Ensaios de viabiliade in vitro

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Ensaios in vitro
Viabilidade celular
Testes in vitro
Testes in vitro são aqueles métodos ou técnicas que podem substituir ou diminuir o uso de animais na experimentação
Essas técnicas compreendem a utilização de organismos como: bactérias, fungos, algas e crustáceos além de frações subcelulares presentes no sistema biológico como suspensões celulares, cultivo de tecidos, cultivos celulares, enzimas e proteínas.
Vantagens: Rapidez na execução, sensibilidade, baixo custo em relação aos testes in vivo e possibilidade de limitação do número de variáveis experimentais.
O que testes in vitro permitem avaliar?
Viabilidade celular
Tipo e grau de dano celular
Metabolismo celular
Expressão de proteínas
Entre outros…
Fatores que podem influenciar ensaios toxicológicos in vitro
Os ensaios toxicológicos são feitos para determinar os níveis de ingestão das substâncias que causam dano ao ser humano. Para isso, a determinação desse nível deve ser feita analisando diversos níveis e parâmetros:
	Dose ou concentração de exposição
Frequência de exposição
tempo de exposição
Via de exposição
3Rs
Replacement (Substituição)
	Substituição do uso de vertebrados em experimentos, utilizando outros recursos
Redution (Redução)
	Reduzir o numero de animais utilizados
Refinament (Refinamento)
	Minimizar a quantidade de desconforto ou sofrimento animal
Infra estrutura de um laboratório de cultivo celular
Assepsia
Isolamento
Controle de pessoas 
Equipamentos
Biofreezer
Geladeira/freezer
Banho de aquecimento
Estufa de incubação celular
Fluxo laminar
Autoclave
Estufa de secagem
Agitador
Vortex
Pipetador automático
Micropipetador
Mocropipetador multicanal
Pipetas
Ponteiras
Eppendorf
Falcons
Garrafas de cultivo
Placas
Placa de petri
Placa 4 poços
Placa 6 poços
Placa 12 poços
Placa 24 poços
Placa 96 poços
Microscopia
Microscópio óptico
Microscópio invertido
Microscópio de fluorescência
Cultura celulares
Permite manter e estudar o comportamento de células vivas fora do organismo.
Isolamento de células específicas
Manutenção da viabilidade e proliferação dessas células em um sistema in vitro constituído de nutrientes e fatores essenciais à sobrevivência, sob condições controladas de temperatura, pH e osmolaridade
Culturas primárias e imortalizadas
Cultura primária
Obtida a partir da fragmentação ou dissociação mecânica e/ou enzimática de tecidos.Desse modo, as células que sobrevivem ao processo de isolamento irão apresentar características genotípicas e fenotípicas do seu tecido de origem, inicialmente heterogêneas, sendo uma vantagem para investigação de um evento fisiológico ou patológico
Células imortalizadas
Possuem alta capacidade proliferativa e podem se dividir por um grande número de vezes sem perder as suas características (células homogêneas),
Cultura primária
Divisão limitada
Necessidade de condições específicas para crescimento
Mantém as características naturais do tecido de onde foram isoladas
Maior dificuldade para manutenção
Linhagens
Divisão ilimitada
Não necessita de condições otimizadas
Podem alterar as características naturais de onde foram originadas
Maior facilidade na manutenção’
Cultivo celular
Fase Lag: Período de adaptação sem proliferação após adição das célula ao meio de cultivo.
Fase Log: Fase exponencial, período de multiplicação celular máxima e constante. Fase com maior viabilidade e atividade metabólica das células
Fase estacionária:Velocidade de crescimento diminui, número de células novas tende a ser equivalente ao número de células mortas
Declínio: Redução drástica do número de células e o número de células mortas excede o de células novas.
Contaminação da cultura
Um dos principais problemas do cultivo de células é contaminação, ela é introduzida por meio de técnicas assépticas impróprias, materiais esterilizados inadequadamente (pipetas, frascos de cultura, tubos, etc.) ou reagentes contaminados (tampões, meios de cultura, tripsina, etc.).
Bactérias
 A maioria dos contaminantes bacterianos são capazes de colonizar rapidamente e florescer em meios de cultura celular. A respectiva contaminação geralmente pode ser facilmente detectada por microscopia como grânulos minúsculos que se movem entre as células poucos dias após a contaminação inicial.
Micoplasma
Os micoplasmas afetam vários parâmetros celulares, incluindo crescimento, morfologia, metabolismo, antigenicidade e o genoma das células cultivadas sem induzir alterações visuais evidentes
Fungos
Contaminação cruzada
 Quando uma linhagem acaba sendo contaminada por outra utilizada no laboratório.
	-Manipulação inadequada
	-Falta de esterilização
	-Difícil percepção
Azul de tripan
Vermelho neutro(Neutral Red)
O ensaio de captação do vermelho neutro é baseado na capacidade das células viáveis de incorporar e reter o corante no interior dos lisossomos possibilitando a avaliação da integridade da membrana lisossomal e a diferenciação entre células viáveis e células mortas. A viabilidade celular é quantificada por espectrofotometria após a extração do corante acumulado no interior das células utilizando uma solução alcoólica acidificada, sendo a quantidade de corante incorporado diretamente proporcional à quantidade de células viáveis
Sua captação depende da capacidade da célula de manter gradientes de pH, por meio da produção de ATP. Em pH fisiológico, o VN é fracamente catiônico e entra nas células por meio de difusão passiva
Compostos citotóxicos podem causar alterações na superfície das células ou na membrana lisossomal, resultando em uma diminuição na captação e retenção do vermelho neutro.
Células cancerígenas, possuem uma absorção diferenciada de vermelho neutro em comparação com células normais, o que possibilita uma distinção entre elas
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Vermelho neutro(Neutral Red)
Limitações
Incompatibilidade com substâncias insolúveis e instáveis
Pode subestimar toxicidade de substâncias séricas
Compostos vermelhos ou com absorção na faixa de 540 nm
Indução da precipitação do corante vermelho neutro em cristais visíveis em forma de agulha por alguns produtos químicos, o que afecta a precisão das leituras de absorbância utilizadas para detectar a presença do corante.
Agentes que afetam o número de lisossomos podem fornecer leituras que não refletem o número ou a viabilidade celular.
Ensaio MTT
O ensaio de redução do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) é um ensaio colorimétrico que mede indiretamente a citotoxicidade, proliferação ou viabilidade celular.
Por ter uma carga residual positiva, essa molécula é permeável às membranas celulares, no interior das células viáveis, o MTT é reduzido aos cristais de formazan, de cor púrpura, insolúveis em água, após clivagem do anel tetrazólio mediada por enzimas, tais como as desidrogenases mitocondriais
A metabolização do MTT é indicativa de uma cultura de células viva e ativa, o que permite medir a citotoxicidade de outros compostos aos quais uma cultura foi exposta a partir do produto resultante
Desvantagens
Diminuição na produção de formazan mesmo em células viáveis, após modificação da composição do meio de cultura, como por diminuição na concentração de D-glicose, NADH ou NADPH. 
Além disso, tem sido observado que células em estágios iniciais de apoptose com a atividade mitocondrial intacta reduzem o MTT ao formazan, o que pode interferir na legitimidade dos resultados
Iodeto de propídio
O iodeto de propídeo é uma molécula fluorescente que permite avaliar a viabilidade a partir do princípio da integridade da membrana celular. Ele é excluído ao entrar em contato com a membrana plasmática intacta de células viáveis. Em contrapartida, transpõe a membrana rompida de células não viáveis ou em processo de morte celular, intercalando em seus ácidos nucleicos e emitindo alta fluorescência, o que permite distinguir seletivamente as células mortas.
A fluorescência emitidaé avaliada por meio de diferentes técnicas, tais como microscopia de epifluorescência, microscopia confocal de varredura a laser, espectrofluorimetria ou por citometria de fluxo.
O IP pode ser utilizado em associação com outros fluorocromos, o que permite mensurar parâmetros adicionais em uma população celular além da viabilidade celular, tais como a diferenciação entre os diferentes estágios da apoptose, um tipo de morte celular.
Devido à propriedade de interagir com ácidos nucleicos o IP também é aplicado em análises do ciclo celular, permitindo diferenciar as fases do ciclo a partir da correlação entre a intensidade de fluorescência celular com a quantificação do conteúdo de DNA
Citometro
Ensaio clonogênico
Ensaio de formação de colônias, permite analisar a viabilidade reprodutiva de células em colônias com mais de 50 células. A coloração das células se dá através do cristal violeta.
Exercício 1
As nanopartículas têm recebido muita atenção recentemente devido ao seu uso na terapia do câncer. Estudos demonstraram que diferentes nanopartículas metalicas induzem citotoxicidade em células cancerígenas, mas não em células normais. Em alguns casos, foi demonstrado que tal atividade anticâncer é válida para a nanopartícula sozinha ou em combinação com diferentes terapias, como radioterapia ou alguns medicamentos anticâncer. Foi demonstrado que as nanopartículas têm essa atividade sozinhas ou quando carregadas com um medicamento anticancerígeno, como a doxorrubicina. O mecanismo antitumoral poderia funcionar através da geração de espécies reativas de oxigênio ou apoptose e necrose, entre outras possibilidades.
Desenhe um estudo de viabilidade das nanopartículas em uma linhagem de câncer a sua escolha, respondendo:
	Qual linhagem escolhida e por quê?
	Qual tipo de nanopartícula?
	Quais os ensaios de viabilidade vão ser utilizados e quais as vantagens e desvantagens destes testes? Para testar a toxicidade das nanopartículas isoladas e com radioterapia utilizaria os mesmos testes?
	Se a potencialização das nanopartículas fosse por um radiomimético como bleomicina ou zeocina invés de radioterapia, teria o mesmo efeito citotóxico e haveria mudanças no desenho experimental tendo que aplicar outros testes de viabilidade? Se sim quais e por quê? 
	Para se ter uma compreensão maior dos efeitos toxicológicos das nanopartículas quais outros testes teriam quer realizados além da viabilidade?
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