Preparo e Diferenciação de Meios (2)

Prévia do material em texto

Microbiologia e Micologia Básica
Prof. Dr. Rafael Salgado
TREY
research
Preparo e 
Diferenciação de 
Meios de Cultura
Aula 6
2
TREY
research
Meios de Cultura
Definição e composição
3
Técnicas de cultivo: necessidade de 
identificação e isolamento de bactérias em 
áreas como microbiologia médica, 
microbiologia de alimentos e de água. 
O meio de cultura é um material rico em 
nutrientes elaborado para possibilitar o 
crescimento de microrganismos em 
laboratório. Basicamente, o meio deve 
reproduzir as condições ambientais e o 
espectro de nutrientes exigidos pela bactéria 
que necessita ser cultivada. 
O meio de cultura deve ser estéril até o momento da inoculação da amostra (inserção no meio 
de cultivo), para garantir que a população encontrada esteja relacionada exclusivamente ao 
inóculo (microrganismos de interesse adicionados ao meio). A cultura são os microrganismos 
que crescem e se multiplicam no interior ou sobre um meio de cultura.
TREY
research
Meios de Cultura
Estados físicos
4
A consistência do meio é 
moderada pela presença de 
agentes solidificantes, como o 
ágar, um polissacarídeo complexo 
procedente de algas marinhas. 
O ágar é um composto 
extremamente vantajoso para a 
microbiologia: poucos 
microrganismos podem degradá-
lo e ele possui uma ótima 
tolerância a variação de 
temperatura, mantendo-se 
solidificado.
Líquido
Crescimento 
bacteriano
Turvação do 
meio
-
Semissólido
Testes de 
motilidade
Zona de 
crescimento
Ágar 0,5%
Sólido
Isolamento e 
identificação
Crescimento 
(colônias)
Ágar 1,5-2,0%
TREY
research
Meios de Cultura
Estados físicos
5
Líquido
TREY
research
Meios de Cultura
Estados físicos
6
Semissólido
TREY
research
Meios de Cultura
Estados físicos
7
Sólido
TREY
research
Meios de Cultura
Estados físicos
8
Líquido Semissólido Sólido
Exigências
O meio de cultura deve fornecer uma fonte de energia, assim como fontes de 
carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo e quaisquer outros fatores orgânicos de 
crescimento que o microrganismo seja incapaz de sintetizar. 
TREY
research
Meios de Cultura
Classificações
9
Quando o meio possui sua 
composição exata conhecida, é 
chamado de meio quimicamente 
definido, geralmente utilizado 
para o crescimento de bactérias 
autotróficas. 
Meio de cultura definido
Carbono e 
energia
Glicose, 25 g
Sais NH4Cl, 3 g / MgSO4, 0,1 g
Aminoácidos Alanina, triptofano, arginina / 100 a 200 ug
Purinas e 
pirimidinas
Adenina, guanina, uracila / 10 mg
Vitaminas Biotina, folato, riboflavina / 0,01 a 1 mg
Elementos traços Fe, Co, Mn, Zn, Cu / 2 a 10 ug
Tampão, pH 7 Acetato de sódio, 25g
Água destilada 1.000 ml
Meio de cultura definido
Glicose 5 g
Fosfato de amônio 1 g
Cloreto de sódio 5 g
Sulfato de magnésio 0,2 g
Fosfato de potássio 1 g
Água 1 litro
TREY
research
Meios de Cultura
Classificações
10
A maioria das bactérias e fungos é 
comumente cultivada em meios complexos
que são compostos por nutrientes obtidos 
de extratos de carnes, leveduras, plantas 
ou produtos da assimilação de proteínas 
destas ou outras fontes. 
A fonte de energia é associada a inclusão 
de proteínas parcialmente digerida 
(peptonas, fragmentos pequenos e 
solúveis) e a necessidade de vitaminas, sais 
minerais e outros compostos é suprida 
pelos extratos. A composição química 
exata dos meios complexos pode variar de 
acordo com o lote fabricado. 
Meio de cultura complexo
Ágar nutriente
Peptona 5 g
Extrato de carne 3 g
Cloreto de sódio 8 g
Ágar 15 g
Água 1 litro
As espécies bacterianas podem apresentam 
exigências distintas e aquelas que necessitam 
de muitos fatores de crescimento são 
conhecidas como fastidiosas.
TREY
research
Meios de Cultura
Classificações
11
A cultura de bactérias anaeróbias 
apresenta um desafio: não 
tolerar a presença de oxigênio, 
portanto são utilizados meios 
especiais, os meios redutores. 
Esses meios possuem compostos 
que se fixam ao oxigênio 
dissolvido e o eliminam do meio 
de cultura, e os tubos devem ser 
firmemente tampados. Na 
utilização da placa de Petri, a 
incubação pode ser feita em 
jarras seladas que removem 
quimicamente o oxigênio ou em 
uma câmara anaeróbia. 
TREY
research
Meios de Cultura
Classificações
12
Para a identificação de bactérias de interesse 
clínico são utilizados meios seletivos e 
diferenciais. Os meios seletivos favorecem o 
crescimento de microrganismos alvo enquanto 
impedem o crescimento de espécies 
bacterianas indesejadas. 
Por exemplo, para a identificação de Salmonella 
typhi, enterobactéria Gram-negativa, utiliza-se o 
ágar sulfito de bismuto que inibe o crescimento 
de bactérias Gram-positivas e a maioria das 
outras bactérias intestinais Gram-negativas. 
O ágar Saboraud dextrose possui pH de 5,6, 
privilegiando o crescimento de fungos às 
bactérias. 
Os meios seletivos podem ser enriquecidos, a estratégia é 
baseada em uma série de transferências e incubações no meio 
enriquecido para eliminar as bactérias de não interesse e 
potencializar o crescimento da bactéria alvo. 
TREY
research
Meios de Cultura
Classificações
13
Os meios diferenciais proporcionam a 
diferenciação das colônias de diversos 
microrganismos presentes em uma 
mesma amostra. O ágar sangue 
possibilita o crescimento da grande 
maioria das bactérias, porém a presença 
de hemácias em sua composição confere 
a capacidade de observar a ação de 
espécies bacterianas capazes de induzir 
hemólise (lise de hemácias).
Como o Streptococcus pyogenes, bactéria 
causadora da faringite estreptocócica; é 
possível observar um halo claro ao redor 
das colônias (região de hemólise).
TREY
research
Meios de Cultura
Classificações
14
A combinação de características seletivas e diferenciais
no mesmo meio são interessantes, uma das estratégias 
para isolar Staphylococcus aureus (bactéria encontrada 
no trato nasal e comumente associada a infecções 
cutâneas contendo abcessos) é utilizar o ágar 
hipertônico manitol que contém 7,5% de cloreto de 
sódio, selecionando as bactérias que toleram tais 
concentrações como o S. aureus.
Além disso, esse ágar possui um indicador de pH: caso o 
manitol seja fermentado à ácido, o meio altera de cor, 
outra característica de S. aureus, diferenciando das 
colônias não fermentadoras de manitol. As bactérias que 
crescem em alta concentração de sal e fermentam o 
manitol são facilmente identificadas pela coloração e 
provavelmente são colônias de S. aureus. 
TREY
research
Meios de Cultura
Classificações
15
Tipo Finalidade
Quimicamente definido Crescimento de quimioautotróficos e fotoautotróficos; 
ensaios microbiológicos
Complexo Crescimento da maioria dos organismos quimio-
heterotróficos
Redutor Crescimento de anaeróbios obrigatórios
Seletivo Supressão de microrganismos indesejados; 
favorecimento dos microrganismos de interesse
Diferencial Diferenciação das colônias dos microrganismos de 
interesse em relação aos outros
Enriquecimento Similar ao meio seletivo, mas elaborado para aumentar o 
número de microrganismos de interesse até níveis 
detectáveis
TREY
research
Cultura em meio sólido
Isolamento
16
A prática de isolamento mais 
utilizada é método do 
esgotamento em placa. No 
procedimento, uma alça 
bacteriológica (ou similar) estéril é 
mergulhada dentro de uma cultura 
mista com a amostra devidamente 
processada e geralmente mantida 
em meio líquido.
O material é semeado em estrias 
na superfície do meio de cultura, o 
rompimento do ágar deve ser 
evitado para não favorecer o 
crescimento em profundidade. 
Para obter colônias bem isoladas, as estrias são feitas em 3 séries 
dispostas em pontos diferentes da placa, sem sobreposição entre si 
e todas provenientes do primeiro inóculo contido na alça. Dessa 
maneira, as bactérias depositadas ao longo da terceira série de 
estrias estarão em menor número e mais afastadas, criando colônias 
puras e bem representadas. 
TREY
research
Medida direta do crescimento microbiano
Escala de Mc Farland
17
A quantificação de uma populaçãobacteriana é baseada em contagens 
diretas ou indiretas de uma amostra 
limitada, que são ajustadas 
matematicamente e número total de 
bactérias é extrapolado. A 
intensidade de multiplicação em 
meios de cultura líquidos pode ser 
determinada pela utilização da escala 
de McFarland, referência padrão dos 
níveis de turvação do meio e número 
total de bactérias correspondentes. 
Quanto maior a concentração de 
bactérias, maior oposição à 
passagem de luz, amplificando a 
turvação e a opacificação do meio.
Solução de 
sulfato de 
bário
TREY
research
Medida direta do crescimento microbiano
Contagem em placas
18
As bactérias regularmente 
crescem vinculadas em 
agregados ou cadeias, para 
retratar essa circunstância, 
as contagens em placas são 
referidas como unidades 
formadores de colônia 
(UFCs) por grama ou mililitro 
da amostra. 
A recomendação é que a 
contagem seja realizada em 
placas que contenham 25 a 
250 colônias e para garantir 
essa condição, o inóculo 
inicial pode ser diluído.
TREY
research
Medida direta do crescimento microbiano
Cultura em meio sólido
19
As características das colônias isoladas 
podem indicar o crescimento de 
determinada espécie e a mesma pode 
ser semeada em outro meio nutriente 
para obtenção de culturas puras. No 
método quantitativo, as estrias são 
feitas de maneira contínua por toda a 
extensão da placa e possui o objetivo de 
contagem das UFCs.
O crescimento em placa pode ser obtido 
pelos métodos de espalhamento em 
placas (spread plate) ou incorporação 
em placas (pour plate). O meio de 
cultura nutritivo (contendo ágar) é 
mantido líquido por aquecimento em 
banho-maria a 50ºC.
TREY
research
Medida direta do crescimento microbiano
Contagem em placas
20
No método de espalhamento em placas 
(spread plate), o meio de cultura é adicionado a 
placa e previamente solidificado. 
Posteriormente, 0,1 mL do inóculo é espalhado 
de modo uniforme à superfície do meio com o 
auxílio de um bastão de vidro ou alça 
bacteriológica (comumente de metal), ambos 
esterilizados, e a placa é incubada. 
Essa técnica permite observar o aspecto 
diversificado das colônias, informação 
relevante para o diagnóstico microbiológico; 
além de evitar o contato entre a amostra e o 
ágar fundido, que podem causar danos a 
alguns microrganismos. 
TREY
research
Medida direta do crescimento microbiano
Contagem em placas
21
Na técnica de incorporação em placas 
(pour plate), um mililitro ou 0,1 mL do 
inóculo é incluindo na placa e incorporado 
com o ágar ainda fundido. 
A placa é sutilmente agitada de maneira 
circular para homogeneização do material. 
O ágar solidifica e a placa é incubada, desta 
maneira as colônias crescerão em 
profundidade (e na superfície) do meio. 
O método de pour plate é utilizado para o 
crescimento de anaeróbios (adição de 
outras camadas de meio) e em análise 
microbiológica de alimentos. 
TREY
research
Medida direta do crescimento microbiano
Número mais provável
22
O método NMP é uma estratégia 
estatística que fornece a estimativa 
de uma população bacteriana se 
encontrar dentro de uma faixa 
quantitativa determinada e qual o 
seu número mais provável. O 
princípio é avaliar a positividade de 
crescimento bacteriano em diluições 
subsequentes, ou seja, quanto maior 
for o número de bactérias em uma 
amostra, maior será o total de 
diluições requeridas para diminuir a 
densidade até que não haja 
nenhuma bactéria nos tubos. 
O teste apresenta confiabilidade de 
95% na indicação da faixa.
TREY
research
Medida direta do crescimento microbiano
Número mais provável
23
TREY
research
Medida direta do crescimento microbiano
Filtração
24
Quando a quantidade de 
bactérias é muito pequena, as 
bactérias podem ser contadas 
pelo método de filtração.
Nesta técnica, pelo menos 100 
mL de água são passados por um 
filtro de membrana fino, cujos 
poros são muito pequenos para 
permitirem a passagem de 
bactérias. E com a transferência 
posterior do filtro para uma 
placa de Petri contendo meio 
nutritivo, as colônias das 
bactérias se desenvolvem.
Esse método é aplicado frequentemente para a detecção e 
enumeração de bactérias coliformes, que são indicadores de 
contaminação em alimentos ou água.
TREY
research
Medida direta do crescimento microbiano
Contagem microscópica direta
25
Medida direta do crescimento microbiano
Frequentemente utilizado 
para contar o número de 
bactérias no leite.
Desvantagens:
Bactérias móveis
Células mortas
Concentração elevada por ml
Vantagens:
Não necessita de tempo de 
incubação
Contadores de células 
eletrônicos (laboratórios de 
pesquisa e hospitais).
TREY
research
Medida indireta do crescimento microbiano
Turbidimetria
26
Monitoramento do crescimento 
bacteriano.
A quantidade de luz que chega ao 
detector fotossensível no 
espectrofotômetro é inversamente 
proporcional ao número de bactérias 
sob condições padronizadas. Quanto 
menos luz é transmitida, mais bactérias 
estão presentes na amostra.
A turbidez da amostra pode ser 
expressa na forma de 20% de 
transmissão ou 0,7 de absorbância. As 
leituras de absorbância têm base 
logarítmica e são úteis para confecção 
de gráficos.
TREY
research
Conservação das culturas bacterianas
Estratégias
27
Ao decorrer do 
crescimento bacteriano 
em cultura é comum a 
redução na 
disponibilidade de 
nutrientes, redução de 
trocas gasosas, 
alterações de 
temperatura e 
disponibilidade de 
água. 
Os métodos de 
conservação podem ser 
de curto, médio ou 
longo prazo.
Curto 
Prazo
Repique contínuo
Transferência para 
novo meio
Particular de cada 
espécie
Médio 
Prazo
Redução do 
metabolismo
Óleo mineral (limita 
oxigênio)
Congelamento 
(-4º a -20ºC)
Longo 
Prazo
Liofilização
Ultracongelamento
Melhor preservação
TREY
research
Obrigado
Rafael Salgado
rafael.salgado@docente.unip.br
Universidade Paulista
28