Relatório 3 BioSyn

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Universidade de Brasília – Instituto de Ciências Biológicas Disciplina: Biologia Sintética
Professora Responsável: Cíntia Marques Coelho 
Relatório 3 
Título do artigo: A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity
· O título me sugere a descoberta e descrição de uma endonuclease programável e guiada por dois RNAs, que atua na imunidade adaptativa de bactérias.
· Fator de Impacto/Revista: 37.205 (2016) / Science
· Autores principais: 
· Emmanuelle Charpentier: Realizou sua graduação na Universidade Pierre e Marie Curie em Paris e obteve seu doutorado no Instituto Pasteur, também na França. Atualmente trabalha nas áreas de Microbiologia e Imunologia e é reconhecida por seu trabalho na descoberta e redefinição do sistema imune bacteriano de CRISPR/CAS9 e seu uso para edições genômicas.
· Jennifer A. Doudna: Realizou a graduação e seu PhD na Universidade de Havard, e atualmente atua nas áreas de Bioquímica e Biologia Molecular com interesse na estrutura e função de ribozimas. É reconhecida por seu trabalho envolvendo o sistema CRISPR/CAS9 e edições genômicas e também por um de seus trabalhos tendo determinado a estrutura cristalográfica de uma ribozima.
· Introdução: 
· Justificativa para o trabalho: Elucidar o funcionamento e o mecanismo do sistema CRISPR/Cas tipo II
· Revisão da literatura: Bactérias e Arquéias possuem um sistema imune adaptativo mediado por RNA chamado de CRISPR/Cas, que reconhece DNAs invasores e induzem silenciamento desses. Esse sistema é composto pelo operon, que contêm os genes cas, e pelo locus CRISPR, que possui sequências alvos intercaladas por repetições. Esse sistema funciona em 3 fases: Na fase adaptativa, bactérias e arquéias integram fragmentos pequenos do DNA invasor no seu próprio cromossomo, próximo a região final do locus CRISPR. Nas fases de expressão e interferência, a transcrição do locus produz um grande pre-crRNA que é clivado em "repeat-spacer elements" formando os crRNAs que são capazes de parear complementarmente com a sequência invasora. As endonucleases Cas funcionam em complexo com o crRNAs e clivam as sequencias invasoras reconhecidas pelo crRNAs, induzindo o silenciamento do DNA invasor. Existem 3 tipos de sistemas CRISPR/Cas: O sistema I e III tem mecanismos similares, e possuem enzimas Cas envolvidas no processamento do pre-crRNA, já no sistema II o processamento do pre-crRNA se dá através de um complexo formado pela Cas9, por uma RNAse III, que reconhece RNA dupla fita, e por um tracr-RNA que é complementar e se pareia com a região repetitiva no pre-crRNA. Nunca foi verificado a participação direta da Cas9 na degradação do DNA alvo. 
· Objetivo do trabalho: Verificar se a enzima Cas9 desempenha um papel direto na destruição do DNA alvo
· Figura 1 – As perguntas científicas da figura 1A são: A enzima Cas9 é capaz de clivar DNA alvo? O que é necessário para que isso ocorra? Com o intuito de responder as perguntas os pesquisadores amplificaram por PCR a sequência codificadora da Cas9 do genoma de Streptococcus pyogenes, clonaram em um plasmídeo, que possuía uma tag para o N-terminal de Histidina e um sítio TEV para proteases e expressaram a proteína recombinante em E. coli. A proteína foi purificada em vários passos contendo colunas de troca iônica, afinidade e exclusão de tamanho, posteriormente uma TEV protease foi utilizada para remover o N-terminal de Histidina, e a proteína foi novamente purificada depois dessa remoção por coluna de exclusão de tamanho. Além disso, a transcrição dos RNAs que seriam utilizados foi realizada in vitro e purificados através de um gel. Posteriormente ensaios contendo a enzima Cas9 e diferentes componentes foram realizados e os produtos do ensaio foram submetidos a eletroforese em gel de agarose. Os resultados podem ser analisados na Figura 1A, aonde foi utilizado um DNA plasmidial circular e linear. O DNA plasmidial foi linearizado através do tratamento com enzimas de restrição. Podemos observar que a clivagem somente aconteceu em ambos os casos quando havia a presença do crRNA, específico para a sequência do DNA alvo, e do tracrRNA simultaneamente, em todas as outras situações testadas a clivagem não ocorria. É possível saber se a clivagem ocorreu ou não através das bandas no gel de eletroforese, em caso de DNA circular apenas uma banda é formada, resultando na linearização do DNA, em caso de DNA linear duas bandas são formadas resultantes dos dois fragmentos formados. A pergunta para a figura 1B é: A Cas9 é capaz de clivar fragmentos pequenos de DNA? Para isso foi utilizado oligonucleotídeos, marcados na região 5’ com compostos radioativos, os produtos do ensaio de clivagem foram submetidos a gel desnaturante de poliacrilamida, que consiste em uma malha mais fina que é capaz de reter fragmentos menores. O constatado na figura é que apenas na presença de crRNA, específico para a sequência do oligonucleotídeo, e tracrRNA é que a clivagem ocorreu, devemos notar que quando o crRNA e o tracrRNA estavam presentes juntamente com a fita não-complementar a clivagem não ocorria, devido ao fato de o crRNA não ser complementar a sequência de DNA testada. A pergunta da figura 1C e 1D é: O sítio de clivagem da Cas9 no DNA alvo é específico? Na figura 1C, os pesquisadores utilizaram o produto de clivagem da figura 1A em uma análise de sequenciamento. A ideia da técnica consiste justamente em utilizar um primer para uma sequência conhecida e observar aonde a reação de sequenciamento é interrompida, nesse local é aonde ocorreu a clivagem da fita. Na figura 1D, uma eletroforese é utilizada com o produto de clivagem de 1B e a ideia consiste em observar através da marcação da região 5’ com o composto radioativo, qual é o tamanho, em nucleotídeos, da sequência, para então sabermos aonde foi o sítio de clivagem. Como resultado na figura 1C, os pesquisadores observaram 2 sítios de clivagens diferentes na fita complementar e não complementar, que sempre geravam pontas abruptas. Já na figura 1D é possível observar uma banda correspondente a um fragmento de 23 nucleotídeos no poço da fita complementar, e para a fita não complementar é possível visualizar algo entre 22 e 26 nucleotídeos. A figura 1E não possui pergunta científica e apenas demonstra um esquema de como ocorre a interação com complementaridade entre o crRNA, o tracrRNA e o DNA alvo, além de mostrar com setas azuis os sítios de clivagens encontrados em 1C, e em vermelho os sítios de clivagens encontrados em 1D, podemos ver também em cinza a região PAM, que será responsável pelo reconhecimento do DNA não próprio. 
· Figura 2 – A pergunta da figura 2A é: Cada domínio da Cas9 cliva uma fita de DNA? Os cientistas desenharam uma proteína contendo mutações importantes no sítio catalítico dos dois domínios enzimático (HNH e RuvC). A mutação no domínio HNH foi H840A e a mutação no domínio RuvC foi D10A. As enzimas mutadas, bem como a proteína WT que serviu como controle negativo foram incubadas em reação com o DNA plasmidial circular e também o linear com a finalidade de testar a capacidade de clivagem das enzimas mutadas. Na figura 2A podemos visualizar na figura de cima um esquema da proteína e seus domínios, além de visualizarmos as mutações realizadas, na figura de baixo vemos o resultado do experimento, aonde podemos observar que de fato as enzimas com mutações geraram bandas que não correspondiam nem ao DNA linear nem ao DNA circular superenovelado. De acordo com os autores essas bandas correspondem ao DNA com apenas uma das fitas cortadas, que é denominado por eles como “nicked”, dessa forma eles concluem que cada domínio é responsável por clivar uma fita diferente. Na figura 2B a pergunta é: Qual domínio cliva qual fita de DNA? Aqui os pesquisadores incubaram as proteínas mutadas com pequenos fragmentos de DNA dupla fita que possuía ambas as fitas complementares e não-complementares marcadas no 5’ com compostos radioativos. Nesse experimento o fragmento de dsDNA serviu como marcador formando bandas que servem de indicativo para quando ofragmento não é clivado, e a enzima WT serviu como controle negativo. O resultado pode ser verificado na figura 2B aonde podemos observar que para a fita complementar marcada no 5’, tanto a enzima WT quanto a enzima com a mutação D10A clivaram a fita marcada, enquanto que a enzima com a mutação H840A não clivou a fita marcada, já para a fita não-complementar marcada no 5’, temos que a WT e a H840A clivaram a fita marcada, enquanto que a enzima D10A não clivou a fita marcada, dessa forma conclui-se que o sítio HNH cliva a fita complementar enquanto que o sítio RuvC cliva a fita não complementar. 
· Figura 3 – Antes de ser realizado os experimentos da figura 3, os pesquisadores se perguntaram qual era o papel do tracrRNA, se ele era necessário para o reconhecimento do DNA alvo, ou se ele era necessário para induzir a Cas9 a clivar o DNA alvo. Para testar essas hipóteses os pesquisadores realizaram um ensaio de desvio de mobilidade eletroforético, que consiste em analisar em gel interações entre ácidos nucléicos e proteínas, nesse experimento foi utilizada a Cas9 inativa, com ambas as mutações da figura 2, e um DNA duplex. Foram realizadas diferentes combinações, aonde foi adicionada apenas a Cas9, a Cas9 + crRNA específico para o DNA alvo, a Cas9 + crRNA específico + tracrRNA, e Cas9 + tracrRNA. As concentrações de proteínas eram maiores a medida que os poços chegavam para a direita. O resultado pode ser observado na figura S9 onde podemos ver que na presença de Cas9 + tracrRNA apenas apareceram bandas correspondentes ao DNA não ligado. Na presença de Cas9 e de Cas9 + crRNA apareceram bandas indicando complexos de proteína + DNA, porém de acordo com os autores essa ligação que ocorria era inespecífica. Por fim na presença de Cas9 + crRNA + tracrRNA as bandas que apareciam correspondiam de acordo com os autores a ligações do complexo no DNA alvo. Com isso a conclusão dada pelos pesquisadores é de que a tracrRNA é requerida para o reconhecimento com o DNA alvo. Posteriormente foram realizados os experimentos da figura 3, sendo que a pergunta para as figuras 3A e 3B são: Qual região é fundamental no tracrRNA e crRNA, respectivamente, para que continue ocorrendo a clivagem? Na figura 3A, os pesquisadores realizaram truncamentos nas porções 5’ e 3’ do tracrRNA e depois realizaram os ensaios de atividades com a Cas9:crRNA:tracrRNA-truncado. Os produtos dos ensaios eram submetidos a eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida, para avaliar a clivagem ou não do DNA alvo. Como resultado podermos perceber que o limite para o truncamento do 3’ do tracrRNA foi de 48 nucleotídeos, tendo em vista que o tracrRNA com 44 nt truncados no 3’ não induziu a clivagem, já no 5’ foi testado o truncamento até 23 nucleotídeos que continuou com o complexo funcional. Nesse experimento o poço contendo apenas o DNA alvo serviu como marcador, o poço contendo apenas Cas9+crRNA serviu como controle negativo e o poço contendo o complexo sem truncamentos serviu como controle positivo. Na figura 3B foram realizados os truncamentos no crRNA e com esse foi realizado os ensaios de clivagem com os produtos também submetidos a eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida, aonde o poço contendo apenas Cas9 e DNA alvo foi usado como controle negativo e marcador de referência e o poço contendo DNA alvo, Cas9:crRNA:tracrRNA normais foi usado como controle positivo. Os resultados podem ser vistos na figura 3B aonde vemos que o truncamento da porção 5’ não foi tolerado, produzindo um complexo que não realizou clivagem, já o truncamento da porção 3’ foi tolerado até 32 nucleotídeos. Nesse ponto podemos observar que ainda existiam bandas consideráveis de DNA não clivado para os truncamentos na porção 3’. A figura 3C não possui pergunta científica, e é apenas um esquema do complexo Cas9:crRNA:tracrRNA mostrando em azul quais foram as regiões essenciais que não suportaram o truncamento nos experimentos passados. Na figura 3D e 3E a pergunta é: Quanto da sequência alvo é essencial para que haja o reconhecimento pelo complexo? Para testar, os pesquisadores realizaram mutações pontuais na sequência alvo, do DNA plasmidial, que estava à esquerda da região PAM e posteriormente realizaram novamente os ensaios de clivagem submetendo os produtos do ensaio a eletroforese em gel de agarose, aqui o poço contendo apenas DNA plasmidial foi o controle negativo e serviu como marcador, e o poço contendo a sequência WT e o complexo serviu como controle positivo. Após isso, os plasmídeos contendo as mutações pontuais foram usados em um ensaio de transformação, que consiste em transformar, com o DNA plasmidial de sequência WT ou mutada, as bactérias S. pyogenes WT e as com deleção da região CRISPR e analisar a eficiência através da formação de colônias. Na figura 3D as imagens da direita representam apenas a região que foi mutada próxima a PAM e quais foram as mutações pontuais realizadas. A figura superior esquerda representa o resultado para o ensaio de clivagem, aonde de acordo com os autores, as mutações na região 22 e 10 foram suportadas e induziram clivagem, mas as demais regiões acarretam em perda de eficiência na clivagem, porém ao meu ver as bandas não são tão resolvidos e me parecem estar todas na mesma altura correspondente a “linear” o que indicaria que ocorreu sim a clivagem dessas sequências. A figura inferior esquerda mostra a eficiência do ensaio de transformação, aonde podemos analisar que as sequências WT, e com mutações 22 e 10 não foram toleradas pela bactéria WT, que possui o sistema CRISPR intacto e capaz de clivar DNA exógeno. Porém, as demais sequências com mutações não foram reconhecidas pela bactéria WT, dessa forma a clivagem não ocorreu e a eficiência da transformação foi alta. Em minha opinião esse gráfico é bem informativo, mas faltou uma figura mostrando as colônias formadas nos diferentes tratamentos. Por fim, para a figura 3E as mutações realizadas na sequência alvo não foram pontuais, mas sim em um grande conjunto e novamente foram realizados os ensaios de clivagem aonde os produtos foram posteriormente tratados com enzima de restrição e então submetidos a eletroforese em gel de agarose que pode ser visualizada na imagem da esquerda. Aqui a sequência WT serviu como controle negativo. Notamos que apenas as sequências com mutações 15-20, 17-20 e 19-20 foram clivadas suportando a conclusão que as regiões 3’ próximo a sequência PAM é de fato mais importante para o reconhecimento pelo complexo do que as regiões 5’ mais afastadas. 
· Figura 4 – Antes de ser realizado os experimentos da figura 4, os pesquisadores analisaram a importância da sequência PAM para o reconhecimento do DNA alvo. Dessa forma foi realizado ensaios de transformação, como os descritos na figura anterior, e ensaios de clivagem utilizando nesses ensaios as sequências PAM WT, uma sequência PAM com mutação pontual G-C e uma sequência PAM com mutação GG-CC. Os resultados podem ser observados na figura S13A e S13B, onde podemos analisar que no ensaio de transformação (S13A) a bactéria WT não conseguiu reconhecer as sequências PAM mutadas e dessa forma a eficiência da transformação plasmidial nessas bactérias foram altas, já na eletroforese do ensaio de clivagem (S13B), a sequência WT foi clivada e apresentou apenas uma banda no gel, porém ambas as sequências mutadas apresentaram duas bandas correspondentes a não clivagem do DNA alvo. Dessa forma a conclusão dos autores é de que a sequência PAM é essencial para o reconhecimento do DNA alvo. A pergunta para a figura 4 é: Qual é o papel da região PAM no reconhecimento do DNA alvo? Para isso foram utilizados oligonucleotídeos marcados na região 5’ com compostos radioativos e que possuíam diferentes mutações na região PAM. Essas mutações poderiam estar presentes na fita complementar, na fita não-complementar ou em ambas. Os oligonucleotídeos foram submetidos ao ensaio de clivagem e os produtos levados a uma eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida. O resultado pode ser observado na figura 4A, aonde na direitapodemos observar os diferentes oligonucleotídeos utilizados no ensaio, e na esquerda podemos ver o resultado da eletroforese indicando que todos os oligonucleotídeos que possuíam alguma mutação na fita não-complementar (5, 6, 7 e 8) não foram clivados. Os oligonucleotídeos com mutações na fita complementar (9 e 10) foram clivados normalmente e os oligonucleotídeos de fita simples (1, 2, 3) foram clivados independente da mutação. A conclusão dos autores é que a sequência da fita não-complementar é importante para o reconhecimento. Nesse experimento o poço com o oligonucleotídeo 1 e sem o complexo serviu de controle negativo e de marcador, enquanto que o poço com o oligonucleotídeo 4 (WT) e o complexo, serviu de controle positivo. Após isso os pesquisadores utilizaram uma sequência diferente (protospacer 4) que possuía uma região PAM distinta e incubaram esse DNA alvo com o complexo Cas9:crRNA:tracrRNA. Além da sequência WT, outras variações de PAM contendo mutações importantes nos nucleotídeos GG (PAM1 e PAM2) foram utilizadas nesse experimento e também incubadas com o complexo. Após algum tempo de incubação os produtos eram removidos e foram posteriormente analisados em eletroforese. O resultado na figura 4B indica que com o passar do tempo na reação de incubação a sequência WT era reconhecida pelo complexo e clivada, porém as PAM1 e PAM2 não foram reconhecidas de tal forma que não apresentaram nenhuma banda correspondente a clivagem. Por fim, os mesmos oligonucleotídeos WT, PAM1 e PAM2 foram utilizados para o ensaio de desvio de mobilidade eletroforético, aonde novamente foi utilizada a Cas9 inativa contendo ambas as mutações da figura 2. O resultado apresentado na figura 4C corrobora as conclusões dos autores para as figuras passadas, demonstrando que o complexo é capaz de reconhecer a sequência PAM WT, porém não reconhece e portanto não se liga as sequências PAM1 e PAM2 mutadas. Os autores concluem que além da PAM na fita não-complementar ser importante para o reconhecimento do DNA alvo, os nucleotídeos conservados GG são importantes para que esse reconhecimento ocorra de fato. Na minha opinião a mudança repentina de protospacer 2 pra protospacer 4, que ocorre entre as figuras 4A e 4B não é bem justificada pelos autores. Eles poderiam ter continuado com o mesmo protospacer 2 e repetir todos os experimentos para os outros protospacers com a finalidade de corroborar os resultados. 
· Figura 5 – A figura 5A não possui pergunta científica e apenas ilustra a estratégia desenvolvida pelos autores para os próximos experimentos, aonde consiste em desenvolver um RNA quimérico que possua uma estrutura secundária e possa sozinho guiar a Cas9 até o DNA alvo, fazendo assim com que a Cas9 dependa de uma única molécula de RNA para cumprir sua função. A pergunta da figura 5B é: Será que os RNAs quiméricos projetados, são capazes de guiar a Cas9 até a clivagem? Para testar, as pesquisadoras realizaram novamente um ensaio de clivagem, porém agora contendo o RNA quimérico A e B, que possuem suas estruturas demonstradas na figura 5B em baixo. Como controle negativo foi utilizado um poço contendo apenas a Cas9 e o plasmídeo com protospacer 4, que era o DNA alvo. Como controle positivo foi utilizado o complexo Cas9:crRNA:tracrRNA. Os produtos desse ensaio eram submetidos a análise de eletroforese em gel de agarose e o resultado pode ser visualizado na figura 5B em cima, aonde podemos notar que o RNA quimérico A foi eficiente em conduzir a Cas9 até a clivagem do alvo, porém o RNA quimérico B não foi eficiente de tal forma que a clivagem não ocorreu. A pergunta da figura 5C é: Será que os RNAs quiméricos são capazes de guiar a Cas9 até a clivagem de fragmentos pequenos do DNA alvo? Portanto um experimento similar ao 1B foi realizado, utilizando os oligonucleotídeos com a protospacer 4 e com a região 5’ marcada com fósforo radioativo. Aqui o controle negativo consistiu de um poço contendo Cas9 e DNA alvo, o controle positivo consistiu em 2 poços contendo o complexo Cas9:crRNA:tracrRNA com a diferença de que as os tracrRNA truncados do experimento 3A foram utilizados. Os produtos foram submetidos a gel desnaturante de poliacrilamida e o resultado pode ser visto na figura 5C, aonde vemos que novamente o RNA quimérico A foi capaz de induzir a clivagem através da Cas9, porém o RNA quimérico B não foi capaz. A pergunta para a figura 5E é: Será que o desenho de RNAs quiméricos baseados na estrutura do RNA quimérico A, é viável para qualquer sequência alvo de DNA desejada? Para testar as pesquisadoras desenharam 5 RNAs quiméricos que possuíam como alvo o gene da GFP e realizaram ensaios de clivagem in vitro com a finalidade de observar se esses RNAs conseguiriam induzir a clivagem de plasmídeos contendo esse gene. Os produtos do ensaio foram tratados com enzima de restrição, da mesma forma que na figura 3E e posteriormente submetidos a análise em eletroforese em gel de agarose. Minha observação, tendo como base a figura do plasmídeo em S15A é que o tratamento com as enzimas de restrição, tanto aqui quanto em 3E, tinha por objetivo o de formar dois fragmentos de pesos distintos para os produtos que tinha sido clivados pela Cas9, ou gerar fragmentos lineares para os produtos que não foram clivados, de tal forma que a análise no gel seja melhor visualizável, tendo em vista que a figura 3D, aonde esse procedimento não foi aplicado, apresentou bandas quase indistinguíveis entre o DNA supercoiled e o DNA linear. Por fim, o observado no resultado da figura 5E é que todos os 5 RNAs quiméricos foram capazes de clivar o plasmídeo contendo o gene alvo, de tal forma que podemos concluir que o desenho de RNAs quiméricos para sequências específicas é viável. 
· Conclusão: Apesar de para mim conter alguns problemas que não prejudicam os resultados alcançados no artigo, como a figura 3D aonde as bandas são pouco diferenciáveis e a troca repentina de protospacer entre as figuras 4A e 4B, eu concordo com a conclusão das autoras, tendo em vista que os resultados foram consistentes, que o mecanismo da Cas9 foi bem elucidado e que as conclusões dadas no artigo concordavam com os resultados apresentados. Analisando o título do artigo, eu acredito que ele dê a entender algo que não é o que de fato ocorre, pois em minha experiência o título me sugeriu a descoberta e descrição de uma enzima que atuasse na imunidade adaptativa, porém a enzima já era conhecida, a apenas a sua função de clivagem foi descrita.