRNNs
A análise das 9 sequências virais com ausência de mutações relacionadas aos ITRNNs
mostrou que 8 (88,89%) destes pacientes nunca foram expostos a esta classe, e apenas um
paciente já havia utilizado EFV em esquemas anteriores, não sendo indicada a terapia
sequencial com outros ITRNNs de primeira geração, devido a possibilidade da presença de
mutações de resistência nas populações minoritárias.
5.2.2.3 Mutações de resistência aos IP
As mutações principais associadas aos IP mais frequentes foram I54V e V82A, com
29,27% cada, seguidas pelas mutações M46I e L90M, presentes em 26,83% e 24,39% das
amostras, respectivamente, semelhantes a outros estudos nesta faixa etária (DE OLIVEIRA et
al., 2008; ALMEIDA et al., 2009). A frequência das mutações principais relacionada a
resistência aos IPs pode ser verificada na figura 30.
34,15%
29,27%
21,95% 21,95%
21,95%
12,20%
9,76% 9,76% 9,76%
7,32% 7,32% 7,32%
4,88%
2,44%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
34,15%
31,71% 31,71%
24,39%
14,63%
12,20%
7,32%
7,32% 4,88% 4,88% 4,88%
4,88% 2,44%
2,44%
Figura 30- Frequência das mutações de resistência principais aos IP
A mutação L90M não foi encontrada na mesma sequência com a mutação D30N, este
duplo mutante teria seu fitness diminuído, como discutido anteriormente. As mutações
secundárias ou acessórias da protease mais frequentes foram nas posições 10 (56,10%), e 71
(31,71%) (Figura 31).
Figura 31- Frequência das mutações de resistência acessórias aos IP
56,10%
31,71%
7,32% 7,32%
4,88% 4,88% 4,88% 4,88%
2,44% 2,44% 2,44% 2,44%
5.2.3 Resistência aos ARVs
5.2.3.1 Resistência geral
Os critérios para a classificação com resistência e sensibilidade total a uma classe de
drogas foram discutidos no item 5.1.3.1.
A classe dos ITRNNs apresentou a maior frequência de indivíduos com resistência
total (48,78%) às quatro drogas analisadas, seguidos pelos ITRNs, com 39,02% de resistência
total às sete drogas da classe. Os IPs apresentaram o melhor desempenho, com apenas um
paciente com resistência total às oito drogas da classe, mostrando seu grande potencial de
uso na terapia de resgate (Tabela 13).
Tabela 13- Suscetibilidade as classes dos ITRNs, ITRNNs e IPs (suscetibilidade e resistência
totais)
Classes Sensibilidade total Resistência total
n (41) % n (41) %
ITRN (7) 5 12,20 16 39,02
ITRNN (4) 9 21,95 20 48,78
IP (8) 23 56,10 1 2,44
3 classes 2 4,88 1 2,44
ITRN: Inibidor de Transcriptase Reversa análogo de Nucleosídeo; ITRNN: Inibidor de Transcriptase Reversa Não análogo de
Nucleosídeo; IP: Inibidor de Protease
A resistência total às três classes foi baixa, encontrada em apenas um paciente,
sendo fundamental a introdução de novas drogas como o Raltegravir e a Enfuvirtida, aliado a
drogas que ainda mantêm uma atividade residual, como os ITRNs e IPs, principalmente por
se tratar de um paciente com 14 anos no momento da genotipagem, o que permite a
utilização destes novos ARVs. A mediana do número de drogas sem nenhuma atividade
antirretroviral (Resistência Alta) foi de 5 (P25=3, P75=10), considerando as 19 drogas em
análise (7 ITRNs, 4 ITRNNs e 8 IPs).
5.2.3.2 Resistência aos ITRNs
Os análogos de citosina 3TC e FTC apresentaram os maiores índices de resistência
alta (60,98%), exibindo um perfil idêntico, principalmente pela presença da mutação M184V
da TR, selecionada rapidamente pelo 3TC, droga amplamente utilizada, que confere alto
nível de resistência fenotípica a estas drogas. O perfil de resistência aos ITRNs é apresentado
na figura 32.
43
	2OBJETIVOS
	3CASUÍSTICA
	4MÉTODOS
	5RESULTADOS E DI
	CUSSÃO