Marcadores e polimorfismo genético

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DEFINIÇÃO
Caracterização do genoma, sua compactação, organização dos genes, cromatinas,
plasticidade celular e heranças genéticas. Apresentação dos conceitos de marcador genético e
polimorfismo genético e sua aplicação forense.
PROPÓSITO
Apresentar alguns conceitos básicos de genética, que dão suporte ao conhecimento das
regiões polimórficas do genoma consideradas como marcadores para individualização ou
estabelecimento de vínculo genético, bem como técnicas para explorar estes polimorfismos.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Reconhecer a organização do genoma humano
MÓDULO 2
Descrever o polimorfismo genético
MÓDULO 3
Descrever os métodos de análise molecular aplicados à genética forense
MÓDULO 4
Identificar os marcadores genéticos complementares
INTRODUÇÃO
No genoma humano, as sequências de DNA são 99,9% idênticas. Porém, encontramos
sequências de nucleotídeos, denominados marcadores genéticos, que caracterizam de forma
única cada indivíduo. Vários marcadores são passados dos pais para os filhos, permitindo,
assim, que sejam usados para estabelecer vínculo genético. Além disso, apresentam
estabilidade em diferentes ambientes.
A descoberta dos marcadores genéticos a partir dos estudos do genoma humano permitiu
grande avanço na aplicação do DNA em genética forense. Neste tema, vamos apresentar e
discutir os principais marcadores genéticos usados na rotina de genética forense e as técnicas
associadas.
MÓDULO 1
 Reconhecer a organização do genoma humano
COMPACTAÇÃO DO GENOMA –
METILAÇÃO / ACETILAÇÃO DAS HISTONAS
Após a fecundação, o zigoto passa, na primeira semana, por mitoses sucessivas (clivagem).
Isso faz com que surjam várias células com o mesmo potencial de diferenciação e proliferação.
Durante esse processo, fatores ambientais tais como: estresse, nutrição, toxinas, patógenos,
dentre outros, podem interferir no processo de diferenciação celular a partir da regulação de
genes.
A partir da clivagem do zigoto, quando ele atinge a fase de mórula, ocorre um desequilíbrio
hídrico que permite a entrada de água em seu interior, fazendo com que os blastômeros sejam
achatados e empurrados para a periferia.
MÓRULA
Uma estrutura com 64 células iguais onde cada célula é chamada de blastômero.
Este fenômeno permitirá que os genes dos blastômeros passem a ser expressos (funcionar)
levando a uma individualidade dessas células, que passam a regular genes próprios. Este fato
determina o começo da diferenciação celular modulada pela compactação do DNA. Até os
genes do embrião serem ligados, os blastômeros sobrevivem em função dos RNAs
mensageiros contidos no citoplasma dos ovócitos que foram fecundados.
A partir do momento em que as células da mórula começam a se diferenciar para dar origem
primeiramente ao embrioblasto (dará origem ao embrião) e ao trofoblasto (dará origem à
placenta), serão chamados de blastocisto - formará os folhetos embrionários (ectoderma,
mesoderma, endoderma) para dar origem ao embrião.
Todas essas modificações morfofuncionais pelas quais passa a mórula, a compactação do DNA
durante os estádios iniciais do desenvolvimento embrionário, serão as grandes responsáveis
por iniciar e manter a memória celular para a diferenciação celular, levando o zigoto a se
converter em embrião.
 ATENÇÃO
A compactação do DNA é uma grande característica de genomas eucarióticos e se deve à
interação do DNA com o octâmero de histonas que formará o nucleossoma. Esse por sua vez,
dependendo do nível de metilação, influenciará no estado físico do material genético:
cromossoma (no máximo de condensação – nucleossomas muito próximos) ou cromatina
(descondensados – nucleossomas afastados).
Para entendermos esta dinâmica, podemos fazer uma analogia com água na forma líquida e
gelo: Ambas formadas por moléculas de H2O, entretanto, no gelo, as moléculas estarão muito
próximas, enquanto na forma líquida essa distância será padrão.
 Detalhe da estrutura do cromossomo.
Esta compactação leva a uma regulação epigenética a partir do que chamamos de “Código de
Histonas”. Neste código, ocorrem modificações nas histonas, que são proteínas estruturais
que interagem com o DNA (se enrolam), sempre formando um conjunto de 8 (octâmero) – 2
H2A, 2 H2B, 2 H3, 2 H4 - e mais a H1.
Para que ocorra o Código de Histonas, dois processos são fundamentais: a metilação e a
acetilação.
METILAÇÃO
A metilação é a adição de um radical metil (CH³) às histonas. Isso faz com que a região do
genoma que esteja hipermetilada esteja desligada, ou seja, os genes contidos na área
hipermetilada não sejam ativados para fins de expressão gênica. A metilação é catalisada pelas
enzimas Metiltransferase de Histonas, que adiciona o radical metil aos resíduos de lisina e
arginina das histonas H3 e H4. O aumento dos radicais metil inativa a transcrição (desliga
genes).
ACETILAÇÃO
Inversamente proporcional à metilação, tem-se a acetilação, ou seja, a adição de radicais Acetil
(COCH³) nos resíduos de lisina e arginina das histonas H3 e H4. Este processo ativa
transcrição (liga os genes). Tudo é catalisado pelas enzimas Acetiltransferase de Histonas
(HAT). Logo, quanto mais metilado/menos acelilado, o gene está desligado; quanto mais
acetilado/menos metilado, o gene está ligado.
 ATENÇÃO
Quanto maior o nível de metilação, menor a interação com fatores de iniciação da transcrição
(impede que o complexo de iniciação se ligue ao TATABOX para exposição do sítio promotor e
iniciação da transcrição).
TATABOX
Região rica em Adenina e Timina, e fica a -25pb antes do sítio promotor. Esta região é
fundamental para iniciar a transcrição, pois, a partir de sua ativação, o sítio promotor fica
exposto e pode interagir com a RNA polimerase fazendo fitas de RNA.
Como foi dito anteriormente, essa relação interferirá na compactação do DNA, Código da
Histona e disposição da cromatina. O Código das Histonas é estabelecido ainda no início do
período embrionário e vai comandar e determinar a diferenciação celular, permitindo que as
diferentes células do corpo de um indivíduo sejam morfofuncionalmente diferentes, apesar de
apresentarem o mesmo DNA.
EUCROMATINA/ HETEROCROMATINA
A partir do Código das Histonas, ocorrem modificações de natureza conformacional no material
genético contido no núcleo das células que acabaram de ser geradas a partir das mitoses
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advindas do zigoto. Estas células ficarão estacionadas em G1 (1ª fase da intérfase do ciclo
celular) até que ocorram estímulos para que ela evolua no ciclo, e se divida.
Nessas células, o material genético encontra-se na forma de cromatina (material genético
descondensado), de maneira a ser utilizado para fins de expressão gênica. Ocorre que, durante
a formação do Código das Histonas, algumas áreas da cromatina ficarão diferentes de outras,
dando origem à formação da heterocromatina e eucromatina.
 Organização da cromatina.
HETEROCROMATINA
A heterocromatina é a parte da cromatina menos descondensada, em comparação ao restante
da cromatina (o nível de metilação das histonas é maior que o nível de acetilação), de maneira
que genes contidos na área de heterocromatina estão desligados. Do ponto de vista estrutural,
haverá uma maior aproximação dos nucleossomas (octâmero de histonas que interage com o
DNA) e isso impede que os reativos da transcrição ativem e transcreva os genes.
EUCROMATINA
A eucromatina é a parte da cromatina mais descondensada que a anterior (o nível de
acetilação é maior que o nível de metilação), que faz com que os genes contidos nesta área
sejam ligados, ou seja, o complexo de iniciação da transcrição poderá iniciar a transcrição.
 ATENÇÃO
Existe um controle genético prévio que permite que as relações entre áreas de eucromatina e
heterocromatina se mantenham em todas as gerações celulares. Isso posto, este mecanismo
explica por que um neurônio e um fibroblasto de uma mesma pessoa, embora apresentem o
mesmo DNA, manifestam áreas de eucromatina e heterocromatina diferentes. Isso permitiráque, embora o neurônio apresente o gene do colágeno, este não se expressará em função de
estar contido em uma área de heterocromatina.
Da mesma maneira que observamos no fibroblasto da mesma pessoa, com relação à
adrenalina: apesar de apresentar o gene da adrenalina, o fibroblasto não expressa, em função
deste gene estar contido em uma área de heterocromatina. Já o gene do colágeno apresenta-
se dentro de uma área de eucromatina e, por isso, pode ser expresso.
Outro aspecto importante da heterocromatina é o fenômeno de compensação de doses que
ocorre em um dos cromossomas X das mulheres. Por volta da 13ª semana de gestação, ocorre
uma inativação parcial de um dos cromossomas X das mulheres com objetivo de equiparar as
concentrações das proteínas dos genes do cromossoma X entre mulheres e homens, já que os
homens apresentam um cromossoma X e as mulheres apresentam dois. Dessa maneira, um
dos X da mulher fica inoperante parcialmente. Essa inativação parcial é mantida a parir da
formação de heterocromatina em toda área cromossomial, a partir da hipermetilação das
histonas.
A heterocromatinização é feita de maneira aleatória para cada célula, ou seja, há célula em que
o X paterno inativa, há célula em que o X materno inativa, porém, se na primeira célula foi o X
paterno, todas as células que forem originadas desta terão o X paterno inativado parcialmente.
Essa heterocromatina facultativa é comum no núcleo de células em interfase de mulheres
citogeneticamente normais, e são chamadas de “Corpúsculo de Barr”.
O princípio da diferenciação celular é justificado pela formação das áreas de eucromatina e
heterocromatina, que em função de um controle genético ainda não elucidado completamente,
se manterão constantes ao longo das gerações celulares. Isso porque, todos os fibroblastos,
por exemplo, que surgirem a partir de um primeiro, terão as mesmas áreas de heterocromatina
e eucromatina da célula original e, por isso, produzirão colágenos e não adrenalina.
ORGANIZAÇÃO DOS GENES
O gene é a unidade funcional do metabolismo. Ele controla as atividades da célula a partir da
síntese de proteínas, tanto enzimáticas, sinalizadoras, quanto as estruturais. Sob o ponto de
vista bioquímico, é uma sequência de nucleotídeos, na molécula de DNA, responsável pela
codificação de uma proteína, embora existam genes que não produzam proteínas, como é o
caso do gene para RNA ribossomal e RNA transportador, assim como os pseudogenes. Sob
uma ótica Mendeliana, o gene é um segmento cromossomial responsável por uma
característica visualizável.
PSEUDOGENES
Genes que perderam a funcionalidade ao longo do processo de evolução das espécies.
MENDELIANA
O biólogo e botânico Gregor Mendel (1822-1884) é o criador das Leis de Mendel, que tratam da
transmissão dos caracteres hereditários.
Um gene é composto por nucleotídeos unidos entre si por ligações fosfodiéster, que são
estabelecidas entre a hidroxila do carbono 3 da desoxirribose, com fosfato do carbono 5 do
nucleotídeo seguinte. Os genes apresentam uma extremidade 3’ (da hidroxila livre) e uma
extremidade 5’ (do fosfato livre).
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Essas extremidades têm importância em função das enzimas do fluxo da expressão gênica
reconhecerem a Hidroxila livre, pois, durante a transcrição de um gene, apenas a fita senso
(3’-5’) será convertida em RNA mensageiro, sendo a outra fita mera figurante no processo. Do
ponto de vista genético, o radical mais importante seria a base nitrogenada: Adenina (A),
Guanina (G), Citosina (C) e Timina (T), pois é em função da ordem delas que se permite a
individualidade genética. A diferença básica entre os indivíduos é, em primeira instância, a
ordem das bases nitrogenadas.
Estruturalmente simplificado, um gene apresenta 3 partes distintas:
SÍTIO PROMOTOR
ÉXON
ÍNTRON
SÍTIO PROMOTOR
Promove a transcrição a partir da ligação com a RNA polimerase, que faz a fita complementar
de RNA.
ÉXON
É uma sequência de nucleotídeos que apresenta correlação com o código genético e, portanto,
será convertido em códon.
ÍNTRON
É uma sequência de nucleotídeos que não apresenta correlação com o código genético e que
serão retirados no RNA transcrito primário, no processamento, permitindo que este se converta
em RNA mensageiro (apresenta só éxon).
 ATENÇÃO
Embora os íntrons, em princípio, não apresentem função direta à síntese de proteínas, serão,
para o geneticista forense, de suma importância, visto que as sequências polimórficas
comparadas para vínculo genético estão contidas neles.
 Estrutura de um gene, evidenciando éxons e íntrons, região de união dos éxons (splicing)
no RNAm,
mostrando as etapas de transcrição e tradução.
Do ponto de vista funcional, os genes vão apresentar sequências de nucleotídeos que, muitas
vezes, não estão contidas em sua estrutura, porém fazem parte de sua funcionalidade.
Podemos citar a região denominada TATABOX, como vimos acima.
 Elementos estruturais do TATABOX, com a sequência de consenso TATAWAWA
(esta mesma sequência de estrutura e função similares em diferentes organismos),
onde W tanto pode ser A ou T.
A ORGANIZAÇÃO DO GENOMA HUMANO
Veja, a seguir, um vídeo sobre a organização do genoma humano, sequenciados a partir do
Projeto Genoma Humano, que levará aos polimorfismos genéticos de interesse forense.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
MÓDULO 2
 Descrever o polimorfismo genético
TIPOS DE HERANÇA GENÉTICA
Nem tudo que é genético é hereditário, mas tudo que é hereditário é genético!
 ATENÇÃO
Partindo dessa premissa, um fenômeno genético (aquele que tem implicações no fluxo da
expressão gênica) passa a ser hereditário, a partir do momento que se observa a repetição
daquela característica ao longo das gerações em uma família.
Tal princípio foi usado pelos operadores da lei no século XIX e início do XX para estabelecer
vínculo genético, pois observavam traços fisionômicos em comum em indivíduos envolvidos em
uma ação de paternidade. Ao longo da história da genética forense, muitos casos foram
elucidados a partir do confronto de traços fisionômicos entre o filho e o suposto pai: o juiz
chamava um expert que fazia o confronto, de maneira que incluía ou excluía o vínculo genético
dos envolvidos. Essa ferramenta deu origem aos primeiros marcadores genéticos para uso da
genética forense.
 SAIBA MAIS
A partir dos estudos de Gregor Mendel com as ervilhas, em que foi proposto mecanismo aos
quais as características obedeciam ao serem transmitidas aos descendentes e, em
consequência, foi possível prever a repetição dessas características, utilizando essas
informações para a consulta genética. O trabalho de Mendel deu origem à herança
monogênica ou mendeliana.
Alguns conceitos são importantes para a compreensão do módulo:
GENE
Segmento cromossomial responsável por uma característica
visualizável.
ALELO
Forma alternativa de um gene em um locus. Cada alelo é
recebido de um dos genitores na fecundação.
LOCUS/ LOCI Local/locais onde o gene é inserido no cromossoma.
HOMOZIGOTO Quando os alelos são iguais (ex. AA, aa).
HETEROZIGOTO Quando os alelos são diferentes (ex. Aa).
DOMINANTE
Quando o alelo manifesta a característica em homozigose ou
heterozigose (ex. AA ou Aa).
RECESSIVO
Quando o alelo manifesta a característica apenas em
homozigose (ex. aa).
CODOMINÂNCIA
Quando os 2 alelos manifestam suas características na mesma
proporção (ex. IA IB no grupo sanguíneo AB).
GENÓTIPO Conjunto de alelos para uma característica.
FENÓTIPO É a manifestação morfológica do genótipo e que pode sofrer
influência do meio ambiente.
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FORMAS BÁSICAS DE TRANSMISSÃO DAS
CARACTERÍSTICAS
Existem três formas básicas de transmissão de características:
MONOGÊNICA OU MENDELIANA
Herdada a partir de um único gene em um único locus. Pode ser bialélica (envolve 2 alelos. Ex.
A e a), ou polialélica (envolvendo vários alelos, como no caso dos marcadores VNTR e STR).Podem ser:
Autossômicas - quando o gene/marcador passado está contido entre os cromossomas
do par 1 ao 22 – autossoma, ligado ao cromossomo X; ou
Holândrica - quando o gene/marcador está contido no cromossomo Y.
Com relação à manifestação do fenótipo, pode ser:
Dominante - basta um alelo, independente do 2º para manifestar a característica;
Recessivo - deve ter os 2 alelos iguais para a característica se manifestar; e
Codominante - quando os 2 alelos se manifestam igualmente. Determinam caráter
qualitativo.
POLIGÊNICA E/OU MULTIFATORIAL
A herança Poligênica e/ou Multifatorial será transmitida a partir da alternância de vários genes
em vários loci diferentes, e a combinação dos genes/alelos determinará o fenótipo, com
participação do meio ambiente, por exemplo: altura ou peso; ou sem a participação do meio
ambiente, por exemplo: cor do olho. Determina caráter quantitativo.
MITOCONDRIAL OU EXTRA NUCLEAR
A herança Mitocondrial ou Extra Nuclear é aquela que surge a partir do DNA contido nas
mitocôndrias que vieram da mãe, visto que, em princípio, as mitocôndrias que temos em
nossas células são provenientes das que estavam no citoplasma do ovócito na hora da
fecundação.
As mitocôndrias paternas ficam na base da cauda do espermatozoide, e que degeneram junto
com ela, já que só entra, para fins de fecundação, a cabeça.
 Esquema mostrando a fertilização do óvulo pelo espermatozoide.
Após a fusão das membranas, a cabeça do espermatozoide penetra o óvulo e se separa da
cauda.
Dessa forma, as mitocôndrias do embrião serão provenientes da mãe.
A mitocôndria, de acordo com as teorias de origem da vida na terra, foi uma bactéria não
patogênica que infectou uma célula eucariótica e a partir daí, estabeleceu uma relação
interespecífica de simbiose.
CONCEITO DE MARCADORES GENÉTICOS,
ALELO, GENÓTIPO, IMPRESSÕES DIGITAIS
DE DNA
O genoma humano possui 3.300 Mb (megabases) e cerca de 50.000 genes, excluindo o DNA
mitocondrial. A partir do início do século XXI, com o sequenciamento do genoma pelo projeto
genoma, muito evoluiu o diagnóstico genético (incluindo a genética forense), pois muitas
sequências de nucleotídeos novas puderam ser utilizadas, tanto para fins diagnósticos, quanto
para fins prognósticos pela genética médica.
3.300 MB (MEGABASES)
Apenas 0,1% apresentam uma variação na sequência (polimorfismo) que possibilita a
diferenciação entre indivíduos.
As sequências de nucleotídeos novas que permitiram elucidar fenótipos com precisão
chamamos de marcadores genéticos. Muitos desses marcadores são herdados e assim,
usados para estabelecer vínculo genético, pois são polimórficos, herdados de maneira
monogênica polialélica e apresentam estabilidade em diferentes ambientes.
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MARCADOR GENÉTICO
É uma característica identificável no genoma capaz de distinguir entre dois ou mais indivíduos
ou organismos. Ele deve ser capaz de diferenciar os progenitores e ser reproduzido com
precisão na progênie. São características desejáveis de um marcador genético: alto nível de
polimorfismo e estabilidade.
Outro aspecto dos marcadores genéticos moleculares é que não necessariamente são
importantes na codificação de proteínas, mas sua presença individualiza fenótipos. Esses
marcadores, em laboratório, são chamados de alelos (embora não necessariamente sejam
genes), pois se apresentam sempre em número de dois.
 ATENÇÃO
Outro ponto relevante é que os marcadores são encontrados ao longo do genoma, de maneira
que, após análise de vários marcadores, poderemos individualizar pessoas, já que o conjunto
desses marcadores (a partir de uma tipagem por DNA) gera o que chamamos de “impressões
digitais” ou “perfil por DNA”, fazendo uma analogia às cristas dermatóglifas que são pessoais e
particulares.
MARCADORES GENÉTICOS
POLIMÓRFICOS E APLICAÇÕES FORENSES
CNP (POLIMORFISMO POR NÚMERO DE
CÓPIAS), VNTR, STR, INDELS
São admitidos como marcadores genéticos polimórficos, aqueles que apresentam alelos com
frequência superior a 1% na população em geral. Todos os polimorfismos surgem a partir de
mutações durante a replicação de DNA, que podem ser espontâneas ou provocadas por
mutágenos.
Cerca de 95% do genoma apresentam sequências polimórficas que são suscetíveis à
mutagênese, gerando mais variação e, em consequência, mais polimórficas. O genoma é
composto por mais de 10 bilhões de nucleotídeos que se agregam de várias maneiras, gerando
vários tipos de polimorfismos, onde alguns são de interesse forense. De mais relevância
forense, temos:
MUTÁGENOS
Agentes de natureza química, física ou biológica que induza à mutação.
CNP (POLIMORFISMO POR NÚMERO DE CÓPIAS)
Equivale a uma parte considerável do genoma humano duplicada ou deletada em porções
bastante largas, variando entre 200 pb até 1 Mb. As cópias extras ou faltantes do genoma nos
CNPs podem ser detectadas por hibridação com sondas de oligonucleotídeos de DNA.
Podem ser detectados usando métodos baseados em microarranjos, mas estes têm uma
resolução relativamente baixa quando comparados com abordagens baseadas em
sequenciamento. Devem ser utilizados concomitantemente aos marcadores STR. São muito
utilizados para estudos de frequência populacional.
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VNTR (NÚMERO VARIÁVEL DE REPETIÇÕES IN
TANDEM)
São sequências constituídas por unidades de repetição de 9 a 100 pares de bases que podem
se repetir até 35 vezes em um mesmo locus. Estão contidas nos íntrons gênicos. Foram as
primeiras sequências apresentadas por Alec Jeffreys e aplicadas para fins forenses. Por serem
sequencias maiores, são analisadas pela técnica de RFLP (polimorfismo no comprimento dos
fragmentos de restrição), que utiliza enzimas de restrição.
VNTR são sequências mais aplicadas a casos de paternidade simples (suposto pai-filho-mãe),
e realizadas a partir de sangue periférico, gerando DNA íntegro. São tão polimórficos que a
análise de seis loci já permite com exatidão elucidar o vínculo genético.
 Diagrama de teste de paternidade por DNA.
Resultados da “impressão digital genética” de amostras obtidas da mãe (M), filho (F) e dos
supostos pais (1, 2, 3).
As bandas de DNA de diferentes tamanhos na amostra do filho poderiam ser uma combinação
das amostras da mãe e do pai.
STR (SEQUÊNCIAS CURTAS IN TANDEM)
São sequências extremamente polimórficas e distribuídas ao longo de todo o genoma, por
estarem contidas nos íntrons gênicos. Apresentam unidades de repetição compostas por 3 a 7
pb (pares de bases).
Por apresentarem tamanho menor que 350 pb, sua análise é feita a partir da técnica da PCR
(Reação em Cadeia da Polimerase). Essas características permitem que os marcadores STR
sejam os mais apropriados para a análise forense, visto que é possível a análise de
quantidades ínfimas de amostras biológicas, inclusive degradadas. São analisadas um mínimo
de 16 regiões STR, para um poder de inclusão incontestável.
Tal análise é permitida a partir do uso de sistemas MULTIPLEX, onde vários Primers orientam a
amplificação simultânea de todas as regiões analisadas.
INDELS
Os polimorfismos do tipo INDELS apresentam variações de comprimento geradas por
inserções ou deleções de um ou mais nucleotídeos dentro de uma região do DNA.
Esses marcadores vêm demostrando grande relevância como ferramenta forense por
apresentarem características funcionais dos SNPs (polimorfismo de único nucleotídeo), como,
por exemplo, apresentar fragmentos curtos com baixas taxas de mutação, além de
apresentarem facilidade na genotipagem, assim como os STR, em uma única reação de PCR,
e sendo detectados por eletroforese. Quando usados, faz-se concomitante com o uso de
genotipagem de STR.
POLIMORFISMOS GENÉTICOS
Assista ao vídeo sobre polimorfismo genético e critérios estatísticos, principal ferramenta usada
pelo geneticista forense.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
MÓDULO 3
 Descrever os métodos de análise molecular aplicados à genética forense
HIBRIDIZAÇÃO DE DNA (RFLP)
Desde a década de 1980, quando Alec Jeffreys realizou osprimeiros usos de marcadores
genéticos para estabelecer vínculo genético e contribuiu com suas pesquisas para a área
criminal, muitos foram os avanços observados no setor técnico. A seguir vamos apresentar as
principais técnicas de rotina em genética forense.
ALEC JEFFREYS
Alec Jeffreys (1950) é um pesquisador e professor britânico, considerado o fundador da área
que ficou internacionalmente conhecida como DNA Fingerprint.
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Hibridização de DNA (RFLP) – Restriction Fragment Lenght Polymorphism
São amplamente usados em genética forense. Trata-se da diferença nas sequências de
DNA homólogas que podem ser detectadas pela presença de fragmentos de diferentes
comprimentos. Para esta análise, é realizado o processo de digestão das amostras do
DNA em questão com endonucleases de restrição específicas.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
O RFLP, como marcador molecular, é específico para uma única combinação de clone/enzima
de restrição. A maioria dos marcadores de RFLP é codominante (ambos os alelos na amostra
heterozigótica serão detectados) e altamente específicos do local.
Uma sonda de RFLP é uma sequência de DNA marcada que hibridiza com um ou mais
fragmentos da amostra de DNA digerida após serem separados por eletroforese em gel,
revelando assim um padrão de mancha único característico para um genótipo específico em
um local específico. Os clones de DNA ou cDNA genômico de cópia curta ou única, ou baixa
cópia são tipicamente usados como sondas de RFLP.
 ATENÇÃO
A técnica básica para a detecção de RFLPs envolve a fragmentação de uma amostra de DNA
com a aplicação de uma enzima de restrição, que pode clivar seletivamente uma molécula de
DNA sempre que uma sequência curta e específica for reconhecida em um processo conhecido
como resumo da restrição.
Os fragmentos de DNA produzidos pela digestão são então separados por comprimento
através de um processo conhecido como eletroforese em gel de agarose e transferidos para
uma membrana através do procedimento de Southern blot. A hibridação da membrana com
uma sonda de DNA marcada determina o comprimento dos fragmentos que são
complementares à sonda.
Diz-se que um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição ocorre quando o
comprimento de um fragmento detectado varia entre indivíduos, indicando homologias de
sequência não idênticas. Cada comprimento de fragmento é considerado um alelo, se ele
realmente contém uma região de codificação ou não, e pode ser usado em análises genéticas
subsequentes.
Notas
(A) As sondas RFLP são frequentemente usadas no mapeamento do genoma e na
análise de variações (genotipagem, análise forense, testes de paternidade, diagnóstico
de doença hereditária etc.).
(B) RFLP é uma técnica que explora variações nas sequências de DNA homólogas,
conhecidas como polimorfismos, para distinguir indivíduos, populações ou espécies, ou
para identificar a localização dos genes em uma sequência.
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PCR E SUAS VARIAÇÕES
A técnica de PCR – Reação em Cadeia da Polimerase – é amplamente usada na genética
forense e em outros campos do diagnóstico e pesquisa. A PCR é um método usualmente
empregado para gerar rapidamente de milhões a bilhões de cópias de uma amostra específica
de DNA, permitindo que os cientistas que colham uma amostra muito pequena de DNA e a
amplifiquem em uma quantidade suficientemente grande para estudar em detalhes.
 VOCÊ SABIA
A PCR foi inventada em 1984 pelo bioquímico americano Kary Mullis na Cetus Corporation. É
fundamental para muitos dos testes genéticos, incluindo análise de amostras antigas de DNA e
identificação de agentes infecciosos. Usando PCR, cópias de quantidades muito pequenas de
sequências de DNA são amplificadas exponencialmente em uma série de ciclos de mudanças
de temperatura.
A PCR agora é uma técnica comum e, muitas vezes, indispensável usada em pesquisas de
laboratório médico e laboratório clínico para uma ampla variedade de aplicações, incluindo
pesquisa biomédica e forense criminal. A maioria dos métodos de PCR depende de ciclos
térmicos. A ciclagem térmica expõe os reagentes a ciclos repetidos de aquecimento e
resfriamento para permitir diferentes reações dependentes da temperatura - especificamente,
fusão do DNA e replicação de DNA acionada por enzimas.
A PCR emprega dois reagentes principais:
Iniciadores - que são fragmentos curtos de DNA de cadeia simples conhecidos
como oligonucleotídeos que são uma sequência complementar à região de DNA
alvo
Uma polimerase de DNA.
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DESNATURAÇÃO
ANELAMENTO OU HIBRIDAÇÃO DOS PRIMERS
EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO
DESNATURAÇÃO
Na primeira etapa da PCR, denominada desnaturação, as duas cadeias da dupla hélice do
DNA são separadas fisicamente em alta temperatura em um processo chamado desnaturação
do ácido nucleico.
ANELAMENTO OU HIBRIDAÇÃO DOS PRIMERS
No segundo passo, chamado anelamento ou hibridação dos primers (iniciadores), a
temperatura é reduzida e os iniciadores se ligam às sequências complementares de DNA. As
duas fitas de DNA tornam-se modelos para a DNA polimerase montar enzimaticamente uma
nova fita de DNA a partir de nucleotídeos livres, os blocos de construção do DNA.
EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO
À medida que a PCR progride, o próprio DNA gerado é usado como modelo para replicação,
pondo em movimento uma reação em cadeia, na qual o modelo original de DNA é amplificado
exponencialmente (extensão ou polimerização).
Quase todas as aplicações de PCR empregam uma polimerase de DNA estável ao calor, como
a polimerase Taq, uma enzima originalmente isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus.
Se a polimerase utilizada fosse suscetível ao calor, ela desnaturaria sob as altas temperaturas
da etapa de desnaturação. Antes do uso da polimerase Taq, a polimerase de DNA precisava
ser adicionada manualmente a cada ciclo, o que era um processo tedioso e caro.
 ATENÇÃO
A maioria dos laboratórios forenses emprega a técnica de PCR na avaliação de marcadores
STR.
PCR EM TEMPO REAL
É uma variação do tema da PCR que combina a amplificação normal do DNA pela PCR com a
detecção simultânea do produto de amplificação, geralmente, em um único tubo de reação.
Na PCR, a quantidade de DNA de fita dupla aumenta a cada ciclo. Após múltiplos ciclos de
PCR, há um grande aumento na quantidade de DNA. Na PCR em tempo real, também
chamada de PCR quantitativa, ou qPCR, um agente que se liga ao DNA de fita dupla é
adicionado à reação de PCR. À medida que o DNA de fita dupla é produzido, o agente se liga
ao DNA recém-sintetizado e produz um sinal que permite que a reação seja monitorada em
tempo real. Embora o objetivo da PCR seja a amplificação do DNA, o objetivo da PCR em
tempo real é a análise de uma amostra ou reação de DNA.
PCR FLUORESCENTE EM TEMPO REAL
É uma combinação de amplificação por PCR e detecção de fluorescência. Na sua forma mais
simples, a PCR fluorescente em tempo real envolve o uso de um corante orgânico que é
fluorescente apenas quando ligado a um duplex de DNA. Quando esse corante é adicionado no
início de uma reação de PCR, ocorre um aumento na fluorescência à medida que o número de
duplexes de DNA aumenta, e isso é indicativo de PCR bem-sucedido. SYBR Green é um
exemplo de molécula que se liga ao DNA de fita dupla e se torna fluorescente na ligação (o
complexo dsDNA-corante é fluorescente).
ELETROFORESE CAPILAR E ELETROFEROGRAMA DE
DNA
A eletroforese capilar (CE) é a principal metodologia usada para separar e detectar alelos STR
em laboratórios forenses de DNA em todo o mundo. Para obter uma tipagem STR confiável,
três condições devem ser atendidas:
Primeiro, é necessária resolução espacial para separar os alelos STR que diferem em tamanho
por um único nucleotídeo.

Segundo, é necessária uma resolução espectral para separar as cores doscorantes
fluorescentes umas das outras, para que os produtos de PCR dos locais marcados com
diferentes corantes possam ser resolvidos.

Terceiro, a precisão do dimensionamento do DNA para execução é consistente o suficiente
para que as amostras sejam relacionadas a escadas alélicas executadas para fins de
calibração.
 Gel de eletroforese de DNA.
O diagrama mostra o processo em que uma corrente elétrica é aplicada às amostras de DNA
criando fragmentos que podem ser usados para comparação entre amostras de DNA
1) extração do DNA; 2) isolamento e amplificação do DNA;
3) adição do DNA às placas de gel; 4) Corrente elétrica aplicada ao gel;
5) As bandas de DNA são separadas por tamanho; 6) As bandas de DNA são coradas.
Os elementos primários de um instrumento de CE básico incluem um capilar de vidro estreito,
dois frascos-tampão e dois eletrodos conectados a uma fonte de alimentação de alta tensão.
Os sistemas CE também contêm uma fonte de excitação a laser, um detector de fluorescência,
a bandeja de amostras e um computador para controlar a injeção e detecção de amostras.
SEQUENCIAMENTO DE DNA
O início do século XXI testemunhou uma revolução em nosso conhecimento das sequências de
DNA de vários organismos; o exemplo mais notável é o sequenciamento do genoma humano.
A análise do DNA genômico nos permitirá aprender muito sobre a evolução, a relação entre
diferentes organismos, os mecanismos pelos quais os genes são controlados, a suscetibilidade
a doenças e as linguagens ocultas na sequência do DNA.
 ATENÇÃO
O sequenciamento de um genoma inteiro ainda não é uma técnica de rotina e outros métodos
de análise genética são usados para analisar rápida e efetivamente amostras de DNA. Esses
métodos e tecnologias como a impressão digital do DNA também transformaram a ciência
forense.
Métodos estabelecidos de sequenciamento de DNA, análises genéticas e forenses dependem
do uso de oligonucleotídeos marcados e/ou desoxi ou didesoxinucleosídeo trifosfatos e
requerem uma etapa de polimerização do DNA. Pode ser a reação em cadeia da polimerase
(análise genética na análise STR), uma única extensão de nucleotídeo (minisequenciamento na
análise SNP) ou uma combinação de polimerização e terminação da cadeia de DNA.
Tudo isso foi possível devido aos métodos desenvolvidos por Fred Sanger em Cambridge, há
algumas décadas. Sanger desenvolveu um novo método de sequenciamento de DNA (o
método didesoxi), pelo qual recebeu seu segundo Prêmio Nobel, em 1980.
 SAIBA MAIS
Next-generation sequencing (NGS) - O Projeto Genoma Humano alcançou o sequenciamento
completo dos 3 pares de bases de bilhão do genoma humano, como resultado de um enorme
esforço colaborativo entre 1990 e 2003. O Projeto Genoma Humano contou com o
sequenciamento Sanger (embora com alta otimização e automatização). Agora, é possível
sequenciar um genoma humano inteiro em questão de dias, graças a uma nova geração de
tecnologias de sequenciamento, conhecidas coletivamente como sequenciamento de DNA da
próxima geração.
PRINCIPAIS MÉTODOS DE ANÁLISE
MOLECULAR
Veja agora o vídeo sobre as principais ferramentas moleculares para identificação humana:
AmpFLP (PCR) e RFLP (Enzima de Restricção).
VERIFICANDO O APRENDIZADO
MÓDULO 4
 Identificar os marcadores genéticos complementares
LINHAGEM PATERNA
Quando falamos em marcadores genéticos complementares, estamos nos referindo aos
marcadores presentes nos cromossomos sexuais, X e Y. Desta forma, eles podem ser da
linhagem paterna e da linhagem materna.
Vamos começar com a paterna.
MARCADORES GENÉTICOS NO CROMOSSOMO
Y
Algumas observações sobre o cromossoma Y e os marcadores Y-STR foram descobertas e
introduzidas nas ciências forenses em 1992.
OS MARCADORES STR PRESENTES NESTE
CROMOSSOMO TÊM UM ALTO VALOR INFORMATIVO
PARA ANÁLISES DE POLIMORFISMO EM TESTE DE
PATERNIDADE POR ESTABELECER A
PATRILINHAGEM, HERANÇA GÊNICA PATERNA, QUE
NÃO SOFRE RECOMBINAÇÃO.
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(BUTLER, 2003)
STR
STR (Short Tandem Repeats) - repetições curtas in tandem - estudamos no módulo 2.
O cromossomo sexual Y pertence ao grupo G, e sua classificação é “pequeno e
acrocêntrico”, ou seja, é curto e o centrômero está próximo da extremidade de um
dos braços.
Ele possui cerca de 60 milhões de pares de bases, sendo o terceiro menor
cromossomo do cariótipo humano.
O cromossoma Y possui duas regiões homólogas ao X, essas regiões são
chamadas de PAR1 (região pseudoautossômica 1) e PAR2 (região
pseudoautossômica 2) localizadas nas regiões distais dos braços longo e curto de
ambos os cromossomos. Nesta região, encontra-se o gene da amelogenina
(componente do esmalte dentário).
Marcadores Y-STR podem ser usados para traçar a linhagem paterna de um
homem.
O cromossomo sexual "Y" (e os marcadores STR que contém) é passado de um
pai para seus filhos (herança holândrica); as mulheres não recebem um
cromossoma Y dos pais. Testar o cromossomo Y permite investigar a linhagem
paterna de um homem e pode ajudar a identificar linhas de sobrenome, parentes
javascript:void(0)
vivos cujo cromossomo Y é semelhante ao seu e rotas de migração antigas que
seus ancestrais paternos podem ter adotado.
Estes marcadores são muito empregados em casos de crime sexual, para facilitar a
comparação dos marcadores Y-STR com o perfil do(s) suspeito(s).
Perfil haploide pode fazer a interpretação fácil e direta.
Estes marcadores não discriminam entre homens de uma mesma linhagem paterna
e, por isso, são utilizados para estabelecer a patrilinhagem.
É um marcador usado para sexagem (estipular o sexo genético), em casos de
ossadas encontradas em covas clandestinas ou sítios arqueológicos.
Assim como para os STR autossômicos, é preciso conhecimento prévio das
frequências populacionais.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
HAPLOIDE
O haplotipo é um grupo de alelos em um organismo que são herdados juntos, de um único
progenitor.
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javascript:void(0)
ACROCÊNTRICO
Quando o centrômero está mais próximo das extremidades do que do centro (mas não nas
extremidades de uma cromátide).
INTERPRETAÇÃO
O conhecimento das taxas de mutações nestes marcadores é mister para que se possa evitar
uma falsa exclusão em casos onde seja vista discrepância alélica entre pai biológico e o filho
devido a uma mutação (KURIHARA et al., 2004).
 ATENÇÃO
Nota: Ao contrário dos cromossomos independentes de gênero normalmente usados por
geneticistas forenses, o cromossomo Y carrega mutações por muitas gerações, fornecendo
linhagens masculinas inequívocas. Para diferenciar os cromossomos, os geneticistas usam
haplótipos - pedaços de DNA contendo variações genéticas intimamente ligadas, as quais
foram herdadas como uma unidade.
ESTUDO DE CASO
A seguir, um caso é parcialmente apresentado para ilustrar o tema.
CASO 1
Um jovem pede reconhecimento de paternidade, com o suposto pai -SP- ausente. Todavia,
estão disponíveis dois irmãos do SP, ditos iSP1 e iSP2. Feita a análise de DNA a partir de Y-
STR, os resultados são parcialmente dispostos a seguir:
Tabela 1 – Resultado parcial das análises de Y-STR do caso 1.
Locus Investigado (filho) iSP1 iSP2
DYS392* 13 13 13
DYS390 25 25 25
DYS385 12 ,14 12 ,14 12 ,14
DYS393 13 13 13
DYS89I 14 14 14
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Fonte: O autor.
Nota: DYS é uma variação de jargão usado onde o segundo caractere reflete o cromossomo,
como, por exemplo, D8S1179 para o cromossomo 8.
D=
DNA
Y =
Cromossomo Y
S=
Segmento único
Observe que, nesta tabela 1, há coincidência de todos os alelos entre o indivíduo que requer o
reconhecimento da paternidade e os irmãos do SP, indicando possibilidade de pertencerem a
uma mesma linhagem paterna. Há, contudo, obrigatoriedade de conduzir a análise estatística
para inferir a força deste achado.
Podemos concluir que o uso dos Y-STR é amplo, sendo especialmente importante para casos
de mistura com componentesmasculino e feminino, como em agressões sexuais e também em
análise de patrilinhagem.
O cromossomo Y haploide herdado paternamente compreende o maior componente não
recombinante do genoma humano. A maior parte da molécula escapa aos efeitos
embaralhados da recombinação e representa a maior região haplotípica do genoma humano. O
acúmulo sequencial de dados únicos, substituições de nucleotídeos (SNPs) e pequenas
inserções ou deleções (DIPs) através das gerações, podem ser determinados.
Os marcadores Y-STR possuem o mesmo poder de discriminação que os STR autossômicos?
Um Y-STR é uma repetição curta em tandem (STR) no cromossomo Y. Os Y-STRs são
frequentemente usados em testes forenses, paternidade e de DNA genealógico.
Os Y-STRs são retirados especificamente do cromossomo Y masculino. Esses Y-STRs
fornecem uma análise mais fraca (estatisticamente) que os STRs autossômicos, porque o
cromossomo Y é encontrado apenas nos machos, que são transmitidos apenas pelo pai,
tornando o cromossomo Y em qualquer linha paterna praticamente idêntico. Isso causa uma
quantidade significativamente menor de distinção entre as amostras Y-STR. Os STRs
autossômicos fornecem um poder analítico muito mais forte devido à correspondência aleatória
que ocorre entre pares de cromossomos durante o processo de formação do zigoto.
 ATENÇÃO
A parte especificamente “masculina” do cromossomo Y humano é amplamente usada na
análise de DNA forense, particularmente, nos casos em que o perfil de DNA autossômico
padrão não é suficientemente informativo. Marcadores genéticos para o cromossomo Y são
aplicados para inferir o sexo biológico de um doador de rastreamento de cena de crime.
Os haplótipos compostos por polimorfismos de repetição cromossômica curta em tandem Y
(STRs) são usados para caracterizar linhagens paternas de doadores masculinos
desconhecidos, especialmente adequados quando homens e mulheres contribuíram para o
mesmo traço, como em casos de agressão sexual.
LINHAGEM MATERNA
Em muitas investigações é necessário traçar a linhagem materna, bem como marcadores no
DNA mitocondrial podem também servir para identificações e comparações realizadas a partir
de materiais antigos, como ossadas.
MARCADORES GENÉTICOS NO CROMOSSOMO
X
Algumas observações sobre o cromossomo X e os marcadores X-STR:
A origem dos cromossomos sexuais X e Y em humanos parece ser autossômica,
com a aquisição por um dos pares autossômicos de um loco de determinação
sexual como o fator de determinação testicular (TDF - Testis-determining factor).
Indivíduos do sexo feminino possuem duas vezes cópias de genes do cromossomo
X, contra somente uma do sexo masculino, ao se considerar o padrão diploide
“normal”.
Um dos cromossomos X da mulher é parcialmente inativado durante o período
embrionário (13ª a 16ª semana) de seu desenvolvimento, sendo a inativação
transferida a todas as células somáticas (que não são espermatozoide e óvulo).
Na ovogênese, ocorre a reativação do segundo cromossomo X feminino, que se
recombina com o primeiro.
No sexo masculino, a recombinação do cromossomo X ocorre nas regiões
denominadas pseudoautossômicas.
O cromossomo X equivale a aproximadamente 5% do genoma das células
somáticas em mulheres (2,5% para homens).
Os marcadores localizados neste cromossomo têm um padrão de herança
particular: as mulheres são dizigóticas e os homens são hemizigotos.
Marcadores STR ligados ao cromossomo X possuem aplicação também na
genética médica.
Uma das aplicações do estudo de marcadores ligados ao cromossomo X está na
análise de vinculo genético entre criança do sexo feminino e um suposto pai.
O uso de X-STRs requer um conhecimento preciso não somente das frequências
de alelos e haplótipos, mas ainda do status de ligação genética e desequilíbrio de
ligação entre os marcadores.
Marcadores neste cromossomo podem ser úteis para traçar linhagem materna.
Exemplos de marcadores de X-STRs usados em genética forense: DXS10159-
DXS10162-DXS10164, DXS7132-DXS10079-DXS10074-DXS10075, DXS6809-
DXS6789, DXS7424-DXS101, DXS10103-HPRTB-DXS10101 e DXS10134-
DXS7423, entre outros.
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DNA MITOCONDRIAL
A mitocôndria é uma organela responsável, dentre outras coisas, pela produção de energia na
forma de ATP, a partir da respiração aeróbia.
 SAIBA MAIS
Acredita-se que ela, na origem da vida, foi uma bactéria não patogênica que infectou uma
célula eucariótica e, a partir daí, estabeleceu com seu hospedeiro uma relação de simbiose. O
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que corrobora para este fato é que a mitocôndria apresenta um metabolismo independente de
ordens do núcleo celular. Isso porque, ela apresenta DNA (único e circular) e ribossomos
próprios.
SIMBIOSE
Relação entre espécies diferentes, em que ambas se beneficiam.
Em seu genoma apresenta cerca de 37 genes diferentes e regiões de interesse forense. O
DNA mitocondrial (mtDNA) possui marcadores genéticos (regiões do genoma) utilizáveis em
genética forense. Elas são denominadas regiões hipervariáveis HV1 e HV2. A tipagem dessas
regiões é utilizada na genética forense para estipular a matrilinhagem, visto que as
mitocôndrias que apresentamos em nossas células, são todas herdadas de nossa mãe.
Isso ocorre porque as mitocôndrias que temos são as que estavam contidas no citoplasma dos
ovócitos durante a fecundação, já que as mitocôndrias do espermatozoide degeneram junto
com sua cauda da região controle e compreende o sequenciamento destas com posterior
análise e interpretação.
Sobre o uso forense do mtDNA pode-se ressaltar que:
1. Em determinadas situações, a análise do DNA nuclear não pode ser aplicada (como
em casos onde o DNA está degradado ou em que o material biológico não apresenta o
DNA nuclear). Nesses casos, é comum lançar mão da análise de mtDNA.
2. Em um mesmo indivíduo, podem existir populações de mtDNA diferentes, fenômeno
denominado heteroplasmia.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
HETEROPLASMIA
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javascript:void(0)
Presença de mais do que um tipo de genoma mitocondrial em uma mesma célula ou grupo de
células de um organismo, em função de possíveis mutações que o genoma mitocondrial pode
sofrer.
DEGRADADO
Essa degradação da amostra de DNA pode ser causada por exposição a elementos, como:
fogo, ou por contaminação de micro-organismos, como bactérias e fungos, que são capazes de
danificar a amostra através de processos oxidativos e bioquímicos.
Normalmente, os seres humanos herdam o DNA mitocondrial de seu progenitor feminino.
Todavia, a partir de dados de sequenciamento dos genomas mitocondriais de famílias,
pesquisadores já foram capazes de identificar pessoas que herdaram o mtDNA de ambos os
pais.
Como é a correspondência (match) entre as amostras de mtDNA?
O mtDNA pode ser dividido em três regiões principais: a codificação e as regiões HVR1 e
HVR2 altamente variáveis. O mtDNA é comparado a uma sequência de referência conhecida
para retornar as diferenças entre eles na forma de uma lista de polimorfismos de nucleotídeo
único. Normalmente, uma ou ambas as regiões HVR1 e HVR2 são sequenciadas, pois são
muito mais específicas para um indivíduo do que a região de codificação, que é altamente
conservada.
A amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), geralmente, é realizada em uma
amostra de mtDNA para aumentar a quantidade de DNA disponível para análise, seguida por
técnicas como o sequenciamento de Sanger.
 ATENÇÃO
O DNA mitocondrial vem sendo usado para resolver vários mistérios da antiguidade, como a
linhagem de múmias dos povos do Egito e Inca. Veja algumas leituras a respeito no “Explore
+”.
ESTUDO DE CASO
CASO 2
Mitochondrial DNA: State of Tennessee v. Paul Ware (DAVIS, 1998).
Resumo: Suspeito, Paul Ware, 27 anos, foi preso, acusado de violentar e assassinar uma
menina de quatro anos de idade. A prisão deu-se com base em evidências circunstanciais. Naépoca, a defesa alegou haver outro homem na casa. Ware, contudo, havia sido visto bêbado e
próximo ao corpo da vítima.
Não foi encontrado sêmen e o sangue da vítima nas roupas do acusado não foi identificado.
Contudo, fios de cabelo ruivos foram recuperados do dormitório da vítima e de seu corpo, na
autopsia. A partir daí, a extração de mtDNA foi realizada e confrontado com o resultado de uma
amostra de saliva do suspeito.
Resultado: não eram da mesma pessoa, o que reforçou a alegação da defesa do acusado. Ao
se colocarem os dados obtidos de Ware e dos fios de cabelo em um banco de dados da justiça,
também não se observou emparelhamento.
Notas
(1) O mtDNA é, frequentemente, usado em investigações onde as amostras disponíveis
são fios de cabelo com raiz e ossos.
(2) Em 1995, o FBI Crime Lab conduziu um importante estudo de validação para o uso
de mtDNA na esfera criminal. (WILSON et al., 1995)
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
 ATENÇÃO
O mtDNA é altamente conservado, o que significa que, embora sofra recombinação, ele se
recompõe com o que deveria ser cópias idênticas de si mesmo. No entanto, a taxa de mutação
do mtDNA é dez vezes maior que a do DNA nuclear. Essa propriedade o torna extremamente
útil para estabelecer a evolução das espécies ao longo de muitas gerações através da linha
matrilinear. O genoma do mtDNA foi inteiramente sequenciado para muitas espécies e grupos
de seres humanos de uma ampla variedade de grupos étnicos. É de fita dupla, assim como o
DNA nuclear, embora esteja disposto em uma conformação de loop circular.
E mais... O debate sobre a validade e a confiabilidade dos métodos científicos, geralmente,
surge no tribunal. Quando o governo (ou seja, a Promotoria) é o proponente da evidência, a
defesa é obrigada a contestar sua admissibilidade. Independentemente disso, aqueles que
procuram usar metodologias de tipagem de DNA para analisar evidências biológicas forenses
têm a responsabilidade de entender a tecnologia e suas aplicações, para que possam ser
estabelecidas as bases adequadas para seu uso.
O DNA mitocondrial (mtDNA), um genoma extranuclear, possui certas características que o
tornam desejável para a ciência forense, a saber, alto número de cópias, falta de recombinação
e herança matrilinear. A tipificação do mtDNA tornou-se rotina na biologia forense e é usada
para analisar ossos, dentes, fios de cabelo e outras amostras biológicas antigas, em que o
conteúdo de DNA nuclear é baixo.
 COMENTÁRIO
Para avaliar os resultados obtidos pelo sequenciamento das duas regiões hipervariáveis da
região de controle do genoma do mtDNA humano, é preciso considerar as questões
geneticamente relacionadas da nomenclatura, bancos de dados populacionais de referência,
heteroplasmia, vazamento paterno, recombinação e, é claro, interpretação dos resultados.
VANTAGENS E LIMITAÇÕES DE CADA
MARCADOR GENÉTICO COMPLEMENTAR
Vamos agora discutir alguns tipos de marcadores genéticos usados para identificação humana
por DNA e/ou estabelecimento de vínculo genético. Alguns desses, por vezes, são empregados
como marcadores complementares, mas também podem ser os marcadores de escolha.
AMELOGENINA
Este marcador de gênero (identificação ou tipagem de sexo) é usualmente realizado em
conjunto com kit de tipagem STR. Os produtos de PCR gerados a partir do gene amelogenina
possui tamanhos diferentes para os cromossomos Y e X.
Notas
(1) A capacidade de determinar o sexo de um indivíduo com base no DNA evidência
pode ser crucial em casos como a identificação de vítimas de desastre em massa,
investigação de pessoas desaparecidas e casos de agressão sexual. Atualmente, o
marcador do cromossomo Y amelogenina é amplamente difundido para determinação do
sexo cromossômico de um doador de DNA desconhecido e diferenciando as
contribuições relativas do DNA masculino e feminino em uma amostra forense mista.
(2) Os laboratórios forenses que atuam no campo da genética devem possuir protocolos
de rotina para a determinação de gênero e dispor de métodos alternativos para
confirmação ou esclarecimento de resultados dúbios.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
MINI-STR
As amostras de DNA degradadas são comumente observadas em investigações forenses
envolvendo evidências biológicas. A recuperação de informações dessas amostras
degradadas, geralmente, é aprimorada pelo uso de produtos de PCR menores.
Os amplificadores STR de tamanho reduzido podem ser criados movendo os iniciadores de
PCR para frente e para trás na região próxima à repetição do STR. Esses chamados ensaios
mini-STR podem ajudar a recuperar informações de amostras de DNA degradadas que,
normalmente, produzem perfis parciais e uma perda total de informações de amplificadores
STR maiores.
MINI-STR
Reduced-size STR Amplicons.
É possível, no caso dos mini-STRs, submeter à amplificação simultânea de vários loci em uma
única reação de PCR, permitindo assim, a análise conjunta dos produtos amplificados. Tal fato
proporciona o aumento do poder de discriminação da técnica aplicada e a diminuição não só do
tempo de análise, como também das quantidades de DNA e de reagentes utilizados comparado
ao kit comercial multiplex STR convencional.
Alguns eventos históricos a respeito do uso dos mini-STR:
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1994
Análise do caso Branch Davidian fire in Waco, Texas – uso de 4 mini-STR com melhor
resultado que os marcadores tradicionais para amostras degradadas.
1997
John Butler e colegas submetem pedido de patente para Sistema multiplex contend mini-STR
em espectometria em massa.
2001
Aceito o uso dos mini-STR para análise das vítimas do World Trade Center.
 ATENÇÃO
Os mini-STR são amplicons reduzidos em tamanho dos STR que permitem maior informação a
partir de amostras degradadas.
USO DE MARCADORES GENÉTICOS
COMPLEMENTARES
Assista ao vídeo a seguir para aprender mais sobre marcadores genéticos complementares,
seus usos e limitações.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Como vimos aqui, a herança genética de uma população e a existência de um perfil genético
único para cada indivíduo acabaram se tornando revelações conceituais valiosas no auxílio às
técnicas de identificação por DNA, não só nas investigações forenses convencionais, como
também na solução de crimes (HILL et al, 2008).
Após a ocorrência de um crime, o perito é chamado para auxiliar na identificação e análise de
vestígios, buscando entender como, quando e em que circunstâncias o fato aconteceu. Por
essa razão, o perito que atua em genética forense precisa conhecer os diferentes marcadores
genéticos e suas aplicações, bem como as limitações técnicas de cada tipo. Na investigação de
vínculo genético, não é diferente, o perfeito entendimento das necessidades de um caso é
necessário para o emprego dos recursos adequados. Em adição, os conhecimentos do perito
podem ser usados em outros campos do saber, como na arqueologia e genética médica.
 PODCAST
AVALIAÇÃO DO TEMA:
REFERÊNCIAS
AGOSTINHO, L., PARADELA, E. R., FIGUEIREDO, A. L. S, PAIVA, C. Construção de sistema
multiplex utilizando cinco marcadores mini-STR (short amplicons) para identificação
humana por análise de DNA. Revista Científica da Faminas, 2012.
BUTLER, J. M. Recent Developments in Y-Short Tandem Repeat and Y- single Nucleotide
poly¬morphism Analysis. Forensic Sci. Rev., 2003.
COBLE, M. D., BUTLER, J. M. Characterization of new miniSTR loci to aid analysis of
degraded DNA. J Forensic Sci., 2005.
DAVIS, L. Mitochondrial DNA: State of Tennessee v. Paul Ware. Profiles in DNA, 1998.
FIGUEIREDO, A.L.S; PARADELA, E. Bancos de dados de DNA: Uma ferramenta
investigativa útil. In: Âmbito Jurídico. Rio Grande, IX, n. 32, 2006.
HILL, C. R. et al. Characterization of 26 miniSTR loci for improved analysis of degraded
DNA samples. J Forensic Sci., v. 53, n. 1, 2008.
KURIHARA R et al. Mutations in 14 Y-STR loci among japanisefather-son haplotipes. Int J
Legal Med., 2004.
PARADELA, E. R.; FIGUEIREDO, A.; SMARRA, A. A identificação humana por DNA:
aplicações e limites. In: Âmbito Jurídico. Rio Grande, IX, n. 30, 2006.
STRACHAN, T; READ, A. P. Genética molecular humana. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002.
WILSON, M.R. et al. Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework
analysis. Int. J. Leg. Med., 1995.
EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema:
Leia:
MARASCIULO, M. 7 testes genéticos que descobrem sua ancestralidade. In: Revista
Galileu. Publicado em: 15 abr. 2020.
Pesquise:
EMPOP. Banco de Dados EMPOP. In: Empop. Atualizado em: 28 nov. 2019.
NIST. Banco de Dados de Proteínas Mitocondriais Humanas. In: National Institute of
Standards and Technology. Atualizado em: 1 fev. 2017.
NIST. Short Tandem Repeat DNA Internet Data Base. In: National Institute of Standards
and Technology. Atualizado em: 31 jul. 2020. Obtenha informações do NIST sobre
marcadores realizando a pesquisa neste banco de dados de referência.
CONTEUDISTA
André Luis dos Santos Figueiredo
 CURRÍCULO LATTES
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