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Roteiros Hematologia Clínica Orientações gerais sobre as aulas práticas/relatório e atividades obrigatórias � Leia atentamente todos os roteiros. � As normas para entrada nos laboratórios devem ser respeitadas; caso contrário, o aluno não poderá participar das aulas (leia a seguir as normas de biossegurança). � Para elaboração do relatório, leia com atenção o manual de orientações de aulas práticas disponível no AVA. � O relatório deve ser elaborado segundo as normas da ABNT. � O prazo para postagem do relatório é de 7 dias a contar da última aula prática da disciplina, sendo realizada uma única postagem. � Observar se o arquivo do relatório foi corretamente anexado, se não está corrompido, em branco, se está disponível e se corresponde à disciplina correta. Relatórios com tais erros/falhas não serão considerados para a correção e será atribuída nota zero. � Do relatório fazem parte as atividades obrigatórias que só poderão ser anexadas e vistadas pelo professor responsável pela(s) aula(s) prática(s). � O aluno deve imprimir as folhas com as questões, responder no campo destinado e entregar ao docente para vistar durante a aula prática. � O professor responsável pela prática deve vistar preferencialmente as atividades sempre após o final do período de aula correspondente. � O professor não assinará folhas em branco sob nenhuma circunstância. � Folhas com assinaturas do docente rasuradas não serão aceitas. � Relatórios que não contarem com as atividades obrigatórias não serão validados. � O aluno deve anexar somente as atividades referentes às aulas práticas que participou, da mesma forma que deve descrever no relatório somente os procedimentos que participou. � O número de atividades obrigatórias varia de acordo com a carga horária de cada disciplina prática. � Serão confrontados o relatório e as questões entregues com a frequência registrada em sistema; por esse motivo, não deixar de registrar frequência no polo. A nota é proporcional à frequência registrada em sistema. � O relatório deve ser confeccionado na seguinte ordem: 1. capa; 2. atividades obrigatórias; 3. resultados e discussão; 4. referências. � Estão descritas na tabela a seguir as orientações para confecção de cada uma das etapas necessárias ao relatório. � Para maiores informações/orientações, consulte (AVA>disciplina>manual de orientações para a prática). Itens Critérios Pontuação Atividades obrigatórias � Respostas devem estar à caneta. � Não apresentar rasuras. � Vistadas pelo docente. � Anexar somente as atividades obrigatórias referentes aos roteiros de prática que realizou. 4,0 Resultados e discussão � Descrever os resultados por roteiro realizado, relacionando os achados à teoria e referenciando-os. � Anexar desenhos, fotos, diagramas, esquemas, tabelas, dentre outros recursos que melhor ilustrem e descrevam os resultados. 5,0 Elementos pré-textuais (capa) e pós-textuais (referências) � Apresentar capa conforme modelo disponibilizado, contendo nome, RA, polo de matrícula, polo de prática, data das aulas e nome do docente e disciplina. � Apresentar em ordem alfabética as referências utilizadas seguindo normas da ABNT. 1,0 Regras básicas de segurança no laboratório 1. Durante a aula prática, mantenha sempre atenção ao roteiro, tendo-o sempre próximo a você. Pode ser efetuada marcação com caneta sob cada item realizado do experimento de forma a não se perder durante a execução. 2. Leia sempre o roteiro antes de iniciar a prática e mesmo antes das explicações do professor. 3. Observe a localização do material e dos equipamentos de emergência (chuveiro, lava-olhos etc.). 4. Não abra qualquer recipiente antes de reconhecer seu conteúdo pelo rótulo. 5. Não pipete líquidos diretamente com a boca, use pipetas adequadas. 6. Não tente identificar um produto químico pelo odor ou pelo sabor. 7. Não deixe de utilizar os equipamentos de proteção. 8. Não adicione água aos ácidos, mas os ácidos à água. 9. Não trabalhe com sandálias, chinelos ou sapatos abertos e com salto no laboratório. 10. Sempre identifique o conteúdo presente nos frascos ou nos tubos utilizados no experimento com caneta para vidros. Isso facilita seu descarte adequado por parte dos responsáveis pelo laboratório. 11. Mantenha os solventes em recipientes adequados e devidamente tampados, bem como materiais inflamáveis longe de fontes de calor (bico de Bunsen). 12. Utilize a capela sempre que manipular reagentes ou solventes que liberem vapores. 13. Conheça as propriedades tóxicas das substâncias químicas antes de empregá-las pela primeira vez no laboratório. Caso tenha dúvidas, consulte o professor ou o técnico a respeito. 14. Se tiver cabelo longo, prenda-o ao realizar qualquer experiência no laboratório. Não se alimente e nem ingira líquidos nos laboratórios. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Hematologia clínica Título da Aula: Determinação do hematócrito AULA 1 ROTEIRO 1 Objetivos Determinação do hematócrito. O hematócrito é um exame rápido, de boa reprodutibilidade e preciso, que requer pequena quantidade de sangue para seu processamento. A técnica do micro-hematócrito, desenvolvida em tubos capilares, é simples e bastante utilizada quando não se dispõe de um equipamento de automação para a realização do hemograma. O valor do hematócrito é utilizado para o cálculo dos índices hematimétricos. Procedimento O aluno deverá seguir conforme descrito: 1) Preencher um tubo capilar com sangue até ¾ da sua altura. Limpar a parede externa com gaze ou papel. 2) Fechar uma das extremidades na chama do bico de Bunsen ou com massa de modelar para a oclusão do capilar. 3) Colocar o capilar em uma centrífuga apropriada (centrífuga própria para micro- hematócrito) por 5 minutos em 10.000 a 12.000 rpm. 4) Fazer a leitura na tabela de leitura de micro-hematócrito que acompanha a centrífuga. A tabela poderá ser impressa e distribuída para todos os grupos. A base do capilar é posicionada na marca 0 (zero) da escala de leitura e o menisco do plasma na marca 100 (cem). O resultado é o valor correspondente ao limite de separação da massa dos eritrócitos com o plasma. O resultado é expresso em porcentagem de eritrócitos em relação ao sangue total. Materiais Quantidades por grupo Sangue de carneiro 500 µL em tubo Eppendorf Tubo capilar 6 Estante para tubo Eppendorf 1 Papel-absorvente 1 rolo Massa de modelar 1 Descarte para tubos e ponteiras 1 Equipamentos Quantidades Centrífuga para micro-hematócrito 1 Bico de Bunsen 1 Descarte Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Hematologia clínica Título da Aula: Determinação da hemoglobina AULA 1 ROTEIRO 2 Objetivos Determinação da hemoglobina. A determinação da hemoglobina é utilizada para o diagnóstico de anemias e policitemias. Pode ser quantificada por espectrofotometria. O Fe (II) do grupo heme da hemoglobina, oxi-hemoglobina e carboxi-hemoglobina é oxidado para o estado férrico pelo ferricianeto, formando hemiglobina (Hi), que se combina com o cianeto ionizado para produzir cianeto de hemiglobina (HiCN), que é medido em 540 nm. Procedimento O aluno deverá seguir as etapas de procedimento descritas na bula do kit e, com o auxílio do professor, interpretar os resultados obtidos. Pedir ao aluno para esquematizar todo o procedimento de acordo com a bula: o que será pipetado em cada tubo, condições de incubação, comprimento de onda a ser utilizado e cálculos. Materiais Quantidades por grupo Sangue de carneiro 200 µL em tubo Eppendorf Kit para determinação da hemoglobina 1 Controle de hemoglobina 1 Pipeta automática P1000 1 Pipeta automática P20 1 Papel-absorvente 1 rolo Descarte para tubos e ponteiras 1 Equipamento Quantidade Espectrofotômetro 1 Observação: o controle de hemoglobina, além de ser utilizado como padrão, pode serdiluído e utilizado como amostra do paciente. Descarte Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança. As soluções presentes nos tubos deverão ser desprezadas na pia com água corrente. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Hematologia clínica Título da Aula: Contagem de hemácias em Câmara de Neubauer AULA 2 ROTEIRO 1 Objetivos Quantificar hemácias. A quantificação de hemácias é parte do eritrograma e necessária para os cálculos hematimétricos. Pode ser realizada em sistemas automatizados, mas também de forma manual em Câmara de Neubauer quando não se dispõe de tais equipamentos. Procedimento Diluição em tubo de ensaio: 1) Em um tubo de ensaio, colocar 4 mL da solução de Gower. Limpar a parede externa da ponteira com gaze ou papel. 2) Pipetar 20 µL de sangue homogeneizado. Limpar a parede externa da ponteira com gaze ou papel. Rinsar a pipeta várias vezes até a completa transferência da amostra para o diluente. 3) Homogeneizar a solução final por agitação manual durante 30 segundos. Aguardar 2 minutos. 4) Preencher a Câmara de Neubauer com o auxílio da pipeta. 5) Contar as hemácias de 5 quadrados centrais e multiplicar por 10.000. Líquido de Gower Ácido acético glacial .................................................. 66,6 mL Na2SO4 anidro .............................................................. 25 g Água destilada (qsp) .................................................. 400 mL Materiais Quantidades por grupo Sangue de carneiro 100 µL em tubo Eppendorf Tubos de ensaio 2 Líquido de Gower 10 mL Câmara de Neubauer 1 Pipeta automática P1000 ou P5000 1 Pipeta automática P20 1 Estante para tubos 1 Papel-absorvente 1 rolo Descarte para tubos e ponteiras 1 Equipamento Quantidade Microscópio 1 Localize no esquema a seguir o local de contagem das hemácias: Altura entre a superfície e a lamínula = 0,1 mm Volume da área central: 0,1 mm3 Volume de cada quadrado médio central: 0,2 x 0,2 x 0,1 = 0,004 mm3 Diluição da pipeta: 1/200 Números de quadrados médios centrais contados: 5 Portanto: 5 x 0,004 x 1/200 = 0,0001 = 1/10.000 Ou seja, o fator é 10.000. Descarte Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Hematologia clínica Título da Aula: Contagem de leucócitos em Câmara de Neubauer AULA 2 ROTEIRO 2 Objetivos Contagem global de leucócitos. A quantificação de leucócitos é parte do leucograma e necessária para a contagem diferencial absoluta. Pode ser realizada em sistemas automatizados, mas também de forma manual em Câmara de Neubauer quando não se dispõe de tais equipamentos. Procedimento Diluição em tubo de ensaio: 1) Em um tubo de ensaio, colocar 0,4 mL da solução diluente. Limpar a parede externa com gaze ou papel. 2) Pipetar 20 microlitros de sangue homogeneizado. Limpar a parede externa com gaze ou papel. Rinsar a pipeta várias vezes até a completa transferência da amostra. 3) Homogeneizar a solução final por agitação manual durante 30 segundos. Aguardar 2 minutos. 4) Preencher a Câmara de Neubauer com o auxílio de um tubo capilar. 5) Contar os leucócitos de 4 quadrados laterais e multiplicar por 50. Líquido de Turk Ácido acético glacial ............................................... 3 mL Água destilada (qsp) ............................................... 100 mL 1 gota de solução de violeta genciana a 1% ou de azul de metileno Materiais Quantidades por grupo Sangue de carneiro 100 µL em tubo Eppendorf Tubos de ensaio 2 Líquido de Turk 10 mL Câmara de Neubauer 1 Pipeta automática P1000 1 Pipeta automática P20 1 Estante para tubos 1 Papel-absorvente 1 rolo Descarte para tubos e ponteiras 1 Equipamento Quantidade Microscópio 1 Localize no esquema a seguir o local de contagem dos leucócitos: Por que o fator é 50? Cálculo da Câmara de Neubauer para contagem de hemácias: Cálculo da Câmara de Neubauer para contagem de leucócitos Área lateral: 1 mm2 Altura entre a superfície e a lamínula = 0,1 mm Volume da área lateral: 1 mm3 Volume de cada quadrado lateral: 0,1 mm3 Diluição da pipeta: 1/20 Números de quadrados grandes laterais contados = 4 Portanto: 4 x 0,1 x 1/20 = 1/50 Ou seja, o fator é 50. Descarte Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Hematologia clínica Título da Aula: Determinação do ferro sérico AULA 3 ROTEIRO 1 Objetivos Explicar a importância da determinação do ferro no soro e correlacionar com ferritina e capacidade total de ligação do ferro com a transferrina. Procedimento O aluno deverá seguir as etapas de procedimento descritas na bula do kit e, com o auxílio do professor, interpretar os resultados obtidos. Materiais Quantidades por grupo Soro controle normal e patológico 1 mL Tubos de ensaio 2 Kit para determinação de ferro sérico 1 Pipeta automática P1000 1 Estante para tubos 1 Papel-absorvente 1 rolo Descarte para tubos e ponteiras 1 Equipamentos Quantidades Banho a 37 °C 1 Espectrofotômetro 1 Descarte Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Hematologia clínica Título da Aula: Confecção de esfregaço sanguíneo AULA 3 ROTEIRO 2 Objetivos Confecção e coloração de um esfregaço fino, regular e de bordas livres para boa distribuição das células do sangue. O esfregaço é utilizado para a contagem diferencial de leucócitos e observação de alterações em hemácias, leucócitos e plaquetas. Também é importante para a visualização de parasitas, como o Plasmodium. Procedimento 1) Limpar várias lâminas de vidro com álcool e secar com gaze. A lâmina deve estar sem resquícios de gordura ou defeitos. 2) Limpar a lâmina extensora (bordas arredondadas) com álcool e secar. 3) Homogeneizar a amostra de sangue. 4) Aplicar uma gota de sangue com o auxílio de um capilar na extremidade da lâmina. A gota deve ter cerca de 1 cm de diâmetro ou 10 µL, quando aplicada com uma pipeta automática. 5) Colocar o lado da lâmina em que está o sangue, em um ângulo de 45° com a face superior da lâmina extensora. 6) Fazer um ligeiro movimento para trás com a lâmina extensora até encostá-la na gota de sangue, deixando, então, que a gota se difunda uniformemente, ao longo de toda a borda por capilaridade. 7) Levar a lâmina extensora para frente, de modo que ela arraste a gota de sangue, que se estenderá numa camada delgada e uniforme. Evitar paradas ou movimentos muito rápidos. Preparar uma lâmina por vez. Fonte: autoria própria 8) Escolher a melhor lâmina, esperar secar e proceder à coloração. 9) Colocar as lâminas em frasco contendo corante Instant Prov I e deixar em repouso por 5 segundos. 10) Aos 5 segundos, retirar do corante e deixar escorrer durante 5 segundos. 11) Colocar as lâminas no frasco contendo o corante Instant Prov II e deixar em repouso por 5 segundos. 12) Retirar do corante e deixar escorrer durante 5 segundos. 13) Colocar as lâminas no frasco contendo corante Instant Prov III e deixar em repouso por 5 segundos. 14) Retirar do corante. Deixar escorrer durante 5 segundos e lavar cuidadosamente as lâminas em água corrente. 15) Deixar secar. 16) Observar ao microscópio ou reservar para serem lidas na próxima aula de microscopia. 17) Identificar e desenhar as células observadas. Procedimento para visualização da lâmina ao microscópio 1) Ligar o microscópio na tomada (verificar se é 110 volts) e acender a luz. 2) Girar o potenciômetro até o ponto máximo de luz. 3) Girar o revólver do microscópio, de modo que a objetiva de menor (4x) aumento fique em posição de uso. 4) Colocar a lâmina sobre a platina. Verificar se corresponde à superfície que contém a camada de células. 5) Procurar uma região em que as hemácias estejam dispersas e seja possível identificar os leucócitos com nitidez. 6) Focalizar as células com a objetivade menor aumento, utilizando inicialmente o parafuso macrométrico para facilitar a focalização. Ambos os olhos devem estar abertos. 7) Melhorar o foco, usando parafuso micrométrico (foco fino). 8) Girar o revólver e mudar para objetiva (10x), acertar o foco com o parafuso micrométrico. 9) Utilizando o charriot, escolher a área. 10) Mudar para a objetiva de (40x) com cuidado para que não atinja a lâmina ou quebre a lamínula. 11) Focalizar as células com o ajuste fino. 12) Girar o revólver, deixar sem objetiva e adicionar 1 gota de óleo de imersão. 13) Girar o revólver e mudar para a objetiva (100x), acertar o foco com o parafuso micrométrico. 14) Procurar a região na qual as células estão bem dispersas. Fonte: autoria própria Materiais Quantidades por grupo Sangue de carneiro 2 mL Lâminas de vidro 20 Lâminas extensoras 4 Tubo capilar 1 Pipeta P10 1 Estante para secagem de lâminas 1 Papel-absorvente 1 Gaze 1 Descarte para lâminas de vidro 1 Pisseta com álcool 70% 1 Frasco/copo para coloração de lâminas 3 Corante panótico Instant Prov I, II e III 1 conjunto Equipamento Quantidade Microscópio 1 Descarte Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Hematologia clínica Título da Aula: Identificação de alterações morfológicas em hemácias AULA 4 ROTEIRO 1 Objetivos Identificação das alterações morfológicas em hemácias. A revisão manual das lâminas de amostras que apresentam alterações em um ou mais parâmetros tem como objetivo a identificação de anormalidades no tamanho, forma, coloração e presença de inclusões. Procedimento 1) Ligar o microscópio na tomada (verificar se é 110 volts) e acender a luz. 2) Girar o potenciômetro até o ponto máximo de luz. 3) Girar o revólver do microscópio de modo que a objetiva de menor (4x) aumento fique em posição de uso. 4) Colocar a lâmina sobre a platina. Verificar se corresponde à superfície que contém a camada de células. 5) Utilizando o charriot, centralizar o meio/cauda da lâmina (região em que as hemácias estão regularmente dispersas). 1. cabeça; 2. meio; 3. cauda Fonte: autoria própria 6) Focalizar as células com a objetiva de menor aumento, utilizando inicialmente o parafuso macrométrico para facilitar a focalização. Ambos os olhos devem estar abertos. 7) Melhorar o foco, usando parafuso micrométrico (foco fino). 8) Girar o revólver e mudar para a objetiva (10x), acertar o foco com o parafuso micrométrico. 9) Utilizando o charriot, escolher a área. 10) Mudar para a objetiva de (40x) com cuidado para que não atinja a lâmina ou quebre a lamínula. 11) Focalizar as células com o ajuste fino. 12) Girar o revólver, deixar sem objetiva e adicionar 1 gota de óleo de imersão. 13) Girar o revólver e mudar para a objetiva (100x), acertar o foco com o parafuso micrométrico. 14) Procurar a região na qual as células estão bem dispersas. 15) Identificar as alterações presentes. Possíveis alterações que podem estar presentes: Fonte: autoria própria Materiais Quantidades por grupo Esfregaço de sangue periférico de arquivo 1 por aluno Óleo de imersão 1 Gaze 1 Papel-absorvente 1 rolo Equipamento Quantidade Microscópio 1 Descarte Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Hematologia clínica Título da Aula: Contagem diferencial de leucócitos AULA 4 ROTEIRO 2 Objetivos Contagem diferencial de leucócitos. A contagem diferencial de leucócitos em neutrófilos (bastonetes e segmentados), linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos pode ser realizada por automação ou a partir de esfregaços corados por coloração de Leishman, entre outras. Procedimento 1) Ligar o microscópio na tomada (verificar se é 110 volts) e acender a luz. 2) Girar o potenciômetro até o ponto máximo de luz. 3) Girar o revólver do microscópio de modo que a objetiva de menor (4x) aumento fique em posição de uso. 4) Colocar a lâmina sobre a platina. Verificar se corresponde à superfície que contém a camada de células. 5) Procurar uma região em que as hemácias estejam dispersas e seja possível identificar os leucócitos com nitidez. 6) Focalizar as células com a objetiva de menor aumento, utilizando inicialmente o parafuso macrométrico para facilitar a focalização. Ambos os olhos devem estar abertos. 7) Melhorar o foco, usando parafuso micrométrico (foco fino). 8) Girar o revólver e mudar para a objetiva (10x), acertar o foco com o parafuso micrométrico. 9) Utilizando o charriot, escolher a área. 10) Mudar para a objetiva de (40x) com cuidado para que não atinja a lâmina ou quebre a lamínula. 11) Focalizar as células com o ajuste fino. 12) Girar o revólver, deixar sem objetiva e adicionar 1 gota de óleo de imersão. 13) Girar o revólver e mudar para a objetiva (100x), acertar o foco com o parafuso micrométrico. 14) Procurar a região na qual as células estão bem dispersas. 15) Proceder a contagem de cem células. Anotar cada tipo encontrado. Para evitar erros de contagem (ou seja, contar a mesma célula em duplicata), adotar o método em zigue-zague. Iniciar a contagem da região do corpo do esfregaço e ir em direção à cauda. Identificar as alterações presentes. Fonte: autoria própria Células Quantidades Neutrófilos bastonetes Neutrófilos segmentados Linfócitos Monócitos Eosinófilos Basófilos Materiais Quantidades por grupo Esfregaço de sangue periférico de arquivo 1 por aluno Óleo de imersão 1 Gaze 1 Papel-absorvente 1 rolo Equipamento Quantidade Microscópio 1 Descarte Descarte do material utilizado conforme as Normas Internacionais de Segurança. Nome:__________________________________________________ RA:____________________ Data:______/_____/_____ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 1 1- Um paciente de 20 anos foi ao médico para exames de rotina, que apresentaram os seguintes resultados: hemácias 8,24 x 106/mm3, hematócrito de 55,0%, hemoglobina de 18 g/dl e plaquetas 910.000/mm3. O paciente não apresenta sintomas e não relatou casos parecidos na família. Os resultados foram confirmados em nova coleta de sangue. O médico iniciou tratamento do paciente com AAS enquanto novos exames foram realizados para confirmação da hipótese diagnóstica. Qual é a provável hipótese diagnóstica? Por que o médico iniciou tratamento com AAS? 2- O paciente do caso supracitado foi submetido a 3 flebotomias, uma por semana, durante 3 semanas. Qual é a finalidade das flebotomias? Discuta a diferença entre flebotomia e doação de sangue. Visto do docente: _________________________________ Nome:__________________________________________________ RA:____________________ Data:______/_____/_____ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 2 1- O hemograma de uma paciente, 18 anos, apresentou os seguintes valores: hemácias: 4,3 x 106 mm3 (3,9-5,4 x 106 uL), hemoglobina: 8,7 g/dL (12-15 g/dL) e hematócrito: 28% (35-47%). A paciente está anêmica? Justifique. 2- Calcule os índices hematimétricos HCM e VCM do caso acima. Visto do docente: _________________________________ Nome:__________________________________________________ RA:____________________ Data:______/_____/_____ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 3 1- Discutir as diferenças entre os valores de ferro sérico para homens e mulheres. 2- Discutir a importância da revisão morfológica de esfregaços sanguíneos pela microscopia, mesmo quando o hemograma é realizado de maneira automatizada. Visto do docente: _________________________________ Nome:__________________________________________________ RA:____________________ Data:______/_____/_____ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 4 1- Discorrer sobre as principais patologias associadas à presença de hemácias: microcíticas e hipocrômicas, macrocíticas, eliptócitos, crenadas, esquizócitos, acantócitos, falciforme, estomatócitos e hemácia em alvo. 2- Um analista, ao revisar um esfregaço sanguíneo, observou a presença de hemácias microcíticas e hipocrômicas,e, ao mesmo tempo, hemácias macrocíticas. Como serão o VCM e o HCM desse hemograma? Visto do docente: _________________________________
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