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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CARIRI 
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 
 
 
 
DAYANNA MILCA SANTOS DE SOUZA 
 
 
 
 
FILOGENIA E PATOGENICIDADE DE ESPÉCIES DE BOTRYOSPHAERIACEAE 
ASSOCIADAS COM A PODRIDÃO PEDUNCULAR DA SERIGUELA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CRATO 
2020 
 
 
DAYANNA MILCA SANTOS DE SOUZA 
 
 
 
 
 
 
 
 
FILOGENIA E PATOGENICIDADE DE ESPÉCIES DE BOTRYOSPHAERIACEAE 
ASSOCIADAS COM A PODRIDÃO PEDUNCULAR DA SERIGUELA 
 
 
 
 
 
Projeto de dissertação apresentado à 
Coordenação do Programa Multicêntrico de 
Pós-graduação em Bioquímica e Biologia 
Molecular da Universidade Federal do Cariri. 
 
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Kamila Câmara 
Correia 
Co-orientador: 
 
 
 
 
 
 
 
 
CRATO 
2020 
 
 
RESUMO 
 
O objetivo desse projeto é analisar a filogenia e patogenicidade de espécies de 
Botryosphaeriaceae associadas com a podridão peduncular da seriguela (Spondias purpurea 
L.). Tratando-se de uma pesquisa experimental que envolve a caracterização morfológica, 
cultural, molecular dos fungos pertencentes ao complexo Botryosphaeriaceae que provoquem 
a podridão peduncular de em culturas de seriguelas na região do Cariri. Tendo como base o 
desenvolvimento de doenças fúngicas como um fator limitante a produção fruteira no 
Nordeste, espécies da família Botryosphaeriaceae, estão envolvidas com o declínio da cultura 
em grandes e pequenos pomares. Dado o grande potencial econômico da serigueleira é 
necessário o desenvolvimento de estudos voltados para expansão desse cultivo em uma escala 
comercial. 
Palavras-chave: Filogenia. Spondias. PCR. Genes Ribossomais. 
 
 
 
ABSTRACT 
 
The objective of this project is to analyze the phylogeny and pathogenicity of 
Botryosphaeriaceae species associated with peduncular rot of plum (Spondias purpurea L.). 
This is an experimental research that involves the morphological, cultural, molecular 
characterization of fungi belonging to the Botryosphaeriaceae complex that cause peduncular 
rot in plum cultures in the Cariri region. Based on the development of fungal diseases as a 
limiting factor to fruit production in the Northeast, species of the Botryosphaeriaceae family 
are involved in the decline of the culture in large and small orchards. Given the great 
economic potential of the serigueleira, it is necessary to develop studies aimed at expanding 
this cultivation on a commercial scale. 
Keywords: Phylogeny. Spondias. PCR. Ribosomal genes 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 5 
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 7 
2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................... 7 
2.2 OBJETIVO ESPECÍFICO ........................................................................................... 7 
3. JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 8 
4. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................... 9 
5. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 15 
5.1 LOCAL DO EXPERIMENTO ............................................................................... 15 
5.2 ORIGEM E OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS ...................................................... 15 
5.3 PRESERVAÇÃO DOS ISOLADOS ...................................................................... 16 
5.4 CARACTERIZAÇÃO CULTURAL E MORFOLÓGICA .................................... 16 
5.5 ISOLAMENTO DO MATERIAL GENÉTICO E AMPLIFICAÇÃO DE 
SEQUÊNCIA POR PCR .................................................................................................. 16 
5.6 ANÁLISE FILOGENÉTICA ................................................................................. 18 
5.7 TAXA DE CRESCIMENTO E TEMPERATURA ÓTIMA DOS ISOLADOS ..... 18 
5.8 CARACTERIZAÇÃO PATOGÊNICA .................................................................. 19 
6. CRONOGRAMA ............................................................................................................. 20 
7. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 22 
 
5 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
A propagação e o aumento no número e gravidade de fitomoléstia no setor agrícola tem 
influência das mudanças ambientais, estas acabam diminuindo as barreiras naturais e 
facilitando a colonização por fitopatógenos (FREIRE, 2015). Sabe-se que problemas 
fitossanitários evoluem em presença de condições propícias e acabam ocasionando inúmeros 
prejuízos, dentre eles a perda de produção, como também, o aniquilamento de pomares, como 
no caso da resinose (CARDOSO et al., 2006). 
Nesse contexto, os fungos constituem o segundo maior grupo de organismos vivos no 
mundo, são considerados microrganismos importantes em ecossistemas tropicais, já que são 
cosmopolitas (MAIA, 2019). Dentre as diversas famílias encontradas no Reino Fungi, existem 
espécies integrantes do grupo Brotyosphaeriaceae que possuem capacidade de infectar uma 
variedade de hospedeiros, constituindo uma ameaça patogênica e econômica a agricultura 
brasileira (MELH et al., 2017). 
O Brasil tem o ramo da fruticultura como um dos principais setores a movimentar o 
agronegócio, apresentado a região Nordeste como destaque, o país apresenta clima favorável 
para uma grande diversidade de fruteiras tropicais, além desse fato, está situado 
geograficamente em uma área que facilita à exportação (COUTINHO, 2016). O gênero 
Spondia é um exemplo de fruteira que se adaptou bem as condições territoriais e climáticas do 
Brasil (FREIRE, 2001). 
Na região Nordeste, a Spondia purpúrea L., conhecida com seriguela, é a que apresenta 
maior apreciação pela população, contendo relevância econômica nessa área, apesar de ainda 
ser explorada de forma extrativa ou em pomares domésticos. Entretanto, mesmo com a cultura 
extrativista os problemas fitopatológicos já foram encontrados na cultura desse fruto 
(SANTOS et al., 2011; SANTOS-SEREJO et al., 2009; FREIRE, 2001). 
A cultura de seriguela tem como um dos patógenos fungos pertencentes à família 
Botryosphaeriaceae. Estes são organismos que possuem características endofíticas, contudo, 
quando o hospedeiro é sofre alguma condição de estresse eles se tornam fitopatógenos 
(SLIPPERS; WINGFIELD, 2007; FISCHER et al., 2011). Essas espécies atingem tanto 
hospedeiros lenhoso como os nãos lenhosos, produzindo sintomatologia em diferentes partes 
da planta (CROUS et al., 2017). 
A infecção se instala por aberturas naturais ou ferimentos presentes em algumas partes da 
planta, os esporos sexuais e assexuais chegam à planta por meio de água, do vento, entre 
outros. (SWART et al., 1987; SLIPPERS; WINGFIELD, 2007; MEHL et al., 2013). Com base 
6 
 
no exposto, existe uma grande perda do fruto na colheita e pós-colheita, pois, a seriguela é 
bastante perecível. Devido a essa característica ela acaba sendo comercializada próxima a área 
de cultivo, quando embalada para transporte sofre danos mecânicos facilitando a degradação 
por fungos. Além disso, a inadequada manipulação pós-colheita contribui para essa perda 
(LIMA, 2009). 
Apesar de já se conhecer uma gama de fungos pertencentes à família em questão, a 
literatura destaca que seus membros apresentam um número muito alto de variações em 
características morfológicas e culturais de uma mesma espécie obtidas de diferentes 
hospedeiros, bem como, de regiões geográficas distintas, um exemplo, é o fungo 
Lasiodiplodia theobromae (RAM, 1993; RIBEIRO, 2003; PEREIRA et al., 2006; LIMA,2011). 
Nesse sentindo, a facilidade de atacar diferentes tipos de plantas, sua taxonomia complexa 
e seus rearranjos tem dificultado a identificação das espécies em diagnósticos de doenças. 
Assim, a utilização da análise filogenética por meio de genes ribossomais nucleares contribui 
para estudos filogenéticos de Botryosphaeriaceae (MELH et al., 2017; VAN NIEKERK et al., 
2006; CROUS; HAWKSWORTH; WINGFIELD, 2015; SLIPPERS et al., 2017; CROUS et 
al., 2006, ALVES et al., 2008, PHILLIPS et al., 2013). 
 
 
7 
 
2. OBJETIVOS 
 
2.1 OBJETIVO GERAL 
 
Analisar a filogenia e patogenicidade de espécies de Botryosphaeriaceae associadas com a 
podridão peduncular da seriguela. 
 
2.2 OBJETIVO ESPECÍFICO 
 
• Identificar espécies de Botryosphaeriaceae associadas a podridão peduncular da 
Spondias purpurea; 
• Estabelecer a prevalência das espécies patogênicas a Spondias purpurea; 
• Avaliar o grau de patogenicidade das amostras isoladas. 
 
8 
 
3. JUSTIFICATIVA 
 
Nos últimos anos a região Nordeste vem se destacando no setor da fruticultura brasileira, 
principalmente pelas boas condições de temperatura, luminosidade e clima, associado a esse 
fator se tem a superação das barreiras fitossanitárias, se consolidando como um setor de 
desenvolvimento para o país (SANTOS, et al., 2011). 
Nesse contexto, observa-se o aumento por frutas consideradas exóticas, por exemplo, as 
do gênero Spondias que fazem parte da família Anacardiaceae. Desse grupo, a que mais se 
destaca na região é a Spondias purpurea L. conhecida como seriguela, cultivada 
principalmente em pomares domésticos (LIMA & MELEIRO, 2012; SANTOS, et al., 2011). 
Apesar dos avanços, os frutos de Spondias purpurea L. são bastante perecíveis durante o 
manejo pós-colheita, demonstrando amolecimento e apodrecimento em um curto período de 
tempo, desse modo, limitando os locais de comercialização (LEON; SHAW,1990; 
SAUCEDO-VELOZ et al., 2004; KAYS, 1997). 
Além disso, o aparecimento de doenças fúngicas é um fator limitante a produção, no 
Nordeste, associado a fruteiras tropicais espécies da família Botryosphaeriaceae, provocam o 
declínio da cultura em grandes e pequenos pomares (FREIRE et al., 2011; MARQUE et al., 
2013ab, NETO et al., 2014; CORREIA et al., 2016). Nesse sentido, dado o grande potencial 
econômico da serigueleira torna-se essencial o desenvolvimento de estudos voltados para que 
se possa expandir esse cultivo em uma escala comercial (SOUZA, 2018). 
 
 
9 
 
4. REFERENCIAL TEÓRICO 
 
4.1 FRUTEIRAS TROPICAIS NO NORDESTE BRASILEIRO 
 
De acordo com Pereira e Kavati (2011), as fruteiras tropicais são definidas como 
plantas que se originam e se desenvolvem nas zonas tropicais do planeta. Nesse sentido, a 
diversidade climática do Brasil permite o avanço da fruticultura, que contribui de forma 
significativa para o desenvolvimento da agro economia do país. Sua prática se estende a todas 
as regiões brasileiras, tornando-se socioeconomicamente rentável (COUTINHO, 2016; 
FACHINELLO et al., 2011). 
Por meio dos polos irrigados o Nordeste brasileiro se tornou a principal região 
exportadora de frutas tropicais frescas. Os principais cultivos são de mangueiras, videiras, 
bananeiras, cajueiros, citros, coqueiros, goiabeiras, aceroleiras, meloeiros, entre outras 
(LOPES; OLIVEIRA, 2016). 
Contudo, de acordo com Coutinho (2016), no Nordeste existe o cultivo de outras 
frutas tropicais em baixa escala, por isso, acabam não sendo contabilizadas nas estatísticas 
oficiais, normalmente são típicas e endêmicas, cultivadas principalmente em quintais e 
pequenos pomares domésticos. Algumas delas merecem destaque como as espécies de 
Spondias (S. mombin, S. dulcis, S. purpurea, S. tuberosa e Spondias spp.), a ateira (Annona 
squamosa), atemóia (Annona × atemoya), a gravioleira (Annona muricata), pitomba (Talisia 
esculenta), tamarindo (Tamarindus indica). 
 
4.2 GÊNERO Spondias E A ESPÉCIE Spondias purpúrea L. 
 
No presente trabalho, o foco de estudo é a Spondias purpurea L.. Trata-se de uma 
árvore frutífera, conhecida popularmente como seriguela, ciruela mexicana, jacote, ameixa de 
porco, entre outros. A espécie em questão é consumida fresca e vendida em mercados locais e 
transformados em outros subprodutos, por exemplo, polpas e compotas (AVITIA-GARCÍA, 
1997; BARAONA COCKRELL, 2000). 
A S. purpurea L. e outras 17 espécies fazem parte do gênero Spondias, pertencente à 
família Anacardiaceae, que compreende aproximadamente 75 gêneros e 600 diferentes 
espécies. No território brasileiro é possível encontrar o cultivo de seis espécies de Spondias 
que são o umbuzeiro (Spondias tuberosa Camara), a seriguela (S. purpurea L.), o cajá (S. 
mombin L.), o umbu-cajá (Spondias sp.), cajá-manga (S. cytherea Sonn) e umbuguela 
10 
 
(Spondias sp) (PELL et al., 2011; SANTOS; OLIVEIRA, 2008; SILVA et al., 2014). 
De acordo com o estudo de Miller e Knouft (2006), que pesquisaram acerca da 
distribuição geográfica das populações selvagens e cultivadas de S. purpúrea L. destacam que 
as populações cultivadas são encontradas principalmente em ambiente agrícola, quintais, 
pequenas fazendas entre outros. 
A seriguela é obtida de uma árvore de médio porte, está pode atingir cerca de sete 
metros, acerca da sua característica física apresenta uma drupa elipsoidal, com polpa 
aromática de sabor doce, possui grande variedade de cores, destaca-se principalmente a cor 
vermelha e amarela, quando maduras. O comprimento do fruto varia de 2,5 a 5 centímetros 
(MILLER; KNOUFT, 2006; POPENOE et al., 1979). Essa planta é nativa da América Central 
e pode ser encontrada no Nordeste brasileiro, bem como México, Guatemala, Caribe 
(SAMPAIO; HOLSCHUH, 2008; AUGUSTO; VALENTE; RIVELLINO, 2000). 
No estado maduro possui cerca de 7% de açúcares redutores, 1% de amido, a polpa 
obtida apresenta o rendimento médio de 70%, 21° Brix, 0,7% de acidez titulável (expressa em 
ácido cítrico), seu índice de maturação (SST/ATT) é de 34 e pH 3,5 (SANTOS et al., 2011). 
Esse fruto apresenta uma intensa atividade respiratória que limita sua vida útil em 140 horas 
após a colheita, entretanto, essa estimativa varia de acordo com as condições do ambiente em 
que são cultivadas (SAMPAIO; BORA; HOLSDUCH, 2008) 
Dentre as espécies de Spondias é a que apresenta maior apreciação pela população 
(SANTOS et al., 2011). S. purpúrea L. não é contabilizada nos dados oficiais, pois, ainda são 
exploradas de forma extrativa ou em pomares domésticos. Entretanto, apresenta relevância 
econômica, principalmente para as regiões Norte e Nordeste do Brasil (SANTOS-SEREJO et 
al., 2009). 
 
4.3 DOENÇAS ASSOCIADAS À CULTURA DE Spondia purpurea 
 
Dentre as patologias apresentadas na literatura e associadas à serigueleira tem-se a 
antracnose provocada por Colletotrichum gloesporioides (Penz. Sacc.) desenvolvendo 
manchas foliares, podridões em frutos e necroses em ramos (SANTOS, 2001; FREIRE; 
CARDOSO, 1997). A verrugose (Sphaceloma spondiadis Bit. & Jenkins), a cercosporiose 
(Pseudocercospora mombin Petr. & Cif.) e a mancha-de-alga (Cephaleuros virescens Kuntze) 
também foram associadas a esse cultura (FREIRE; CARDOSO, 1997). 
11 
 
Contudo, Freire e Filgueira (2000) destacam que a resinose é a mais séria, dentre as 
citadas, tem como agente patológico fungos da família Botryosphaeriaceae, sendo a 
Lasiodiplodia theobromae o agente mais frequente. A resinose é caracterizada pelo 
aparecimento de manchas escuras, rachadura e intumescência da casca, que evoluem para 
lesões maiores no tronco e ramos lenhosos com exsudação de uma goma. Esse fato ocorre 
principalmente em plantas submetidas a algum tipo de estresse (ALVES et al., 2015; 
CARDOSO, 2018). 
Outra patologia associada à seriguela é a podridão peduncular, sua manifestação 
ocorre no término do climatério. Essa doença pode ser causada pelo grupo de fungos 
pertencente ao complexo Botryosphaeriaceae (FREIRE et al, 2004;OLIVEIRA et al, 2006). 
A podridão peduncular provoca no fruto áreas com tecido encharcado, que tem início no 
pedúnculo do fruto e se expande para o resto do fruto, gerando um aspecto mole e odor 
desagradável. Ocorre necrose abaixo da cutícula que pode atingir a polpa. Quando essa 
doença é causada por espécies de Lasiodiplodia, apresenta rachadura na casca com exposição 
da polpa mole e aquosa (BATISTA et al., 2017; TERAO; BATISTA; RIBEIRO 2006). 
Além do gênero Lasiodiplodia, a Botryosphaeria, Neofusicoccum, Pseudofusicoccum 
entre outros, são bastante associados a danos em fruteiras tropicais no Brasil. Entretanto, a 
Lasiodiplodia se apresenta melhor distribuída nas regiões tropicais e subtropicais 
(COUTINHO, 2016). 
 
4.4 BOTRYOSPHAERIACEAE E SEUS ASPECTOS GERAIS 
 
Trata-se de uma família que engloba uma gama de fungos morfologicamente distintos, 
conhecidos como patógenos, endófitos ou sapróbios. Podem ser encontrados nas mais 
distintas áreas geográficas, exceto nas regiões polares (PHILLIPS et, al, 2013). No que se 
refere aos aspectos taxonômicos, à família Botryosphaeriaceae faz parte do domínio 
Eucaryota, especificamente, constitui o Reino Fungi, filo Ascomycota, da classe dos 
Dothideomycetes e ordem Botryosphaeriales (MYCOBANK, 2018; SCHOCH et al., 2006). 
Essa família abrange 17 gêneros contendo mais de 100 espécies (PHILLIPS et al, 
2013) .Os gêneros que a compõe, são: Lasiodipodia spp., Barriopsis spp., Botryosphaeria spp., 
Botryobambusa spp., Cophinforma spp., Diplodia spp., Dothiorella spp., Neodeightonia spp., 
Macrophomina spp., Phaeobotryon spp., Sphaeropsis spp., Tiarosporella spp., Neoscytalidium 
spp., Neofusicoccum spp., Spencermartinsia spp., Endomelanconiopsis spp., Pseudofusicoccum 
spp. (PHILLIPS et al., 2013). 
12 
 
Os aspectos morfológicos que possibilita a caracterização das Botryosphaeriaceae 
incluem a largura, extensão, septação, espessura da parede e coloração dos picnidióporos, se 
contém presença ou ausência de paráfises e células conidiogênicas. Além desses fatores, a 
identificação dos picnídios com base no estado assexuado e das características dos ascos e 
ascósporo com base no estágio sexual possibilita a identificação desse grupo (CROUS et al., 
2006; SCHOCH et al., 2006; PHILLIPS et al., 2013). 
Porém, a caracterização morfológica desses organismos é bastante discutível, visto que 
a Botryosphaeriaceae apresentam espécies idênticas ou semelhantes do ponto de vista 
morfológico, entretanto, diferem completamente ou parcialmente no processo evolutivo e 
reprodutivo. Nesse caso, a identificação por técnicas de biologia molecular, através do 
sequenciamento de regiões de DNA, se tornou o método mais adequado para diferenciação 
dessas espécies (BICKFORD et al., 2006; DEANMAN et al., 2000; PHILLIPS et al., 2013; 
SLIPPERS et al., 2014). 
Quando patogênicos esses fungos atacam principalmente espécies vegetais lenhosas, 
bem como plantas herbáceas (PHILLIPS et al., 2013). Acerca do processo de virulências, 
apresenta variações que engloba a especificidade do fitopatógeno, o hospedeiro e o ambiente 
(SAKALIDIS et al., 2013). Entretanto, condições que causam estresse ao hospedeiro estão 
associadas a patogenicidade por esse grupo, alterações climáticas, por exemplo, aumenta o 
risco ao desenvolvimento de doenças provocadas por esses fungos (SLIPPERS; 
WINGFIELD, 2007; DESPREZ-LOUSTAU et al., 2006; STURROCK et al.., 2011 ). 
 Desse modo, o estudo desse complexo de fungos ganhou relevância no campo 
agrícola, pois, acomete um grande número de plantas gerando sintomas em diferentes partes 
anatômica da mesma (CROUS et al., 2017). A infecção por esse fitopatógeno ocorre 
inicialmente pelo transporte dos esporos sexuais e assexuais, estes chegam até a planta por 
meio de água, do vento, entre outros. A partir dos esporos se tem o processo de colonização 
do hospedeiro, que se dá principalmente por aberturas naturais ou ferimentos nas folhas, 
caules ou ramos (SWART et al., 1987; SLIPPERS; WINGFIELD, 2007; MEHL et al., 2013). 
 Quando se encontram na forma endofítica convivem de forma harmônica, apenas sob 
situação de estresse passam a ser patogênicos. Assim, passam despercebidos tornando-se uma 
ameaça silenciosa à agricultura, pois, quando patogênicos provocam sintomas que leva a 
morte descendente e seca de ramos, exsudação de resinose, lesões necróticas e cancros. 
Portanto, pode acarreta na morte do hospedeiro, sendo assim importante patógeno de 
sementes, de podridão peduncular e pós-colheita de frutos (SLIPPERS; WINGFIELD, 2007; 
CARDOSO et al., 2006; MARQUES et al., 2013a,b; NETTO et al., 2014; ZHAI et al., 2014). 
13 
 
4.5 ESPÉCIES DE Botryosphaeriaceae ASSOCIADAS À PODRIDÃO DE FRUTOS 
 
Nos últimos anos uma gama de espécies pertencentes à família Botryosphaereriaceae 
vem sendo associada à podridão de diversos frutos, por exemplo, Lopes (2018) através de 
técnicas moleculares identificou Neofusicoccum parvum, Neofusicoccum ribis e 
Neofusicoccum umdonicola associada à podridão pós-colheita de abacate. 
 Seguindo essa linha de raciocínio, Maia (2019) identificou fungos associados a plantas 
de mangues no Ceará, dentre as espécies encontradas a Lasiodiplodia parva e Lasiodiplodia 
theobromae provocaram sintomas em frutos como a manga, banana e goiaba, apresentando 
distintos níveis de severidade. 
 No estudo acerca da patogenicidade de espécies de Botryosphaereriaceae endofíticas 
de plantas da Caatinga no Ceará em manga e umbu-cajá foram identificado L. theobromae, 
Pseudofusicoccum stromaticum, N. parvum/ribis, Botryosphaeria mamane, Lasiodiplodia 
gonubiensis, Pseudofusicoccum adansoniae (GONÇALVES et al., 2016). 
Nesse mesmo segmento, Netto (2012) confirmou que espécies do gênero 
Lasiodiplodia estão envolvidas na podridão peduncular do mamão, principalmente a espécie 
L. theobromae, contudo não constitui um único agente patológico, destacando L. 
pseudotheobromae e L. hormozganensis. 
Espécies como Lasiodiplodia crassispora, L. euphorbicola, L. hormozganensis, L. 
iraniensis, L. pseudotheobromae, L. theobromae , L. xbrasiliense e L. xlaeliocattleyae, 
segundo Rêgo (2018), estão associadas a morte descendente de videiras no Nordeste do 
Brasil. No que diz respeito aos agentes causais de resinose em seriguela, Amâncio (2016), 
identificou as espécies L. pseudotheobromae, L. viticola, L. brasilienses, L. iraniensis e L. 
euphorbicola nos municípios de Crato e Mauriti no Ceará. Além dessas, Lima (2011) 
encontrou uma população de L. theobromae em diversos hospedeiros em municípios do 
Estado do Ceará, dentre eles tem-se serigueleira, cajaraneira, cajueiro, umbuzeiro, entre 
outros. 
 
4.6 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Botryosphaeriaceae 
 
A respeito da caracterização molecular desse complexo as técnicas de biologia 
molecular auxiliam na identificação dessa família de forma mais confiável, pois, não depende 
unicamente dos aspectos morfológicos (BURGESS et al., 2016; CROUS et al., 2016). Nesse 
caso, essas técnicas se tornam relevante devido à infecção por Botryosphaeriaceae ocorre de 
14 
 
forma global pela facilidade em que seus esporos são transportados, principalmente, pela ação 
do homem, pois, estes são pegajosos necessitando assim de chuva e vento para sua 
disseminação (VAN NIEKERK et al., 2010, MEHL et al., 2013; MOYO et al., 2014; 
VALENCIA et al., 2015; SLIPPERS, 2017). 
 Acerca da temática apresentada, a análise de genes ribossomais nucleares é 
fundamental para análise molecular desses microrganismos, dentre eles está à região do 
espaçador interno transcrito (ITS) situada nos genes 18S e 28S do DNA ribossomal, composta 
pelas porções ITS1, ITS2, ITS3 e ITS4 que atuam no processo de transcrição e amplificação 
do DNA (COUTINHO, 2016). 
O fator de elongamento 1 alfa (EF1- α), a betatubulina (TUB) estão envolvidas na 
codificação de proteínas, além de serem bastante conservadas nos organismos. O EF1-α 
participa da fasede iniciação, alongamento e tradução do DNA, enquanto a TUB participa do 
desenvolvimento dos microtúbulos necessários para a divisão celular (KEELING; INAGAKI, 
2004; GLASS; DONALDSON, 1995; EINAX; VOIGT, 2003; O’DONNELL et al., 1998). 
No que diz respeito às Botryosphaeriaceae, utiliza-se, principalmente, a combinação 
de ITS e EF1- α. Entretanto, algumas espécies não apresentam EF1- α, nesse caso, utiliza-se a 
região TUB, mesmo com essa nova combinação ainda não foi suficiente para caracterizar 
todas as espécies. A partir desse contexto, novos estudos introduziram a RNA polimerase II, 
que se mostrou eficiente, inclusive para diferenciar espécies muito semelhantes. 
(CRUYWAGEN et al., 2017; PAVLIC et al., 2009; SAKALIDIS et al., 2011; YANG et al., 
2017; SLIPPERS et al., 2017). 
 
 
15 
 
5. MATERIAL E MÉTODOS 
 
5.1 LOCAL DO EXPERIMENTO 
 
Os experimentos serão conduzidos no Laboratório de Fitopatologia do Centro de 
Ciências Agrárias (CCAB) da Universidade Federal do Cariri (UFCA) campus Crato-CE. 
 
5.2 ORIGEM E OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS 
 
As amostras serão obtidas de serigueleiras em que os frutos apresentem sintomas de 
podridão peduncular, os municípios de coleta serão Juazeiro do Norte, Crato, Barbalha, 
Santana do Cariri, Mauriti, Barros, Moreilândia, Exu no período de janeiro a março nos anos 
de 2020 e 2021. 
Os frutos irão ser submetidos a desinfestação, essa etapa consista na lavagem dos 
mesmo com água corrente, em seguida é submergido em hipoclorito a 1,5% por 1 minuto, 
seguido de duas lavagens em água destilada, cada lavagem com duração de 30 segundos, essa 
processo segue o manual de fitopatologia volume 1 (BERGAMIN FILHO; KIMATI; 
AMORIM, 1995). Em sequência as amostras serão colocadas para secar em papel filtro para 
serem submetidas ao processo de câmara úmida. 
Depois de estarem completamente secos os frutos serão armazenados em uma bandeja 
limpa com álcool 70% e forrada com papel absorvente, cinco frutos de cada amostra serão 
colocados em uma placa de Petri esterilizada com sua devida identificação, em seguida será 
adicionada 20 ml de água destilada no papel absorvente e encubada dentro de um saco, esse 
processo fornece a temperatura e umidade necessária para o desenvolvimento do fungo nos 
frutos de seriguela. O crescimento será observado diariamente. 
Após o crescimento fúngicos nos frutos, eles serão levados para realização do 
isolamento direto na câmara de fluxo laminar. As estruturas presente na região peduncular da 
seriguela são transferidas para uma placa de Petri contendendo o meio de cultura batata-
dextrose-ágar em seguida a placa será fechada com filme plástico. Em uma mesma placa será 
depositado quatro fragmentos fúngico em pontos diferentes. 
Após o crescimento nas regiões com o patógeno, será observado as características 
morfológicas e de contaminação, em seguida pega o crescimento que apresentada visualmente 
sem contaminação e com morfologia semelhante a das Botryosphaeriaceae. O material será 
transferido para o centro de uma placa de Petri contendo o mesmo meio de cultura, 
novamente fechada com filme plástico. Após o crescimento em toda a placa o isolado será 
16 
 
preservado para posterior análise. 
 
5.3 PRESERVAÇÃO DOS ISOLADOS 
 
Os isolados obtidos dos frutos serão preservados em eppendorf contendo 1,5 ml de 
água destilada estérelizada (ADE). Serão utilizados para cada eppendorf cinco a seis discos de 
aproximadamente 5 mm de diâmetro, de meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) 
contendo o crescimento fúngico. Esse processo será realizado em duplicata para cada isolado. 
 
5.4 CARACTERIZAÇÃO CULTURAL E MORFOLÓGICA 
 
A análise das culturas fúngicas será com base na morfologia das colônias. Essa etapa 
consiste na utilização de um disco, contendo o isolado, de aproximadamente 6 mm da 
margem da colônia com três dias de crescimento, este será adicionando em uma placa de Petri 
contendo meio BDA e acondicionadas em estufa incubadora do tipo BOD em temperatura de 
25°C no escuro, esse processo ocorrerá em triplicata para cada isolado. Esse procedimento 
será examinado diariamente durante sete dias corridos, observando a cor e o crescimento do 
micélio aéreo do fitopatógeno. 
As características dos conídios serão estabelecidas através do plaqueamento de um 
disco de aproximadamente 6 mm da margem da colônia com três dias de crescimento, o 
mesmo será adicionando em uma placa de Petri contendo meio ágar-água (AA) contendo 
quatro acículas de pinheiro esterilizadas na superfície, a sua distribuição ocorrerá em quatro 
ponto da placa de modo que fiquem ao redor do disco que apresenta o crescimento do micélio. 
Em seguida deverão serem acondicionadas em foto período de 12 h à 25°C. A iluminação 
fornecida por luz próxima à ultravioleta durante cinco semanas (SLIPPERS et al., 2004). 
Após a incubação, será retirado os picnídios formados em cima das acículas de 
pinheiro, estes serão esmagados para obter os conídios que serão avaliados quanto a forma, 
coloração, presença e ausência de septos e estrias longitudinais. 
 
5.5 ISOLAMENTO DO MATERIAL GENÉTICO E AMPLIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 
POR PCR 
 
A extração do material genético dos isolados será obtida seguindo o protocolo de 
Dellaporta; Wood; Hicks (1983) com modificações. Os micélios das colônias fúngicas serão 
transferidos dos tubos de preservação para placas de Petri contendo BDA, onde irão crescer 
17 
 
por cinco dias. 
Após o período estabelecido o micélio será raspado e transferido para um almofariz, 
em seguida deverá ser acondicionado em freezer com temperatura de aproximadamente -20°C 
por 10 minutos. A amostra congelada será macerada com o auxilio um pistilo. Ao formar uma 
massa homogênea adiciona 500 uL do tampão de extração (Tris HCl 50 mM pH 7,2, EDTA 50 
mM, pH 8,0 e SDS a 10%) e macera até formar uma solução homogênea. 
A solução obtida irá ser transferida para um microtubo de 1,5mL e incubada por 10 
minutos a 65°C, nesse período deve realizar uma mistura do material incubado de forma 
intermitente. A etapa seguinte consiste em centrifugar a solução por 15 minutos a 12.500 rpm 
em temperatura ambiente. Em seguida, desprezar o sobrenadante e o sedimento será colocado 
em um novo microtubo, para que possa ser acrescentado 300 uL de álcool isoamílico (CIA) E 
100 uL de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) a 10%. Posteriormente deverá ser agitado 
em vórtex e logo depois de centrifugado a 12.500 rpm por 15 minutos 
 Logo depois, transfere-se o sobrenadante para um novo recipiente e adiciona 400 uL 
de isopropanol, misturando os conteúdos por inversão, este deve ser armazenado por 12 horas 
no congelador. Na sequência, o material irá ser centrifugado novamente por 10 minutos a 
12.500 rpm. Após essa etapa, despreza o sobrenadante e adiciona 400 uL de etanol a 70% 
junto ao sedimento e centrifuga por 5 minutos na mesma rotação. 
 Por fim, descarta o sobrenadante e adiciona 400 uL de etanol 95% ao pallet 
centrifugando novamente por 5 min a 12.500 rpm. Em seguida, despreza o sobrenadante e 
coloca os tubos para secar, em temperatura ambiente, sobre um papel toalha. O material deve 
secar até que o etanol evapore por completo. Por fim, adicionou-se 80 uL de TE e o microtubo 
foi incubado a 37°C para dissolução o pellet. 
 O DNA genômico obtido será amplificado através da técnica de Reação da Cadeia da 
Polimerase (PCR). O método utilizará como volume final 50 uL, nesse caso, o mix para PCR 
conterá 31,3 uL de água mili-Q, 5 uL de Buffer, 5 uL de dNTP, 4 uL de MgCl2, 1,7 uL de 
cada primer (senso e anti-senso), 0,3 da Taq DNA polimerase e 1 uL de DNA. 
 Os primers descritos por White et a. (1990) serão utilizados para a região do espaço 
transcrito interno que são os ITS-1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′) e ITS4 (5′-TCC 
TCC GCT TATTGA TAT GC-3′). Para amplificação do gene da betatubulina será usado os 
primers TUB2a (5´-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3´) e TUB2b(5´-
ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3´) (GLASS; DONALDSON, 1995). A região do 
EF1-α utilizará os iniciadores EF1-728F (5’ CATCGAGAAGTTCGAGAAGG) e EF1-986R 
(5’ TACTTG AAGGAACCCTTACC) (CARBONE, KOHN.,1999). 
18 
 
 As reações de PCR serão conduzidas por um termociclador (MJ BioCycler 96; 
AppliedBiosystems, Foster City, EUA). Este será programado de formas diferentes para os 
oligonucleotídios iniciadorores ITS e TUB, iniciando com desnaturação a 94°C por 60 s, logo 
após seguirá 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 60 s, em seguida terá a fase de anelamento 
a 51°C por 60 s. A fase de extensão acontecerá a 72°C por um período de 10 min, finalizando 
com a incubação a 4°C. 
 Para o par de oligonucleotídio iniciador EF1-728F e EF1-986R a duração da 
desnaturação inicial a 94°C será de 120 s, seguida por 35 ciclos de desnaturação a de mesma 
temperatura por um período de 60 s, a fase de anelamento durará 30 s com uma temperatura 
de 52°C. A extensão será a 72°C por 10 min, finalizando com a incubação a 10°C. Em 
seguidas as mostras seguirão para sequenciamento no laboratório Macrogen, na Coreia do 
Sul. 
 
5.6 ANÁLISE FILOGENÉTICA 
 
Após obtenção dos sequenciamentos das regiões, em ambas as direções, estas serão 
editadas por meio do programa Staden Package® 209 versão 2.0, bem como a montagem de 
contigs (STADEN; BEAL; BONFIELD, 1998). O alinhamento realizado é semelhante a 
metodologia utilizado por Netto (2012) onde as sequências serão realizadas com base nos 
seguintes parâmetros: alinhamento par a par (gap opening = 10, gap extension = 0.1) e 
alinhamento múltiplo (gap opening = 10, gap 26 extension = 0,2, transition weight = 0,5, 
delay divergente sequences = 25%). Sempre que necessário ocorrerá ajustes manuais. Esse 
processo utilizará o ClustalX v.1.83 (Thompson et al., 1997). 
Como parte da análise filogenética será feito o uso de sequências nucleotídicas das 
espécies de Botryosphaeriaceae obtidas do banco de dados do National Center of 
Biotechnological Information. As relações evolutivas serão obtidas através do método de 
Máxima Parcimônia (MP) que são alcançadas por meio da busca heurística, já o método de 
Máxima Verossimilhança foi utilizado o Bayesian Information Criterion (BIC), para cada 
situação será utilizada 1000 repetições de bootstrap,para estimar a confiabilidade das árvores 
geradas. Ambos os métodos serão realizados dos pelo programa MEGA 5.22 (TAMURA et 
al., 2011; HILLIS; BULL 1993). Todas as sequências resultando dessa pesquisa será 
depositada no GenBank. 
 
5.7 TAXA DE CRESCIMENTO E TEMPERATURA ÓTIMA DOS ISOLADOS 
 
Para realizar a avaliação da taxa de crescimento, bem como avaliar a temperatura 
19 
 
ótima das amostras serão utilizados placas de Petri com aproximadamente 9 mm de diâmetro, 
contendo o meio BDA. Os testes correrão em triplicata para cada isolado. A partir de culturas 
puras dos isolados fúngicos com 10 dias de idade, será retirado da borda da colônia discos de 
micélio com 6 mm de diâmetro. Em seguida, os discos serão transferidos para placas de Petri 
com BDA e incubados separadamente em temperatura controlada de 15, 20, 25, 30, 35 e 40°C 
no escuro por 36 horas. 
A avaliação do crescimento micelial será constituída a partir da medição dos diâmetros 
das colônias em duas direções perpendiculares após as 36 horas, posteriormente, serão 
realizadas as correções dos diâmetros a partir da diminuição do tamanho do disco original (6 
mm). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 30 x 5, 
com 3 repetições (placas) por combinação de isolado e temperatura. A temperatura ideal foi 
estimada usando o modelo de regressão e sumário numérico com auxílio do software 
TableCurve ™ 2D v. 5.01 (SYSTAT Software Inc., Chicago, EUA). Entende-se por 
temperatura ótima aquela que se obteve o maior crescimento radial dos isolados. Os dados 
relativos à temperatura ideal foram comparados pelo teste de diferença mínima significativa 
de Fisher (LSD) ao nível de significância de 5%, utilizando Statistix v. 9.0 (Software 
Analítica, Tallahassee, EUA). 
 
5.8 CARACTERIZAÇÃO PATOGÊNICA 
 
A determinação da patogenicidade, das espécies identificadas nesse estudo, será 
testada a partir da inoculação de estrutura fúngicas em ramos saudáveis, como também será 
utilizada testemunhas. Esse procedimento consistirá com a utilização de ramos 30 centímetros 
de comprimento, obtidos de plantas de seriguelas adultas. Para cada isolado será utilizado 
quatro ramos, estes sofrerão no caule um ferimento de 10 mm de comprimento e 2 mm de 
profundidade. 
Em seguida, ocorrerá a inoculação de um disco de BDA contendo micélio fúngico com 
5 mm de diâmetro, de modo que o inóculo fique em contato com o lenho do ramo. Os discos 
serão retirados da margem de culturas puras dos isolados com 5 dias de idade. Posteriormente 
a região será vedada com parafilme, com o intuito de reduzir a desidratação. O tratamento 
com testemunhas seguirá o mesmo procedimento, exceto que os discos inoculados não terão a 
presença de estruturas fúngicas dos isolados em teste. Os ramos utilizados no procedimento 
permanecerão em condições laboratoriais por 10 dias, logo após o parafilme será removido e 
os ramos serão cortados longitudinalmente para observação do desenvolvimento ou não de 
lesões internas. 
20 
 
6. CRONOGRAMA 
 
PERÍODO 2020.1 2020.2 
Etapas da Pesquisa Jan Fev Mar Abr Maio Jul Ago Set Out Nov Dez 
Definição do tema x 
Levantamento 
bibliográfico 
 x x 
Elaboração do projeto x x x 
Submissão do projeto 
na plataforma SIAD 
 x 
Coleta das amostras x x x 
Obtenção das culturas x x x 
Preservação dos 
isolados 
 x x 
Caracterização 
cultural e morfológica 
das amostras 
 x x x 
Tabulação dos 
resultados 
 x x x x 
Qualificação x 
 
PERÍODO 2021.1 2021.2 
Etapas da Pesquisa Jan Fev Mar Abr Maio Jun Ago Set Out Nov Dez 
Coleta de novas 
amostras 
x x 
Obtenção das culturas x x 
Preservação dos 
isolados 
 x x 
Caracterização do 
cultural e morfológica 
 x x 
21 
 
das amostras 
Tabulação dos 
resultados 
 x x 
PCR x x 
Enviar amostras para 
sequencialmente 
 x 
Análise Filogenética x 
Análise e tabulação 
dos resultados 
 x x 
Defesa da Dissertação x 
 
 
7. REFERÊNCIAS 
 
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	1. INTRODUÇÃO
	2. OBJETIVOS
	2.1 OBJETIVO GERAL
	2.2 OBJETIVO ESPECÍFICO
	3. JUSTIFICATIVA
	4. REFERENCIAL TEÓRICO
	4.1 FRUTEIRAS TROPICAIS NO NORDESTE BRASILEIRO
	4.2 GÊNERO Spondias E A ESPÉCIE Spondias purpúrea L.
	4.3 DOENÇAS ASSOCIADAS À CULTURA DE Spondia purpurea
	4.4 BOTRYOSPHAERIACEAE E SEUS ASPECTOS GERAIS
	4.5 ESPÉCIES DE Botryosphaeriaceae ASSOCIADAS À PODRIDÃO DE FRUTOS
	4.6 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Botryosphaeriaceae
	5. MATERIAL E MÉTODOS
	5.1 LOCAL DO EXPERIMENTO
	5.2 ORIGEM E OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
	5.3 PRESERVAÇÃO DOS ISOLADOS
	5.4 CARACTERIZAÇÃO CULTURAL E MORFOLÓGICA
	5.5 ISOLAMENTO DO MATERIAL GENÉTICO E AMPLIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA POR PCR
	5.6 ANÁLISE FILOGENÉTICA
	5.7 TAXA DE CRESCIMENTO E TEMPERATURA ÓTIMA DOS ISOLADOS
	5.8 CARACTERIZAÇÃO PATOGÊNICA
	6. CRONOGRAMA
	7. REFERÊNCIAS