Análise crítica da técnica de Imunofluorescência Direta no diagnóstico da raiva

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A n á l i s e c r í t i c a d a t é c n i c a d e 
imunofluorescência direta no diagnóstico 
laboratorial da raiva do Instituto Pasteur 
de São Paulo, Brasil
Nathália de Barros Salvino Alves
Instituto Pasteur
Graciane Maria Medeiros Caporale
Instituto Pasteur 
Juliana Galera Castilho
Instituto Pasteur 
Rafael de Novaes Oliveira
Instituto Pasteur 
Carla Isabel Macedo
Instituto Pasteur 
Enio Mori
Instituto Pasteur 
 Samira Achkar
Instituto Pasteur
https://dx.doi.org/10.37885/220909948
RESUMO
Embora a Organização Mundial da Saúde preconize a técnica de Imunofluorescência Direta 
(IFD) como padrão ouro para o diagnóstico laboratorial da raiva, fatores externos podem 
influenciar o limiar de detecção do antígeno viral, como a conservação da amostra, a estru-
tura laboratorial, os insumos utilizados e o treinamento dos profissionais. Objetivos: analisar 
criticamente a técnica de IFD no Laboratório de Diagnóstico da Raiva do Instituto Pasteur, 
a fim de detectar eventuais fatores externos que possam limitar ou diminuir sua acurácia, 
visto que o resultado laboratorial tem papel determinante na tomada de decisão quanto ao 
tratamento de indivíduos expostos ao risco de infecção pelo vírus da raiva. Métodos: foram 
analisados os dados referentes ao estado de conservação da amostra, bem como os resul-
tados do diagnóstico de 7266 amostras de Sistema Nervoso Central (SNC) de animais sus-
peitos recebidas durante o ano de 2019. Foi realizada a avaliação prática dos procedimentos 
laboratoriais relacionados à IFD. Resultados e Conclusões: 96.8% das amostras recebidas 
para diagnóstico apresentavam condições adequadas de conservação. A fixação do tecido 
cerebral em acetona demonstrou equivalência sob ambas condições analisadas; à tempe-
ratura ambiente e a -20ºC. Os sistemas utilizados para diluição do conjugado apresentaram 
eficácia ficando evidente a viabilidade da substituição de suspensão de CVS produzido in 
vivo para in vitro. Resultados da IFD negativos apresentaram concordância de 99,9% com 
as demais técnicas aplicadas, o que demonstra confiabilidade nesta metodologia diagnósti-
ca. A IFD de amostras de equinos e amostras em condições inadequadas de conservação 
apresentaram sensibilidade de 50% e 75%, respectivamente, reforçando a necessidade de 
metodologias moleculares complementares. 
Palavras-chave: Raiva, Imunofluorescência Direta, Diagnóstico Laboratorial. 
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INTRODUÇÃO
A raiva é uma antropozoonose mantida por carnívoros e quirópteros, que causa uma 
encefalite aguda progressiva altamente letal. Tem como agente causador um vírus RNA 
de fita simples do gênero Lyssavirus, pertencente à subfamília Alpharhabdovirinae, família 
Rhabdoviridae, ordem Mononegavirales, espécie Lyssavirus rabies (RABV) (ICTV, 2021). 
O diagnóstico laboratorial é fundamental para direcionar o programa de controle da 
doença, visto que com os resultados podem ser estabelecidas medidas profiláticas, bem 
como monitorar áreas geográficas acometidas. Para tanto, o mesmo deve ter alta acurácia e 
rapidez no prazo para a execução, além de alta sensibilidade e especificidade diagnósticas. 
O Laboratório de Diagnóstico da Raiva do Instituto Pasteur de São Paulo (IP/SP) 
é referência Nacional para o diagnóstico da raiva no Brasil, além de Centro colaborador 
da Organização Pan-americana de Saúde (OPAS). A Organização Mundial da Saúde 
(OMS) preconiza a técnica de Imunofluorescência Direta (IFD) como padrão ouro para 
o diagnóstico confirmatório post mortem da raiva, que é realizada no IP/SP desde 1964 
(GAMBETA et al., 1979). 
Fatores externos podem influenciar o limiar de detecção do antígeno viral por IFD, tais 
como a má conservação da amostra, a baixa qualidade dos insumos utilizados (em particu-
lar o conjugado antirrábico) e as condições inadequadas dos equipamentos (por exemplo, 
diminuição da intensidade da lâmpada emissora de luz ultravioleta do microscópio de fluo-
rescência devido ao uso excessivo), assim, estes devem ser minimizados para não limitar 
ou diminuir a acurácia da técnica. Neste contexto é de suma importância que se lance mão 
de outras metodologias laboratoriais, concomitantemente à IFD, como o isolamento viral, 
que pode ser realizado em células (IVCC) ou em camundongos (IVC), além das técnicas 
moleculares, como a Reação de Transcriptase Reversa seguida pela reação em cadeia pela 
polimerase (RT-PCR), e o sequenciamento genético.
Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi analisar criticamente o diagnóstico la-
boratorial da raiva por meio da técnica de IFD no IP/SP, visto que o mesmo tem papel de-
terminante para a tomada de decisão quanto ao tratamento de indivíduos expostos. Para 
tanto, os resultados da IFD em relação às demais técnicas aplicadas na rotina laboratorial 
foram utilizados como parâmetro para esta análise.
REVISÃO DE LITERATURA
Os primeiros estudos relacionados à IFD datam de 1942, quando Albert Coons e 
col. (1949) demonstraram a marcação de anticorpos antipneumococos com fluoresceína 
em tecido pulmonar. Posteriormente, em 1958, Goldwasser e Kissling a adaptaram para a 
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detecção de antígenos virais da raiva no SNC. Em 1973 foi então modificada por Dean & 
Abelseth para o início da produção de conjugados obtidos a partir de concentrados de soros 
hiperimunes provenientes de anticorpos específicos através do tratamento com sulfato de 
amônia (PERRIN, 1996).
O princípio da técnica de IFD se baseia na detecção de antígeno viral por meio de um 
conjugado antirrábico, o qual é obtido a partir da conjugação do fluorocromo isotiocianato 
de fluoresceína (FITC) à anticorpos específicos purificados, que podem ser provenientes de 
soros hiperimunes de animais imunizados, como equinos e coelhos; de partículas inteiras do 
vírus; de ribonucleoproteinas (RNP) purificadas ou ainda por tecnologia de hibridomas a partir 
de anticorpos monoclonais (RUDD et al., 2005). Conjugados produzidos a partir de soros 
de animais imunizados com RNP purificadas são utilizados em maior escala no diagnóstico, 
pois apresentam alta especificidade, já que a nucleoproteína é a mais conservada estrutural-
mente, e mantem-se conservada em amostras fixas do vírus da raiva. (CAPORALE, 2010). 
É necessário que o diagnóstico laboratorial tenha alta sensibilidade, especificidade e 
rápida execução, pois o resultado expresso está diretamente envolvido com as condutas profi-
láticas, bem nas ações de vigilância e controle que serão posteriormente desenvolvidas. A IFD 
contempla todas essas especificações, comprovando ser, nos últimos 50 anos, o método 
ideal para o diagnóstico da raiva, assim, além das práticas analíticas, os fatores pré-analíticos 
são fundamentais para o bom desempenho desta metodologia (RUPRECHT et al., 2018).
A coleta e o transporte do SNC para análise laboratorial devem ser realizados de forma 
que minimizem eventuais danos à amostra no ato de seu processamento. É importante que 
o SNC seja encaminhado com estruturas primordiais como tronco encefálico e cerebelo, 
visto que há possibilidade de propagação unilateral do vírus, especialmente em animais de 
grande porte, com baixa carga viral. As amostras devem ser encaminhadas sob refrigera-
ção ou congelamento, preferencialmente o mais rápido possível, a partir da data de coleta. 
Amostras em decomposição, com coloração esverdeada ou até liquefeitas podem impossi-
bilitar o desempenho da IFD, e gerar resultados não fidedignos (RUPRECHT et al., 2018).
MÉTODOS 
Foram analisados os dados referentes às amostras encaminhadas ao IP/SP para diag-
nóstico laboratorial da raiva durante o ano de 2019. Foi empregada uma planilha em progra-
ma Microsoft Excel© 2007 para o registro das seguintes informações: (a) espécie animal; 
(b) estadode conservação da amostra [em condições adequadas (in natura) (Figura 1), em 
condições inadequadas (Figura 2), quando recebidas em avançado estado de putrefação; e 
impossibilitadas (Figura 3), quando a amostra não apresentava condições de processamen-
to em qualquer técnica diagnóstica, devido à ausência de material encefálico ou à fixação/
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ressecamento do mesmo]; e (c)resultados das técnicas laboratoriais [IFD, IVCC, IVC, RT-
PCR/sequenciamento genético]. 
Figura 1. Amostra de SNC de cão em 
condições adequadas
Figura 2. Amostra de SNC de bovino 
em condições inadequadas
Figura 3. Amostra de “morcego” 
impossibilitado para diagnóstico
A análise dos procedimentos laboratoriais e da técnica de IFD foi realizada durante três 
meses, de forma randomizada, em que foram estabelecidas 15 amostras semanalmente, 
totalizando 180 amostras, independentemente da espécie animal e do estado de conservação 
da amostra. Foram analisados 26 bovinos; 08 equinos; 11 primatas não humanos; 01 ovino; 
01 suíno; 01 caprino; 04 gambás; 01 lobo; 46 morcegos; 50 cães e 31 gatos. O critério de ex-
clusão em relação aos morcegos foi definido de acordo com o tamanho do espécime, ou seja, 
animais com pouco material encefálico devido ao tamanho reduzido não foram analisados. 
Para cada amostra foram confeccionadas seis lâminas do mesmo fragmento de SNC por 
decalque (“imprint”) sobre uma lâmina, que foram fixadas em acetona Merck® PA gelada por 
1 hora, sendo três em freezer a -20ºC e três mantidas à temperatura ambiente. Estabeleceu-
se como critério de avaliação da fixação do tecido, a presença ou ausência de campos ce-
lulares, sendo esta avaliação realizada no momento da leitura das lâminas em microscópio 
de fluorescência. A IFD foi realizada segundo protocolo estabelecido por Dean em 1996. 
Foi utilizado conjugado monoclonal antivírus da raiva comercial (Millipore MAB0051®) 
diluído em suspensões de vírus fixo Challenge Virus Standard (CVS) produzido in vivo 
(cérebro de camundongos) e in vitro (células BHK-21), além de Solução Salina Tamponada 
(SST) pH7.4-7.6. A utilização do diluente produzido in vitro seguiu protocolo estabelecido 
por Garcia e col. 2016, em que a concentração dos diluentes de CVS in vitro foi aumentada 
em 4 vezes, para a obtenção de 100% de neutralização do conjugado. A montagem das 
lâminas foi realizada com solução de glicerina Merck diluída a 50% em SST pH7.4-7.6.
A leitura das lâminas foi realizada em microscópio de epi-iluminação de fluorescência 
ZEISS SCOPE A1-AX10 (Zeiss®), filtro ultravioleta, com aumento de 400x, por dois obser-
vadores. Foram avaliados os controles positivos e negativos; a inibição de fluorescência 
nos campos com CVS; a densidade celular para avaliação da fixação do tecido cerebral; 
a intensidade de fluorescência nos diferentes fragmentos de SNC de herbívoros, segundo 
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critérios estabelecidos por Carrieri (2006) [(+) rara presença de antígeno com até 3 inclu-
sões, (++) distribuição de antígeno espaça com mais campos negativos; (+++) distribuição 
homogênea de antígeno por todo campo com poucos campos negativos; (++++) distribuição 
de antígenos na maioria do campo sem campos negativos]. 
Na rotina laboratorial do IP/SP, todas as amostras provenientes de equinos, bem como 
as que são recebidas em condições inadequadas de conservação são submetidas ao diag-
nóstico molecular, visto que eventuais dificuldades são observadas no diagnóstico por IFD 
nestas amostras. Neste contexto, foi utilizada a técnica de RT-PCR seguido do sequen-
ciamento do DNA como padrão ouro para a análise das medidas de desempenho da IFD 
(sensibilidade, especificidade e acurácia) especificamente nestas amostras. 
RESULTADOS
Foram analisados os dados referentes às 7266 amostras recebidas para diagnóstico 
laboratorial da raiva no IP/SP sendo o estado de conservação das mesmas apresentado 
na Tabela 1. As amostras em avançado estado de putrefação foram classificadas como 
inadequadas, contudo, foram processadas igualmente às demais. 
Tabela 1. Estado de conservação das amostras recebidas para diagnóstico da raiva no IP/SP – 2019.
Mês Total de Amostras Recebidas 
Amostras em Condições 
Adequadas
Amostras em Condições 
Inadequadas Amostras Impossibilitadas
Janeiro 671 630 06 35
Fevereiro 489 462 08 19
Março 558 550 02 06
Abril 463 445 10 09
Maio 756 737 08 11
Junho 424 416 04 04
Julho 573 554 05 14
Agosto 458 446 05 07
Setembro 474 464 07 03
Outubro 661 645 08 08
Novembro 821 794 09 18
Dezembro 918 890 05 22
TOTAL 7266 7033 (96.8%) 77 (1.1%) 156 (2,1%)
Positivos 
Negativos
192
6918
191
6842
01
76
-
-
Impossibilitados 156 - - -
A avaliação da fixação em acetona PA gelada nas 180 amostras demonstrou que 
ambos os procedimentos (a -20ºC e a temperatura ambiente) apresentaram similar eficá-
cia. A densidade celular foi concordante ao se analisar o mesmo fragmento nas lâminas 
fixadas mantidas nas diferentes temperaturas (Figura 4). 
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Na avaliação da utilização do diluente de CVS produzido in vivo e in vitro, os resulta-
dos da leitura da IFD demonstraram concordância entre as lâminas testadas. Houve neu-
tralização do conjugado (reação Antígeno-Anticorpo) diluído com suspensão de SNC de 
camundongos infectados bem como do diluente preparado a partir das culturas de células 
BHK-21 infectadas (Figura 5). 
A intensidade de fluorescência foi avaliada especificamente em fragmentos de SNC de 
16 bovinos, 04 equinos e 02 ovinos positivos, visto que nestas espécies torna-se possível a 
confecção de maior número de lâminas de diferentes fragmentos, pelo tamanho da amostra, 
além do fato de que a positividade nestas espécies é mais frequente. No período de um ano 
(2015-2016) no setor de diagnóstico da raiva do IP/SP, Centoamore (2017) observou que 
32,8% (39/119) dos bovinos foram positivos para raiva. De modo semelhante, no período de 
2017 a 2018, Souza (2019) observou que 31,25% (25/80) dos equinos foram positivos para 
raiva (SOUZA 2019). Os resultados apontaram que fragmentos de cerebelo (CB) e tronco 
encefálico (TE) apresentaram um aumento na intensidade de células infectadas, com nume-
rosos corpúsculos de inclusão de forma dispersa, em relação ao hipocampo (HC) e córtex 
(CX). Em alguns fragmentos destas estruturas (HC e CX) não foram visualizadas células 
infectadas nem mesmo material antigênico, entretanto, a positividade ocorreu nos demais 
fragmentos da mesma amostra (Tabela 2). 
Figura 4. Amostra de SNC de Morcego positiva para a raiva por IFD. A/C: Tecido fixado em Acetona gelada à -20ºC. B/D: 
Tecido fixado em Acetona gelada a temperatura ambiente.
A C 
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B D 
Figura 5. Amostra de SNC de bovino positivo para a raiva por IFD. (A) Diluição de conjugado em suspensão de cérebro 
de camundongos infectados (CVS). (B) Diluição de conjugado em suspensão de vírus produzido em cultura de células 
BHK21. (C, D) Diluição de conjugado em solução de PBS pH7.4-7.6.
A C 
B D 
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Tabela 2. Intensidade de fluorescência nos diferentes fragmentos de SNC de herbívoros positivos para a raiva. HC: 
Hipocampo, CX: Córtex Cerebral, CB: Cerebelo, TE: Tronco Encefálico, (-): Negativo, NA: Não Avaliado, (+) rara presença de 
antígeno, (++) distribuição de antígeno com mais campos negativos, (+++) distribuição de antígeno com poucos campos 
negativos, (++++) distribuiçãode antígenos sem campos negativos.
Amostra Espécie HC CX CB TE
1 Equino + + + ++
2 Bovino +++ +++ ++++ ++++
3 Bovino ++ ++ +++ +++
4 Bovino ++++ ++++ ++++ ++++
5 Ovino ++++ ++++ NA ++++
6 Bovino NA +++ NA +++
7 Bovino ++++ ++++ ++++ NA
8 Bovino NA +++ NA NA
9 Bovino NA ++++ NA ++++
10 Bovino +++ +++ +++ +++
11 Bovino + + + +
12 Bovino +++ +++ +++ +++
13 Bovino +++ NA + NA
14 Bovino NA NA +++ +++
15 Bovino +++ +++ +++ NA
16 Ovino NA +++ +++ NA
17 Equino ++ - + +
18 Equino NA ++ +++ +++
19 Bovino +++ +++ +++ +++
20 Bovino +++ +++ +++
21 Equino - + + +
22 Bovino - - + ++
Do total de amostras recebidas, 7110 (98%) foram analisadas por IFD, das quais 183 
resultaram positivas (2.6%). Quanto aos resultados negativos houve concordância de 99.9% 
(6915/6924) com as demais técnicas aplicadas. Este dado reflete 0.13% (n=9) de resultado 
falso-negativo por IFD. As amostras provenientes de equinos corresponderam à 56% (5/9) 
destes casos (Tabela 3). 
Tabela 03. Amostras com resultados Falso-Negativos por IFD. POS: Positivo; NEG: Negativo; MH: Linhagem compatível 
com morcego hematófago; NR: Não Realizado.
Amostra Espécie IFD IVCC IVC RT-PCR SequenciamentoGenético
1 Equino NEG NR NR POS MH
2 Morcego NEG POS POS
3 Equino NEG NR NR POS MH
4 Equino NEG NR NR POS MH
5 Equino NEG NR NR POS MH
6 Equino NEG NR NR POS MH
7 Bovino NEG NR NR POS MH
8 Morcego NEG POS POS POS MH
9 Morcego NEG POS POS POS MH
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Em relação às amostras classificadas como inadequadas houve 98.7% (76/77) de 
concordância entre os resultados negativos da IFD e RT-PCR. Apenas em uma amostra 
inadequada, proveniente de um bovino (amostra 7), não foi possível determinar o resultado 
da IFD devido a reações inespecíficas, entretanto, houve positividade pela RT-PCR (Tabela 
3). Em três amostras de morcegos classificadas como adequadas para diagnóstico foi ob-
servada a mesma dificuldade, sendo as mesmas submetidas ao diagnóstico molecular, 
resultando negativas. As medidas de desempenho da IFD estão demonstradas na tabela 04. 
Tabela 4. Medidas de Desempenho da técnica de IFD no Diagnóstico do IP/SP em amostras de equinos e amostras em 
condições inadequadas de conservação.
IFD AMOSTRAS DE SNC DE EQUINOS AMOSTRAS DE SNC EM CONDIÇÕES INADEQUADAS
SENSIBILIDADE 50% 75%
ESPECIFICIDADE 100% 100%
ACURÁCIA 92% 98.7%
DISCUSSÃO 
Em decorrência do período de incubação relativamente longo, que possibilita o suces-
so da neutralização viral pela imunidade passiva (soro hiperimune) ou pela imunidade ativa 
(vacinação) antes que o vírus atinja o tecido nervoso, a raiva é a única zoonose cujo trata-
mento profilático humano depende essencialmente do diagnóstico laboratorial de animais 
suspeitos (OPAS, 2001). Para tanto, as técnicas aplicadas devem ter alta sensibilidade e 
especificidade, além disso, devem estar associadas à outras metodologias complementares 
(KOTAIT et al., 2009). 
O Laboratório de Diagnóstico da Raiva do IP/SP é responsável em realizar o diagnóstico 
de aproximadamente 65% do total de animais suspeitos do Estado de São Paulo (MARTINS, 
2015). Segundo Silva (1973), a IFD reúne indiscutivelmente as vantagens de rapidez e 
especificidade, quando se tem em foco o diagnóstico laboratorial, contudo, a viabilidade 
das amostras submetidas é fundamental. Amostras degradadas tendem a apresentar baixa 
sensibilidade analítica devido à possível deterioração do antígeno viral, porém, podem ser 
examinadas por metodologias moleculares. 
Na presente análise foi observado que a IFD apresentou resultados confiáveis em 
99.9% das amostras com condições adequadas (in natura), corroborando com os resul-
tados anteriormente obtidos, em que um percentual de 95-99% foi observado quando 
amostras apresentaram condições adequadas para avaliação (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 
2005). Em contrapartida, do total de 77 amostras consideradas inadequadas devido à avan-
çada degradação do tecido, uma foi negativa na IFD e posteriormente resultou positiva nas 
metodologias moleculares. Soares e col. (2002) já demonstraram a eficácia na utilização da 
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técnica de RT-PCR complementarmente à IFD com resultado negativo, bem como nos casos 
em que amostras foram estocadas inadequadamente, gerando autólise. Estudos de David 
et al. (2002) relataram que em amostras degradadas até 36 dias à temperatura de 37ºC, a 
sensibilidade de detecção por RT-PCR foi maior quando comparada à IFD e ao IVC. Outros 
autores compararam os resultados da RT-PCR com a IFD em amostras em decomposição, 
avaliando a queda de sensibilidade relacionada ao tempo de deterioração do tecido cerebral 
(KAMOLVARIN et al., 1993; HEATON et al., 1997).
A fixação do tecido é determinante para que os campos celulares sejam visualizados ao 
microscópio. Nossos resultados demonstraram não haver diferença notável na qualidade do 
tecido avaliado de lâminas fixadas à -20ºC ou à temperatura ambiente por 1h, tempo estabe-
lecido segundo protocolo de RUPPRECHT e col. (2018). A proposta de se fixar as lâminas 
à temperatura ambiente está relacionada ao acondicionamento dos coplins (cubas de vidro) 
no freezer, que pode causar derramamento de acetona no interior do equipamento, além 
do espaço reduzido para a disposição de várias unidades em momentos de rotina intensa. 
Diante da alta demanda diagnóstica do IP/SP, a qualidade das lâminas utilizadas como 
controle positivo e negativo das reações é fundamental. A avaliação dos controles em nos-
so estudo demonstrou que, após 15 dias mantidas a -20ºC, as lâminas positivas perdem 
rendimento, ou seja, ocorre diminuição na intensidade de fluorescência, bem como na sua 
distribuição nos diferentes campos de visualização, podendo em muitas situações o controle 
positivo tornar-se não reagente na IFD.
A IFD recomenda que o conjugado antirrábico com anticorpo policlonal seja pré adsor-
vido em suspensão de tecido nervoso de camundongos quando produzido a partir de vírus 
multiplicado em cérebro de camundongos (LARGHI, 1971 e DEAN et al., 1996). Entretanto, 
ao se utilizar cultivo celular para a produção de um conjugado, a utilização de suspensão 
produzida em animais torna-se desnecessária, pois o objetivo minimizar possíveis reações 
inespecíficas decorrentes da presença de tecido nervoso no imunógeno utilizado na imuni-
zação dos animais na produção do conjugado (CAPORALE, 2010). Neste estudo foi utilizado 
o conjugado monoclonal MILLIPORE MAB 0051, que é produzido a partir de vírus produzido 
em cultura celular. 
 Na avaliação da utilização do CVS produzido in vivo e in vitro, os resultados demons-
traram concordância entre as lâminas testadas. Houve inibição de fluorescência ao se diluir 
o conjugado em suspensão de SNC de camundongos infectados, bem como em diluente 
preparado a partir das culturas de células BHK-21 infectadas. CAPORALE (2010) já demons-
trou a viabilidade de diluição do conjugado em suspensões virais produzidas em linhagens 
celulares (BHK-21 e N2A), constatando ainda uma vantagem na utilização de vírus produzido 
em BHK21, pois há a necessidade de aumento da concentração dos diluentes produzidos in 
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vitro durante a produção das suspensões, o que possibilita a realização de um maior número 
de reações de IFD, visto que o volume de conjugado diluído é maior. 
O período de pré-adsorção do conjugado com as suspensões de CVS, que serve como 
parâmetro de especificidade da reação, seguiu o protocolo utilizado na rotina laboratorial, 
sendo de aproximadamente 15 minutos. Estudos anteriores demonstraram um aumento 
progressivo da inibição de fluorescência à medida que se aumentasse os períodos de pré-
-adsorção (ROEHEet al., 2002). Como nossa análise prática foi prospectiva, não foi possível 
a realização de diversos períodos devido à incerteza de se ter amostras positivas para esta 
avaliação. Por fim, rotineiramente não são observados ruídos recorrentes à eventual falta de 
inibição de fluorescência durante as avaliações de lâminas no Laboratório de Diagnóstico 
da Raiva do IP/SP. 
Em relação à intensidade de fluorescência nos fragmentos de SNC de herbívoros 
positivos observou-se que o cerebelo e o tronco encefálico apresentaram um aumento 
na intensidade de células infectadas, com numerosos corpúsculos de inclusão de forma 
dispersa, em relação ao hipocampo e córtex. Diversos estudos demonstram que o tronco 
encefálico, especialmente regiões de medula, tálamo e ponte, são mais indicados para téc-
nicas laboratoriais para diagnóstico da raiva (BASSUINO et al., 2016). Além disto, a análise 
dos dois hemisférios cerebrais é fundamental, especialmente em animais de grande porte, 
devido à possibilidade de disseminação unilateral do vírus em casos de distribuição espar-
sa com baixa carga viral (RUPPRECHT et al., 2018). Estes dados reforçam a necessidade 
de envio de todos os fragmentos de SNC, especialmente no caso de herbívoros, para que 
não ocorram eventualmente resultados falso-negativos. Costa e col. (2000) já afirmaram 
a necessidade de enviar o encéfalo inteiro ou fragmentos do tecido cerebral de ambos os 
hemisférios (córtex, cerebelo e hipocampo).
O resultado da IFD é determinante para influenciar a conduta no tratamento de indi-
víduos agredidos, além de ações para a vigilância. Deste modo, amostras com resultados 
negativos devem ser submetidas às metodologias complementares para que se confirme o 
diagnóstico. Amostras com resultados positivos na IFD devem ser imediatamente notificadas 
com maior brevidade possível. 
Nossos resultados apresentaram concordância de 99.9% dos resultados negativos na 
IFD com outras metodologias complementares, o que demonstra uma alta especificidade 
da técnica. Das 6927 amostras negativas, 09 apresentaram resultados discordantes com 
as demais metodologias, sendo 05 de equinos, 03 de morcegos e uma de material em con-
dições inadequadas de conservação. 
A raiva em equinos é considerada de difícil diagnóstico clínico, especialmente por apre-
sentar grande variação de sinais (VASCONCELLOS, 2003). Isso se reflete no diagnóstico 
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laboratorial, em que resultados falsos negativos na IFD são eventualmente observados. Das 
60 amostras de SNC de equinos negativos na IFD, 05 resultaram positivos nas técnicas 
moleculares, demonstrando uma sensibilidade de 50% em relação ao RT-PCR, contudo, 
a especificidade atingiu os 100% e a acurácia, 92%. Peixoto et al. (2000) observaram que, 
no diagnóstico da raiva em amostras de SNC de equinos, a sensibilidade da IFD em rela-
ção ao IVC foi de 76,6% e que o percentual de falsos negativos na IFD poderia chegar a 
20%. Carrieri e col. (2006) também evidenciaram que além da sensibilidade entre essas 
duas técnicas depender do fragmento utilizado, ocorriam baixas concentrações virais no 
córtex cerebral, hipocampo e cerebelo, sendo a medula e o tronco encefálico as seções 
mais recomendados para o diagnóstico laboratorial. No entanto, nenhum destes trabalhos 
utilizaram técnicas moleculares como RT-PCR que apresentam sensibilidade superiores a 
IVC (CENTOAMORE et al., 2020).
A análise de desempenho da IFD em amostras consideradas inadequadas demonstrou 
sensibilidade de 75%, especificidade de 100% e acurácia de 98.7%. Estes dados reforçam 
a necessidade das metodologias moleculares no diagnóstico da raiva. 
Em três amostras de morcegos (0.04% do total analisado), a IFD não possibilitou a 
conclusão do diagnóstico por gerar reações inespecíficas, estando impossibilitada a repetição 
da IFD devido à falta de SNC para confecção de lâminas extras. De acordo com as normas 
de profilaxia pós-exposição em indivíduos expostos, todo resultado de IFD de animais silves-
tres deve ter resultado de técnica confirmatória para fechar o diagnóstico. Vale ressaltar que 
não houve nenhum caso de diagnóstico falso negativo ou inespecífico na IFD de amostras 
provenientes de cães e gatos, tendo em vista que os resultados destas espécies devem ser 
liberados com a IFD.
CONCLUSÃO 
Os resultados da técnica de imunofluorescência direta no Instituto Pasteur de São Paulo 
demonstraram alta concordância com as demais metodologias aplicadas, o que evidencia 
que os procedimentos na execução do diagnóstico laboratorial estão de acordo com as de-
terminações estabelecidas pelos protocolos internacionais, possibilitando que os resultados 
sejam confiáveis e seguros. Vale ressaltar que não houve nenhum caso de diagnóstico falso 
negativo na IFD de amostras provenientes de cães e gatos, o que demonstra segurança na 
conduta profilática de indivíduos expostos. 
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Agradecimentos
Os autores agradecem ao Instituto Pasteur de São Paulo pelo suporte financeiro, e ao 
Programa de Especialização Profissional em Vigilância Laboratorial da Raiva da Secretaria 
de Estado da Saúde de São Paulo, pela concessão de Bolsa de estudo à aluna Nathália de 
Barros Salvino Alves.
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