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Prof. Dr. Alexandre Bechara UNIDADE I Farmácia Integrada A biotecnologia é um conjunto de tecnologias que utilizam células, organelas celulares e moléculas biológicas, com o objetivos de solucionar problemas, bem como desenvolver e/ou melhorar produtos. Biotecnologia – Princípios e aplicações BIOTECNOLOGIA Produção de fármacos Produção de vacinas Análise de DNA Cultura de tecidos e células Clonagem Transformação genética Fonte: autoria própria. Principais diferenças entre medicamentos sintéticos e biológicos Medicamentos sintéticos Medicamentos biológicos Moléculas pequenas (poucos átomos). Moléculas grandes (milhares de átomos). Estruturas simples e estáveis. Estruturas complexas e instáveis. Produzidos a partir de reações químicas. Produzidos por biossínteses em células vivas. É possível fazer cópias idênticas. Impossível fazer cópias idênticas. Não são imunogênicas. Frequentemente imunogênicas. Administração via oral. Via parenteral. Proteínas que são semelhantes às produzidas pelo nosso organismo (hormônio de crescimento). Proteínas de fusão – são criadas pela união de sequências de genes que codificam completamente ou parte de duas ou mais proteínas. Anticorpos monoclonais – anticorpos semelhantes aos produzidos no corpo. Principais grupos de medicamentos biológicos Porção extracelular do receptor de TNF humano Porção FC IgG humana Etanercepte Fonte: Wallis, 2008. Exemplos de insumos obtidos por processos biotecnológicos Fonte: Adaptado de: Sagrillo et al. (2015). Produto Sistema de produção Indicação terapêutica Fatores de coagulação Fator VIII Cultura de células de mamíferos Hemofilia A Fator IX Cultura de células de mamíferos Hemofilia B Fator VIIa Cultura de células de mamíferos Certas formas de hemofilia Anticoagulantes Fator ativador de plasminogênio Cultura de células de mamíferos ou Escherichia coli Infarto do miocárdio Hirudina Levedura Trombocitopenia e prevenção da trombose Hormônios Insulina Levedura/Escherichia coli Diabetes mellitus Hormônio do crescimento Escherichia coli Deficiência do hormônio em crianças, acromegalia, síndrome de Turner Gonadotrofina coriônica Cultura de células de mamíferos Reprodução assistida Paratormônio Escherichia coli Osteoporose Fatores hematopoiéticos Eritropoietina Cultura de células de mamíferos Anemia Fator estimulante de colônia Escherichia coli Neutropenia, transplante autólogo de medula Interferonas Alfa-interferona Escherichia coli Hepatite B e C Beta-interferona Cultura de células de mamíferos Esclerose múltipla Interleucinas Interleucina 2 Escherichia coli Carcinoma de célula renal Anticorpos monoclonais Bevacizumabe Cultura de células de mamíferos Carcinoma metastático do cólon ou do reto Etapas gerais de um bioprocesso Fonte: adaptado de: Schimidell (2021). Microrganismo selecionado – cultura pura Preparo do inóculo – laboratório Preparo do inóculo – etapa industrial (germinadores) Fermentador (reator, dorna) Matérias-primas Meio de cultura selecionado Esterilização Células Separação das células Caldo fermentado Recuperação do produto Produto Controle Tratamento de efluentes Esterilização do arCompressor Ar Etapas gerais de um bioprocesso Processo Upstream Fermentação Processo Downstream Construção do vetor Seleção do clone Lise da célula Purificação Fonte: Azzoni (2019). Fermentação é um processo em que microrganismos catalisam as transformações de um dado substrato em um produto desejado, ou, de modo mais amplo, todo processo no qual as células e/ou preparados enzimáticos provocam a transformação de substâncias. Fermentação como processo unitário Pontos fundamentais do processo fermentativo: microrganismo; meio de cultivo; esterilização e desinfecção; aparelhagem; processo fermentativo; separação de produto e subproduto. Espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes características gerais: apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto; permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentração do produto; não produzir substância incompatíveis com o produto; apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico; não ser patogênico; não exigir condições de processo muito complexas; não exigir meios de cultura dispendiosos. Microrganismos Microrganismos utilizados em bioprocessos – área da saúde Fonte: adaptado de: microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/ E. coli Leveduras Linhagem de células de insetos Linhagem de células de mamíferos Plantas e animais transgênicos 3% 24% 56% 4% 13% Avalie as alternativas abaixo acerca das características de medicamentos e assinale aquela que se relaciona exclusivamente com as propriedades de um medicamento biológico. a) Não apresenta imunogenicidade. b) Produzida por reações químicas sem envolver organismos vivos. c) Moléculas grandes, com milhões de átomos. d) Estrutura mais simples e mais estável. e) Favorece a administração pela via oral. Interatividade Avalie as alternativas abaixo acerca das características de medicamentos e assinale aquela que se relaciona exclusivamente com as propriedades de um medicamento biológico. a) Não apresenta imunogenicidade. b) Produzida por reações químicas sem envolver organismos vivos. c) Moléculas grandes, com milhões de átomos. d) Estrutura mais simples e mais estável. e) Favorece a administração pela via oral. Resposta Em relação ao meio de cultivo espera-se: ser o mais barato possível; atender às necessidades nutricionais do microrganismo; auxiliar no controle do processo; os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de estarem disponíveis todo o tempo; ter composição razoavelmente fixa; não causar dificuldades no tratamento final do efluente. Meio de cultura Biorreatores, ou reatores para processos biológicos, podem ser definidos como sistemas desenvolvidos para realizar um bioprocesso, que apresentam um ambiente propício ao crescimento celular e à síntese do bioproduto de interesse. A principal função de um biorreator é fornecer um ambiente controlado para o crescimento de um microrganismo para obter um produto desejado. Aparelhagem Fonte: https://www.freshlycosmetics.com/pt/glossario-ingredientes/bifida-ferment-lysate Fonte: adaptado de: Schimidell (2021). Bancada Piloto Industrial 200 – 400 mL 1 – 10 L 50 – 200 – 500 L 5 – 50 – 200 m3 Variáveis medidas e controladas em um biorreator convencional Fonte: adaptado de: Schimidell (2021). Composição dos gases de exaustão Velocidade de agitação Temperatura Vazão de ar Vazão de meio suplementar Biorreator OD Pressão pH Massa/Volume CO2 O2 Variável medida Variável medida e empregada em malha de controle (aberta ou fechada) Vários tipos de processos de cultivo de microrganismos: Processo descontínuo (batelada). Descontínuo alimentado. Contínuo. Semicontínuo. Processos fermentativos Processo Descontínuo (batelada): Consiste na adição do meio de cultura e do microrganismo na dorna de fermentação no início do processo, sem haver adição de substrato e/ou retirada do produto até o final do processo fermentativo. Tipos de Processos Fermentativos Meio de cultura Microrganismo Produto Fermentação Fonte: autoria própria. Descontínuo alimentado: Consiste na adição de substrato durante o processo fermentativo e os produtos formados permanecem dentro do reator até o final do processo. Tipos de Processos Fermentativos Meio de cultura Substrato Fermentação Produto Microrganismo Fonte: autoria própria. Contínuo: Adição do meio de cultura e a retirada do caldo fermentado continuamente, volume constante, o sistema atinge a condição de estado estacionário na qual não há variação da concentração celular, de nutrientes e de produto no meio em fermentação. Tipos de ProcessosFermentativos Fonte: autoria própria. Meio de cultura Caldo fermentado Fermentação Produto Microrganismo Substrato Semicontínuo: Um processo em que, após o término da fermentação, parte do caldo fermentado é retirado para fins de separação do produto, sendo adicionado no biorreator o mesmo volume do meio de cultura, de modo a adicionar o substrato e, simultaneamente, restabelecer o volume de trabalho. Tipos de Processos Fermentativos Meio de cultura Caldo fermentado Fermentação Microrganismo Substrato Fonte: autoria própria. Curva típica do crescimento bacteriano: Preparo do inóculo Tempo Fase de aceleração Fase de latência Fase exponencial Fase de desaceleração Fase estacionária Fase endógena ou de declínio L o g ( n ú m e ro d e c é lu la s ) Fonte: adaptado de: Monte et al. (2018). Cultura pura Volume de Meio = V1 Volume de Meio = V2 > V1 Volume de Meio = V3 > V2 Incubação Fase de Laboratório Incubação Incubação Fase Industrial Dorna Volume de Meio = V4 > V3 Volume de Meio = V5 > V4 Fonte: adaptado de: Vitolo (2015). A cinética de um bioprocesso consiste na análise da evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema de cultivo em razão do tempo de fermentação. X – Concentração celular. S – Concentração de substrato. P – Concentração de produto. Cinética de processos fermentativos Fonte: adaptado de: Schimidell (2015). Tempo (h) Tempo (h) Tempo (h) 12 9 6 3 0 X , S , P 12 9 6 3 0 X , S , P 15 12 9 6 3 0 X , S , P S S X P S X P X P 0 2 4 6 0 2 4 6 8 10 12 14 0 10 20 30 40 50 Controles de bioprocessos e otimização Diminuir o tempo Aumentar a produção Aumentar a produtividade Mercado competitivo Técnicas de controle e otimização de processos Processo Produtivo Medir Analisar dados Controlar Fonte: autoria própria. Temperatura. PH. Volume. Espuma. Pressão. Agitação. Viscosidade. Gases. Controles importantes nos bioprocessos Os bioprocessos podem ser classificados em processo descontínuo, processo descontínuo alimentado, processo contínuo e processo semicontínuo. A escolha por uma destas formas de operação deve considerar diferentes critérios, entre eles, a fisiologia da célula. Em relação aos processos citados, assinale a alternativa correta. a) A produtividade é a mesma nos diferentes processos descritos. b) No processo semicontínuo ocorre recuperação do produto durante todo o período de fermentação. c) O processo contínuo apresenta maior rendimento, porém, o risco de contaminação é maior comparado aos processos descontínuos. d) A cinética do processo descontínuo alimentado é igual à cinética apresentada no processo descontínuo por batelada. e) A retirada de produto durante a fermentação do processo descontínuo alimentado possibilita maior recuperação do produto. Interatividade Os bioprocessos podem ser classificados em processo descontínuo, processo descontínuo alimentado, processo contínuo e processo semicontínuo. A escolha por uma destas formas de operação deve considerar diferentes critérios, entre eles, a fisiologia da célula. Em relação aos processos citados, assinale a alternativa correta. a) A produtividade é a mesma nos diferentes processos descritos. b) No processo semicontínuo ocorre recuperação do produto durante todo o período de fermentação. c) O processo contínuo apresenta maior rendimento, porém, o risco de contaminação é maior comparado aos processos descontínuos. d) A cinética do processo descontínuo alimentado é igual à cinética apresentada no processo descontínuo por batelada. e) A retirada de produto durante a fermentação do processo descontínuo alimentado possibilita maior recuperação do produto. Resposta Etapas gerais de um bioprocesso Processo Upstream Fermentação Processo Downstream Construção do vetor Seleção do clone Lise da célula Purificação Fonte: Azzoni (2019). Processo downstream – as operações de recuperação e purificação (são a chave para a obtenção de produtos de elevada qualidade). As etapas do processo de purificação dependem de algumas características do produto como: localização do produto produzido pela célula; características físico-químicas do produto, ou seja, tamanho molecular, densidade, concentração, solubilidade, carga elétrica, hidrofobicida; características físico-químicas do meio, como viscosidade, densidade, impurezas e partículas indesejáveis; e da aplicação final do produto. Separação do produto e subproduto Principais etapas da recuperação e purificação de biomoléculas Células Biorreator Separação células-líquido Liberação do produto (rompimento celular) Separação sólido-líquido Purificação de baixa resolução Purificação de alta resolução Acondicionamento do produto Meio extracelular contendo a biomolécula secretada Biomolécula purificada Fonte: adaptado de: Schimidell (2021). O processo de purificação pode ser dividido em quatro etapas: 1. Separação de células e seus fragmentos (clarificação). 2. Concentração e/ou purificação de baixa resolução. 3. Purificação de alta resolução. 4. Operações para acondicionamento final do produto. 1. Clarificação – separação entre células e meio líquido, da qual resulta um líquido clarificado. Principais etapas da recuperação e purificação de biomoléculas Fonte: adaptado de: Schimidell (2021). Filtração tangencial Saída do Filtrado Corrente de concentrado Corrente de alimentação Pa Pr Pf Corrente de permeado Membrana Canal de escoamento da suspensão Fonte: Resende (2015). Etapa do processo Operações unitárias Princípio Clarificação Filtração convencional Tamanho das células Centrifugação Tamanho e densidade das células Filtração tangencial (membranas) Tamanho das partículas Fioculação Hidrofobicidade de partículas Métodos de rompimento celular: Mecânicos (homogeneizador de alta pressão, moinho de bolas, prensa francesa e ultrassom). Não mecânicos ou físicos (choque osmótico, congelamento e descongelamento, aquecimento e secagem). Químicos (álcalis, solventes, detergentes e ácidos). Enzimáticos (lise enzimática ou inibição da síntese da parede celular). Principais etapas da recuperação e purificação de biomoléculas 2. Concentração e/ou purificação de baixa resolução. 3. Purificação de alta resolução. Principais etapas da recuperação e purificação de biomoléculas Fonte: adaptado de: Schmidell (2021). Etapa do processo Operações unitárias Princípio Purificação de Baixa resolução Precipitação Solubilidade Ultrafiltração (membranas) Massa molar, raio hidrodinâmico e forma das moléculas Etapa do processo Operações unitárias Princípio Purificação de alta resolução Cromatografia de troca iônica Tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula Cromatografia de afinidade biológica ou química Absorção em sítios específicos da superfície de um proteína Cromatografia de interação hidrofóbica Hidrofobicidade Cromatografia de exclusão molecular Massa molar 4. Operações para acondicionamento final do produto. Principais etapas da recuperação e purificação de biomoléculas Fonte: adaptado de: Schmidell (2021). Etapa do processo Operações unitárias Princípio Tratamentos finais Cristalização Solubilidade e propriedades do equilíbrio líquido-sólido Liofilização Propriedades do equilíbrio líquido-sólido Secagem Propriedades do equilíbrio líquido-sólido Sabe-se que as operações de recuperação e purificação são a chave para a obtenção de produtos biológicos de elevada qualidade. Contudo, as etapas do processo de purificação dependem de algumas características do produto. Assinale entre as alternativas a seguir qual delas representa uma etapa na produção de produtos biológicos sem vínculocom operações de recuperação e purificação. a) Separação de células e de seus fragmentos (clarificação). b) Seleção do clone com vetor inserido em seu material genético. c) Concentração e/ou purificação de baixa resolução. d) Purificação de alta resolução. e) Operações para acondicionamento final do produto. Interatividade Sabe-se que as operações de recuperação e purificação são a chave para a obtenção de produtos biológicos de elevada qualidade. Contudo, as etapas do processo de purificação dependem de algumas características do produto. Assinale entre as alternativas a seguir qual delas representa uma etapa na produção de produtos biológicos sem vínculo com operações de recuperação e purificação. a) Separação de células e de seus fragmentos (clarificação). b) Seleção do clone com vetor inserido em seu material genético. c) Concentração e/ou purificação de baixa resolução. d) Purificação de alta resolução. e) Operações para acondicionamento final do produto. Resposta Utilizar apenas uma cadeia enzimática existente na célula, responsável por uma biotransformação-alvo. O uso de catalisadores de alto custo, como as enzimas, requer a recuperação e a reutilização destas para tornar o processo economicamente viável. Isso é alcançado com a aplicação de enzimas na forma imobilizada. Técnicas de imobilização podem alterar as propriedades da própria enzima, produzindo biocatalisadores com elevada atividade, especificidade e estabilidade. Biorreatores enzimáticos Métodos de imobilização enzimática Fontes: adaptado de: ROCHA FILHO, J. A.; VITOLLO, M. Guia para aulas práticas de biotecnologia de enzimas e fermentações. São Paulo: Blucher, 2017. Técnicas de imobilização de enzimas Aprisionamento Formação de ligações Em matriz (enredamento) Em membranas (encapsulamento) Absorção Ligação covalente Enzima/ suporte Enzima/ enzima Absorção Reticulação EncapsulaçãoConfinamento Ligação covalente Reator de batelada – terminada a reação, a enzima imobilizada pode ser separada da mistura final com relativa facilidade (filtração ou decantação, por exemplo). Reator de leito fixo – Neste tipo de reator, a enzima imobilizada é empacotada, permanecendo estacionária, enquanto a solução de substrato é bombeada através dela. Reator de leito fluidizado – A enzima imobilizada neste caso encontra-se em suspensão no interior do reator, sendo a solução de substrato bombeada através dela. A velocidade de fluxo da solução de substrato é alta o suficiente para impedir a deposição das partículas no fundo do reator, e baixa o suficiente para evitar que estas sejam arrastadas no efluente. Reator agitado continuamente – Neste caso há entrada e saída contínua de fluido. Eventualmente certa quantidade de enzima pode ser arrastada no efluente, devendo-se, por isso, acoplar na saída um sistema que permita recuperá-la (filtração, por exemplo). Tipos de reatores enzimáticos Biossegurança é o conjunto de ações voltadas para a prevenção, minimização ou eliminação de riscos inerentes às atividades de: Pesquisa. Produção. Ensino. Desenvolvimento Tecnológico. Prestação de serviços (laboratório clínico) capazes de comprometer a saúde do homem, dos animais, das plantas, do ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos. (CTBio-FIOCRUZ, 2003) Biossegurança Sob o ponto de vista da biossegurança, os microrganismos são classificados em dois grupos: Grupo I – microrganismos não patogênicos. Grupo II – microrganismos patogênicos para o homem, os animais e as plantas. São classificados de acordo com sua capacidade de causar infecção, patogenia, transmissão, morbidade, mortalidade, epidemia e por ter ou não tratamento. Biossegurança Classificação de risco dos agentes biológicos: Classe de risco 1 Classe de risco 2 Classe de risco 3 Classe de risco 4 Níveis de Biossegurança (NB): NB-1 NB-2 NB-3 NB-4 Art. 1º Esta Resolução possui o objetivo de estabelecer os requisitos mínimos para o registro de produtos biológicos novos e produtos biológicos no país, visando garantir a qualidade, segurança e eficácia destes medicamentos. Aprovação de medicamentos biológicos Ministério da Saúde Agência Nacional de Vigilância Sanitária RESOLUÇÃO – RDC n. 55, DE 16 DE DEZEMBRO DE 2010 Dispõe sobre o registro de produtos biológicos novos e produtos biológicos e dá outras providências. I. Vacinas; II. Soros hiperimunes (RDC 187/17); III. Hemoderivados; IV. Biomedicamentos classificados em: a) medicamentos obtidos a partir de fluidos biológicos ou de tecidos de origem animal; b) medicamentos obtidos por procedimentos biotecnológicos. V. Anticorpos monoclonais; VI. Medicamentos contendo microrganismos vivos, atenuados ou mortos; RDC n. 55 de 16 de dezembro de 2010 Art. 18. Todas as indicações terapêuticas solicitadas no registro, para o produto biológico novo ou produto biológico, devem estar documentalmente demonstradas nos relatórios dos estudos clínicos. Os estudos clínicos devem ser conduzidos com o produto biológico novo ou produto biológico apresentado para o registro. Art. 28. Independentemente da via de desenvolvimento utilizada, no ato do protocolo do pedido de registro de um produto biológico novo ou produto biológico, a empresa deverá apresentar relatório do estudo de imunogenicidade. RDC n. 55 de 16 de dezembro de 2010 RDC n. 55 de 16 de dezembro de 2010 Fonte: Adaptado de: Ferreira Neto et al. (2019). Vias para registro de produtos biológicos no Brasil, segundo a RDC nº 55/2010 Produtos biológicos novos Produtos biológicos Dossiê completo Via de desenvolvimento individual Via de desenvolvimento por comparabilidade Inclui estudos não clínicos e clínicos de fases I, II e III Estudos não clínicos reduzidos e clínicos de fase III comparativos Exercício da comparabilidade (estudos não clínicos e clínicos comparativos) O processamento downstream biofarmacêutico refere-se à recuperação e purificação de uma substância medicamentosa. O processamento downstream biofarmacêutico é aplicável em processos de mAb ou proteínas, bem como na fabricação de oligonucleotídeos, polissacarídeos e diversas vacinas. Assinale a alternativa incorreta. a) O objetivo do processamento downstream é isolar, purificar e concentrar a substância medicamentosa previamente sintetizada. b) O processo é constituído de 4 etapas e se inicia com a clarificação, processo que separa as células do meio de cultura. c) Para a produção de medicamentos biológicos são necessários processos de purificação de alta resolução. d) Todos os processos downstream se iniciam com a lise celular. e) A liofilização e secagem são os processos finais para acondicionamento do produto. Interatividade O processamento downstream biofarmacêutico refere-se à recuperação e purificação de uma substância medicamentosa. O processamento downstream biofarmacêutico é aplicável em processos de mAb ou proteínas, bem como na fabricação de oligonucleotídeos, polissacarídeos e diversas vacinas. Assinale a alternativa incorreta. a) O objetivo do processamento downstream é isolar, purificar e concentrar a substância medicamentosa previamente sintetizada. b) O processo é constituído de 4 etapas e se inicia com a clarificação, processo que separa as células do meio de cultura. c) Para a produção de medicamentos biológicos são necessários processos de purificação de alta resolução. d) Todos os processos downstream se iniciam com a lise celular. e) A liofilização e secagem são os processos finais para acondicionamento do produto. Resposta AZZONI, S. F. “Design” de Bioprocessos. Bioquímica Brasil. 2019. Disponível em: https://bioquimicabrasil.com/2019/10/13/design%E2%80%8B-de-bioprocessos/. Acesso em: 18 out. 2023. BRUNO, A. N. Biotecnologia, v. 1. Porto Alegre: ArtMed, 2014. FERREIRA, P. T. P.; NUNES, P. H. C.; VARGAS, M. A. Intercambialidade de produtosbiológicos no Sistema Único de Saúde (SUS): principais desafios regulatórios. Cadernos de Saúde Pública , v. 35, 2019. Disponível em: https://www.scielo.br/j/csp/a/PsC7zvL6YzHftGnC7hXBq4N/?lang=pt. Acesso em: 20 out. 2023. LIMA, U. A. L. et al. Biotecnologia industrial: processos fermentativos e enzimáticos, v. 3. São Paulo: Blucher, 2002. OLIVEIRA, V. G. Processos biotecnológicos industriais. São Paulo: Érica, 2015. ROCHA FILHO, J. A.; VITOLO, M. Guia para aulas práticas de biotecnologia de enzimas e fermentação. São Paulo: Blucher, 2017. Referências SAGRILLO, F. S.; DIAS, F. R. F.; TOLENTINO, N. M. C.; OLIVEIRA, V. G. Processos produtivos em biotecnologia. São Paulo: Érica, 2015. SCHIMIDELL, W. Biotecnologia industrial: engenharia bioquímica, v. 2. São Paulo: Blucher, 2021. VITOLO, M. et al. Biotecnologia farmacêutica: aspectos sobre aplicação industrial. São Paulo: Blucher, 2015. WALLIS, R. S. Tumour necrosis factor antagonists: structure, function, and tuberculosis risks. The Lancet Infectious Diseases, v. 8, n. 10, 2008, p. 601-611. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1473309908702275. Acesso em: 18 out. 2023. Referências ATÉ A PRÓXIMA!
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