teorico iv

Prévia do material em texto

<p>Fundamentos de</p><p>Biologia Molecular</p><p>e Biotecnologia</p><p>Material Teórico</p><p>Responsável pelo Conteúdo:</p><p>Prof. Dr. Bruno Cavalheiro Araujo</p><p>Revisão Textual:</p><p>Prof. Ms. Luciano Vieira Francisco</p><p>Ferramentas Moleculares Básicas da Biotecnologia</p><p>• Visão Geral da Biotecnologia</p><p>• Marcadores Moleculares</p><p>• Genômica Funcional</p><p>• Engenharia Genética</p><p>· Proporcionar aos alunos uma visão geral sobre as principais ferra-</p><p>mentas moleculares utilizadas na Biotecnologia moderna, com ênfa-</p><p>se nos marcadores moleculares, na genômica funcional e na Enge-</p><p>nharia Genética.</p><p>OBJETIVO DE APRENDIZADO</p><p>Ferramentas Moleculares</p><p>Básicas da Biotecnologia</p><p>Orientações de estudo</p><p>Para que o conteúdo desta Disciplina seja bem</p><p>aproveitado e haja uma maior aplicabilidade na sua</p><p>formação acadêmica e atuação profissional, siga</p><p>algumas recomendações básicas:</p><p>Assim:</p><p>Organize seus estudos de maneira que passem a fazer parte</p><p>da sua rotina. Por exemplo, você poderá determinar um dia e</p><p>horário fixos como o seu “momento do estudo”.</p><p>Procure se alimentar e se hidratar quando for estudar, lembre-se de que uma</p><p>alimentação saudável pode proporcionar melhor aproveitamento do estudo.</p><p>No material de cada Unidade, há leituras indicadas. Entre elas: artigos científicos, livros, vídeos e</p><p>sites para aprofundar os conhecimentos adquiridos ao longo da Unidade. Além disso, você também</p><p>encontrará sugestões de conteúdo extra no item Material Complementar, que ampliarão sua</p><p>interpretação e auxiliarão no pleno entendimento dos temas abordados.</p><p>Após o contato com o conteúdo proposto, participe dos debates mediados em fóruns de discussão,</p><p>pois irão auxiliar a verificar o quanto você absorveu de conhecimento, além de propiciar o contato</p><p>com seus colegas e tutores, o que se apresenta como rico espaço de troca de ideias e aprendizagem.</p><p>Organize seus estudos de maneira que passem a fazer parte</p><p>Mantenha o foco!</p><p>Evite se distrair com</p><p>as redes sociais.</p><p>Mantenha o foco!</p><p>Evite se distrair com</p><p>as redes sociais.</p><p>Determine um</p><p>horário fixo</p><p>para estudar.</p><p>Aproveite as</p><p>indicações</p><p>de Material</p><p>Complementar.</p><p>Procure se alimentar e se hidratar quando for estudar, lembre-se de que uma</p><p>Não se esqueça</p><p>de se alimentar</p><p>e se manter</p><p>hidratado.</p><p>Aproveite as</p><p>Conserve seu</p><p>material e local de</p><p>estudos sempre</p><p>organizados.</p><p>Procure manter</p><p>contato com seus</p><p>colegas e tutores</p><p>para trocar ideias!</p><p>Isso amplia a</p><p>aprendizagem.</p><p>Seja original!</p><p>Nunca plagie</p><p>trabalhos.</p><p>UNIDADE Ferramentas Moleculares Básicas da Biotecnologia</p><p>Contextualização</p><p>Considerada uma das disciplinas mais importantes na área da Biologia,</p><p>principalmente pela sua aplicabilidade em diversos segmentos sociais, tais</p><p>como agricultura, pecuária e saúde, Fundamentos da Biologia Molecular e</p><p>Biotecnologia tem como objetivo principal fornecer uma visão global de como</p><p>podemos utilizar diversas ferramentas moleculares para solucionar problemas reais</p><p>da sociedade moderna, além de buscar otimizar diversos processos relacionados</p><p>com estes e muitos outros segmentos.</p><p>Assim, nesta Unidade abordaremos as principais ferramentas moleculares e suas</p><p>aplicações na Biotecnologia.</p><p>Perceba que este tema é fundamental para maior compreensão de processos</p><p>tecnológicos recentes, tais como o sequenciamento de DNA, marcadores molecu-</p><p>lares e Engenharia Genética.</p><p>8</p><p>9</p><p>Visão Geral da Biotecnologia</p><p>A Biotecnologia é uma Ciência multidisciplinar, que abrange inúmeras áreas do</p><p>conhecimento e pode ser definida como: “A atividade que utiliza agentes biológicos</p><p>no desenvolvimento e melhoria de produtos úteis para a sociedade”. Diversas</p><p>técnicas biotecnologias são empregadas desde a Antiguidade, principalmente em</p><p>processos de fermentação de alimentos como o vinho, a cerveja e o pão.</p><p>Alinhada a outras áreas correlatas, como a Biologia Molecular, Microbiologia,</p><p>Biotecnologia e Engenharia Genética, deu-se início à Biotecnologia moderna, tendo</p><p>seu marco na descoberta da estrutura em dupla hélice do Ácido Desoxirribonucleico</p><p>(DNA), por James Watson e Francis Crick, no ano de 1953. A descoberta da</p><p>estrutura do DNA foi essencial para desvendar processos fundamentais para o</p><p>funcionamento da vida como, por exemplo, a síntese de proteínas.</p><p>Biologia</p><p>Biotecnologia</p><p>Engenharia QuímicaQuímica</p><p>Industrial</p><p>Engenharia</p><p>Bioquímica</p><p>Bio</p><p>qu</p><p>ím</p><p>ica</p><p>Bio</p><p>log</p><p>ia</p><p>Mo</p><p>lec</p><p>ula</p><p>r</p><p>Figura 1 – Esquematização da interação da Biotecnologia com outras Ciências correlatas</p><p>Fonte: Borzani et al., 2001</p><p>Com a evolução da Biotecnologia moderna, devido à descoberta de novos</p><p>produtos e tecnologias e ao desenvolvimento de novas técnicas, praticamente</p><p>todos os setores produtivos da sociedade sofreram intervenções biotecnologicas,</p><p>atraindo um grande investimento para a área e, consequentemente, gerando</p><p>elevado número de empregos diretos. Nos dias atuais, os produtos originados por</p><p>processos biotecnológicos são incontáveis (Figura 2) e entre os principais setores</p><p>que utilizam esses processos estão agricultura, alimentação, produção de energia,</p><p>meio ambiente, pecuária e saúde.</p><p>9</p><p>UNIDADE Ferramentas Moleculares Básicas da Biotecnologia</p><p>Figura 2 – Produtos gerados a partir de técnicas biotecnológicas</p><p>Fonte: Adaptado de Faleiro et al., 2011</p><p>Na última década, diversas técnicas moleculares tornaram-se mais acessíveis e são</p><p>aplicadas corriqueiramente na Biotecnologia, tais como o sequenciamento genômico</p><p>– importante, por exemplo, no tratamento de doenças genéticas –, indução de pluri-</p><p>potencialidade celular em células somáticas – células-tronco – e criação de alimentos</p><p>transgênicos. No entanto, esses processos são controversos, já que se confrontam</p><p>diretamente com outra Ciência correlata, a Bioética. Assim, abordaremos aqui a</p><p>aplicação de ferramentas moleculares em diferentes processos biotecnológicos.</p><p>Marcadores Moleculares</p><p>Os marcadores moleculares são marcadores genéticos que atuam na detecção</p><p>de isoenzimas – enzimas que diferem em sua composição estrutural, mas que, em</p><p>geral, sintetizam a mesma proteína –, ou sequências de DNA específicas (FALEIRO;</p><p>ANDRADE; REIS JUNIOR, 2011). Sua utilização pode ser aplicada em diversas</p><p>áreas do conhecimento, como em estudos evolutivos e de melhoramento genético</p><p>de animais e plantas.</p><p>A ação dos marcadores moleculares está sustentada no conceito do dogma</p><p>central da Biologia Molecular. Neste contexto, podemos inferir que as diferenças</p><p>na carga genética de diferentes indivíduos – mesmo sendo da mesma espécie –</p><p>sintetizarão proteínas específicas que, por consequência, influenciarão em suas</p><p>características fenotípicas; com isso, devido à sua carga genética, cada indivíduo</p><p>pode ser considerado único.</p><p>O conhecimento das características genéticas é considerado uma excelente fer-</p><p>ramenta na busca da compreensão da história de vida do organismo, além de gerar</p><p>informações singulares sobre variabilidade genética, auxiliando, por exemplo, em</p><p>projetos de conservação. O desenvolvimento dos diferentes marcadores molecula-</p><p>res se deu, principalmente, pela evolução e popularização de técnicas laboratoriais,</p><p>como a amplificação do DNA via Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), separa-</p><p>10</p><p>11</p><p>ção por eletroforese e análises genéticas. Pode parecer complexo – e, na verdade,</p><p>é –, no entanto, técnicas rotineiras aproximam cada dia mais a sociedade da utili-</p><p>zação de marcadores moleculares. Um exemplo clássico e corriqueiro corresponde</p><p>aos testes de paternidade – baseados na comparação do material genético dos</p><p>filhos e dos supostos pais –, muito difundidos na última década.</p><p>Tipos de Marcadores Moleculares</p><p>São muitos os tipos de marcadores moleculares, cada qual com uma especificidade.</p><p>Entre muitos, destacam-se:</p><p>• Sequenciamento por PCR – muito utilizado em estudos de taxonomia e aná-</p><p>lises filogenéticas, o sequenciamento do DNA pela técnica de PCR está rela-</p><p>cionado à determinação da sequência nucleotídica de um fragmento-alvo do</p><p>DNA através da utilização de primers específicos.</p><p>Importante!</p><p>Que os primers são segmentos de ácidos nucleicos, contendo de um a sessenta</p><p>nucleotí-</p><p>dios, normalmente? Essas sequências são sintetizadas quimicamente e são complemen-</p><p>tares à região do DNA que se deseja amplifi car.</p><p>Você Sabia?</p><p>Assista à animação apresentando o processo de PCR em: https://youtu.be/JYY8TLu3hjU</p><p>Ex</p><p>pl</p><p>or</p><p>• Genômica funcional – principalmente utilizado em técnicas de mapeamen-</p><p>to genético e em estudos de expressão gênica – expressão quantitativa de</p><p>um gene específico –, a genômica funcional é uma ferramenta recente e</p><p>de grande importância em terapias gênicas. Com a utilização deste tipo de</p><p>marcador molecular, torna-se possível detectar e rastrear mutações genéti-</p><p>cas – principalmente relacionadas a patologias –, facilitando a utilização de</p><p>estratégias específicas e preventivas em alguns tipos de doenças de cunho</p><p>genético, como o câncer. As duas principais abordagens deste tipo de mar-</p><p>cador estão relacionadas à análise da expressão gênica – transcriptoma, que</p><p>é a técnica que retrata de forma real o que é expresso em um indivíduo em</p><p>um momento ou condição específica; e a análise de sistemas modulados por</p><p>ação de proteínas (proteoma);</p><p>• Polimorfismo de um único nucleotídeo – do inglês Single Nucleotide Poly-</p><p>morphism (SNP), é uma técnica capaz de detectar a variação de apenas um</p><p>nucleotídio na sequência de um genoma. É empregada principalmente em</p><p>análises de diversidade funcional e estudos filogenéticos. Para a realização</p><p>deste tipo de análise são necessárias informações prévias, principalmente pro-</p><p>vindas de técnicas de sequenciamento, como o transcriptoma.</p><p>11</p><p>UNIDADE Ferramentas Moleculares Básicas da Biotecnologia</p><p>Marcadores Moleculares em Análises Genéticas</p><p>As análises genéticas podem ser aplicadas em muitos segmentos, já que possuem</p><p>alto grau de especificidade e número incontável de marcadores moleculares. Estudos</p><p>filogenéticos, por exemplo, são realizados através da comparação do material</p><p>gênico – por sequenciamento de PCR ou transcriptoma, por exemplo – entre</p><p>diferentes indivíduos, populações, espécies ou até mesmo gêneros, mantidos sob a</p><p>mesma condição, ou seja, sem influência de outras variáveis.</p><p>Por meio do sequenciamento de uma região específica do DNA, utilizando</p><p>marcadores e de seu alinhamento com outros indivíduos, pode-se caracterizar uma</p><p>árvore filogenética, por exemplo. Análises genéticas podem ser realizadas também</p><p>considerando respostas diferenciais em indivíduos distintos – em nível de espécie,</p><p>população e gêneros, por exemplo – a estímulos externos, como temperatura ou</p><p>fotoperíodo; no entanto, essas condições precisam, necessariamente, apresentarem-</p><p>se idênticas aos diferentes grupos comparados.</p><p>Bioinformática e Marcadores Moleculares</p><p>A análise de dados referente às respostas genéticas com utilização dos</p><p>marcadores moleculares tornou-se possível devido ao surgimento de uma nova</p><p>área do conhecimento, a Bioinformática. Podemos definir Bioinformática como a</p><p>área do conhecimento que utiliza ferramentas computacionais aplicadas a análises</p><p>de dados obtidos em pesquisas biológicas. Devido à elevada quantidade de dados</p><p>gerados por técnicas de sequenciamento de DNA e utilização de muitas fórmulas</p><p>estatísticas na análise dos resultados, tornou-se necessária a aplicação dessas</p><p>ferramentas, visando, principalmente, a redução de custos e de tempo.</p><p>A Bioinformática está em amplo crescimento e isso se dá devido à modernização</p><p>acelerada de técnicas moleculares, principalmente de sequencimento de DNA.</p><p>Com a evolução e barateamento dessas técnicas, muitos softwares específicos</p><p>utilizados em análises de dados de sequenciamento foram desenvolvidos nos</p><p>últimos anos, tornando essa área uma das mais promissoras dentro das grandes</p><p>áreas das Ciências Biológicas e da Saúde. Entre muitos resultados, a aplicação</p><p>da Bioinformática pode auxiliar na localização de genes específicos dentro de um</p><p>transcriptoma e na definição de primers para análises de PCR em tempo real –</p><p>quantificação da expressão de um determinado gene no momento da coleta do</p><p>material biológico.</p><p>Genômica Funcional</p><p>Como sabemos, o conjunto completo dos genes de um indivíduo é denominado</p><p>genoma. É o genoma quem definirá e modulará a síntese proteica e, consequen-</p><p>temente, influenciará no fenótipo de um determinado indivíduo. Essa informação</p><p>é codificada pela combinação da frequência e posição das bases nitrogenadas</p><p>12</p><p>13</p><p>Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) e Guanina (G), no momento da transcrição;</p><p>ou seja, apenas por influência dessas quatro bases nitrogenadas as características</p><p>fenotípicas são expressas diferencialmente nos indivíduos.</p><p>A genômica funcional pode ser definida como o campo da Biologia Molecular</p><p>que descreve a função dos genes e proteínas, podendo ser estudada em duas</p><p>etapas da síntese proteica (Figura 3). São duas as principais técnicas para o estudo</p><p>da genômica funcional: a transcriptômica e a proteômica. Aliadas a outras duas</p><p>técnicas importantes – a genômica e a metabolômica –, constituem uma subárea</p><p>denominada Ciências Ômicas.</p><p>Figura 3 – Os diferentes tipos possíveis de estudos das Ciências Ômicas, seguindo o fl uxo gênico, em nível de DNA</p><p>– genômica –, RNA – transcriptômica –, proteínas – proteômica – e metabólitos – metabolômica</p><p>Fonte: Adaptado de ciencia-explicada.com</p><p>Diferente das análises genéticas e genômicas, priorizadas em estudos</p><p>filogenéticos e populacionais, a genômica funcional analisa principalmente uma</p><p>condição fisiológica em nível celular, molecular ou bioquímico. De forma geral,</p><p>o genoma funcional é modificado por intervenções ambientais, por exemplo,</p><p>quando um indivíduo característico de uma região gelada é introduzido em uma</p><p>temperatura diferente – um pouco mais elevada –, diversos genes serão expressos,</p><p>influenciando na síntese de proteínas para favorecer sua aclimatação a esta nova</p><p>condição ambiental. Da mesma forma, o próprio organismo pode regular seu</p><p>genoma funcional, alterando, por algum motivo em especial, a expressão de um</p><p>determinado gene.</p><p>A realização de estudos de genômica funcional se dá principalmente por</p><p>comparação, seguindo três princípios básicos e de acordo com o objetivo do estudo:</p><p>• Estudos de comparação de sequências – neste tipo de estudo sempre será</p><p>considerada a ancestralidade. Sequências do DNA conservadas – semelhantes</p><p>entre espécies diferentes – tendem a codificar proteínas que agem de forma</p><p>similar. Com isso, através da localização do gene em outra espécie e com</p><p>a utilização de técnicas de Bioinformática, podemos localizar dentro de um</p><p>sequenciamento por similaridade o mesmo gene na espécie-alvo;</p><p>13</p><p>UNIDADE Ferramentas Moleculares Básicas da Biotecnologia</p><p>• Estudo comparativo de abundância – neste estudo será sempre considerada</p><p>uma resposta fisiológica frente a diferentes condições nutricionais ou do meio,</p><p>ou seja, indivíduos da mesma espécie são submetidos a diferentes condições,</p><p>como diferentes temperaturas e analisa-se a expressão gênica diferencial entre</p><p>os quais;</p><p>• Estudo comparativo do fenótipo – a realização deste tipo de estudo se dá</p><p>pela comparação entre indivíduos com e sem alterações genéticas – mutação.</p><p>Por meio de técnicas moleculares, torna-se possível a indução de mutação</p><p>em determinados genes e, utilizando esta estratégia, podemos comparar as</p><p>características fenotípicas influenciadas por esta mutação entre organismos</p><p>mutantes e não mutantes.</p><p>Transcriptômica</p><p>No processo de síntese de proteínas, especificamente na transcrição do</p><p>DNA, moléculas de RNA mensageiro (mRNA) são sintetizadas de acordo com a</p><p>informação genética contida na dupla hélice. Assim, a partir da caracterização do</p><p>mRNA podemos inferir o que é expresso pelo organismo. O principal método</p><p>empregado para caracterizar e quantificar o mRNA é o transcriptoma, que pode</p><p>ser definido, então, como o conjunto dos transcritos de um indivíduo – tecido ou</p><p>célula –, mediante influência de muitas variáveis, tais como temperatura, fase da</p><p>vida, idade, condição nutricional etc.</p><p>Proteômica</p><p>Com o avanço das técnicas de sequenciamento de DNA foi possível determinar</p><p>genomas completos de muitos organismos. Entretanto, apenas o perfil da expressão</p><p>gênica não é suficiente para esclarecer possíveis alterações fenotípicas. Assim,</p><p>como o próprio nome diz, a proteômica está relacionada ao estudo da dinâmica de</p><p>proteínas de um organismo, um tecido ou uma célula específica.</p><p>Por estudar a última etapa da síntese proteica, a proteômica pode ser considerada</p><p>a ferramenta mais adequada para análise e interpretação de resultados relacionados</p><p>a funções gênicas. Apesar de ser considerada complementar ao genoma, já que os</p><p>genes podem ser transcritos em RNA e o RNA traduzido em proteína, o resultado</p><p>de um proteoma não é categoricamente um reflexo da expressão gênica devido à</p><p>interferência de outros processos, como o processamento do mRNA e a tradução.</p><p>O estudo da proteômica é, em geral, muito dinâmico, já que as proteínas de uma</p><p>célula sofrem diversas alterações estruturais e bioquímicas em detrimento a diversas</p><p>variáveis, como fatores ambientais e nutricionais.</p><p>14</p><p>15</p><p>Metabolômica</p><p>Apesar de não ser considerada uma ferramenta da genômica funcional,</p><p>a metabolômica é essencial como estudo complementar à transcriptômica e</p><p>proteômica. É definida como o estudo que identifica e quantifica o conjunto de</p><p>metabólitos produzido por um organismo, fornecendo um panorama geral sobre</p><p>sua condição fisiológica.</p><p>Os metabólitos celulares são divididos em duas classes: primários e secundários.</p><p>Os metabólitos primários – normalmente caracterizados – são encontrados no</p><p>citoplasma celular e estão relacionados às principais rotas metabólicas. Entre os</p><p>mais estudados e de função essencial para a vida estão os aminoácidos, nucleotídeos,</p><p>lipídeos, carboidratos, entre outros. Os metabólitos secundários são, em geral,</p><p>específicos para um tipo celular ou tecido e entre os mais conhecidos e estudados</p><p>estão os alcaloides, taninos, favonoides, glicosídeos.</p><p>Os resultados provenientes de um metaboloma podem caracterizar e</p><p>quantificar os metabólitos primários, assim como os secundários. São incontáveis</p><p>as aplicações de um metaboloma. Na toxicologia, por exemplo, o metaboloma</p><p>permite verificar em uma amostra sanguínea ou de urina, alterações fisiológicas</p><p>do organismo, provocadas pela administração de produtos químicos. Esse tipo de</p><p>análise é fundamental também em projetos de genômica funcional, sendo possível</p><p>determinar fenótipos gerados a partir da manipulação genética de indivíduos, além</p><p>de caracterizar a composição tecidual frente a diversas variáveis.</p><p>Engenharia Genética</p><p>A Engenharia Genética é uma Ciência recente e caracterizada pela possibilidade</p><p>de manipulação do genoma de organismos vivos, tornando possível, através dessa</p><p>manipulação, até mesmo originar alterações fenotípicas. Algumas descobertas</p><p>foram essenciais para o surgimento da Engenharia Genética, entre as quais,</p><p>destacam-se a descoberta da estrutura do DNA, o código genético, a estrutura da</p><p>síntese proteica e a regulação gênica.</p><p>A Engenharia Genética é baseada, principalmente, na técnica de recombinação</p><p>do DNA, que consiste no corte e na inserção de fragmentos de DNA de uma região</p><p>para outra dentro do mesmo organismo, ou de um organismo para outro, pertencen-</p><p>tes ou não a mesma espécie. As técnicas de Engenharia Genética são de fundamen-</p><p>tal importância no estudo de genomas e podem ser aplicadas em muitos setores pro-</p><p>dutivos da sociedade, principalmente na agricultura e na produção de medicamentos.</p><p>Os primeiros trabalhos científicos de Engenharia Genética foram realizados</p><p>principalmente no Estado da Califórnia, Estados Unidos. No ano de 1972, na</p><p>Universidade de Stanford, Berg criou uma molécula mista de DNA através da</p><p>associação do material genético de dois microrganismos distintos. Dois eventos</p><p>importantes ocorreram nesse mesmo ano, na Califórnia, mais especificamente na</p><p>15</p><p>UNIDADE Ferramentas Moleculares Básicas da Biotecnologia</p><p>Universidade da Califórnia: Boyer conseguiu isolar uma classe de enzimas que</p><p>possuíam a capacidade de clivar o DNA em pequenas partes; enquanto Cohen,</p><p>um pesquisador especialista da Universidade de Stanford, conseguiu criar duas</p><p>variedades distintas de plasmídios – molécula de DNA secundária e circular de</p><p>uma bactéria –, sendo resistente à kanamicina – antibiótico comumente utilizado</p><p>naquela época – e outro resistente à tetraciclina. Foram realizados então dois</p><p>experimentos distintos: no primeiro, introduziram pequenos pedaços do plasmídio</p><p>resistente à tetraciclina no plasmídio resistente à kanamicina, e introduziram esse</p><p>plasmídio misto juntamente com enzimas de restrição – que agiam cortando o</p><p>plasmídio –, e uma enzima denominada ligase – que possui capacidade de unir os</p><p>fragmentos de DNA ao material genético do hospedeiro – em uma bactéria. Após</p><p>a montagem da bactéria mutante, os pesquisadores realizaram uma série de testes</p><p>e comprovaram que aquela bactéria era resistente a ambos os antibióticos. Já no</p><p>segundo experimento, utilizaram os mesmos princípios, no entanto, introduziram</p><p>a bactéria em uma espécie de sapo e, da mesma forma, realizaram os testes,</p><p>comprovando que o animal também era resistente a esses dois antibióticos. Com</p><p>os resultados, os pesquisadores conseguiram comprovar a funcionalidade de um</p><p>DNA-recombinante, mesmo em organismos taxonomicamente distantes. A Figura</p><p>4 ilustra o processo de montagem de um DNA recombinante:</p><p>União do</p><p>plasmídio</p><p>com o DNA</p><p>a ser clonado</p><p>Corte do DNA a</p><p>ser clonado com</p><p>a mesma enzima</p><p>de restrição</p><p>LigaseLigase</p><p>Nucleóide</p><p>Bactéria hospedeira</p><p>com DNA recombinante</p><p>Multiplicação dos plasmídios</p><p>recombinantes e divisão da bactéria</p><p>DNA recombinante</p><p>(plasmídio + DNA</p><p>a ser clonado)</p><p>Introdução do DNA</p><p>recombinante na</p><p>bactéria hospedeira</p><p>Corte do plasmídio</p><p>por enzima de restrição</p><p>Figura 4 – Representação da tecnologia do DNA recombinante. O DNA e o</p><p>plasmídio são cortados por uma enzima de restrição e os fragmentos originados</p><p>desse cortesão incorporados em um plasmídio pela ação da enzima ligase</p><p>Fonte: Adaptado de dialogoscciencia.com</p><p>16</p><p>17</p><p>Assista à animação do processo de montagem de um DNA recombinante, disponível em:</p><p>https://youtu.be/PmM6jQ2wl5A</p><p>Ex</p><p>pl</p><p>or</p><p>Apesar de o potencial das técnicas de recombinação de DNA para a melhoria</p><p>de diversos processos produtivos, esse tipo de tecnologia apresenta vários riscos à</p><p>sociedade, já que se torna possível a criação de organismos resistentes, tornando</p><p>possível, por exemplo, criar uma bactéria que desenvolva algum tipo de patologia</p><p>em humanos, sendo essa bactéria resistente aos nossos atuais antibióticos. Com</p><p>isso, no ano de 1975 foi realizada uma conferência no mesmo Estado da Califórnia</p><p>– Conferência de Asilomar –, com o intuito de delimitar uma série de experimentos,</p><p>sendo que nesse evento ainda foram criadas diretrizes e uma classificação de risco</p><p>para experiências utilizando DNA recombinante. No ano seguinte, um comitê</p><p>norte-americano redigiu um documento oficial com as normas de trabalho com o</p><p>DNA-recombinante.</p><p>Bibliotecas de DNA</p><p>Após a Conferência de 1975, com as regras e diretrizes formuladas, a</p><p>Engenharia Genética, aliada a outras áreas do conhecimento, como a Biologia</p><p>Celular e Molecular, sofreu grande expansão mundial. O desenvolvimento de novas</p><p>tecnologias permitiu a realização de coisas que antes pareciam impossíveis, como</p><p>a popularização do sequenciamento genético.</p><p>Entre as principais limitações do trabalho de sequenciamento estão a quantidade</p><p>massiva de informação contida no genoma e a inabilidade de lidar com esse volume</p><p>de dados. Devido a isso, muitas pesquisas objetivaram inicialmente a desenvolvi-</p><p>mento de técnicas e a criação de novas ferramentas que permitissem lidar com esse</p><p>volume de dados, sendo o principal objetivo a criação de bibliotecas de DNA.</p><p>A montagem de uma biblioteca é o primeiro passo para o sequenciamento do</p><p>DNA e consiste da remoção das regiões não codificantes da dupla hélice, formando</p><p>moléculas contendo apenas as regiões com potencial para sintetizar proteínas.</p><p>Com o RNA mensageiro (mRNA)</p><p>codificante e através da ação de uma enzima</p><p>denominada transcriptase reversa, é formada uma molécula denominada DNA</p><p>complementar (cDNA), constituída do mRNA e de uma fita complementar da</p><p>sequência desse RNA. Tal cDNA, então, é inserido em um plasmídio que, por</p><p>sua vez, é inserido em uma bactéria que é mantida em um meio adequado para</p><p>seu crescimento. Com o crescimento da colônia de bactérias, aumenta também o</p><p>número do mRNA inserido – no formato de cDNA – no plasmídio, de modo que</p><p>esse material é extraído por uma série de técnicas laboratoriais e, em seguida, o</p><p>material é sequenciado. Com o sequenciamento em mãos, é realizada uma série de</p><p>análises, principalmente de Bioinformática e estatísticas para a caracterização do</p><p>genoma. Posteriormente, a informação da biblioteca é armazenada em bancos de</p><p>dados próprios e disponibilizadas ou não em bancos de dados públicos.</p><p>17</p><p>UNIDADE Ferramentas Moleculares Básicas da Biotecnologia</p><p>Construção de Organismos Recombinantes</p><p>O principal objetivo da construção de um organismo recombinante, ou seja,</p><p>da transferência de um gene de um organismo para outro, está no potencial do</p><p>hospedeiro em multiplicar em larga escala um metabólito específico em condições</p><p>laboratorias. Esse mecanismo parece irrelevante, mas uma série de fármacos</p><p>importantes, como a insulina, é sintetizada a partir desse tipo de tecnologia. A</p><p>construção de um organismo recombinante exige três etapas fundamentais:</p><p>• Localização do gene-alvo – a localização do gene-alvo é a primeira eta-</p><p>pa no processo de construção de um organismo recombinante. Devido ao</p><p>tamanho do genoma, a localização de um gene específico é extremamente</p><p>complexa. No entanto, muitas estratégias podem ser adotadas para facilitar</p><p>este trabalho. Entre as mais utilizadas estão a extração do mRNA – sendo</p><p>esta a molécula de interesse, pois carrega apenas a informação genética co-</p><p>dificante – e a formação de bibliotecas de cDNA. Novas técnicas de sequen-</p><p>ciamento, como transcriptoma, técnicas comparativas de Bioinformática e</p><p>disponibilidade de sequências gênicas em domínios públicos – acessíveis à</p><p>comunidade científica –, são também utilizadas com frequência, facilitando a</p><p>localização de genes de interesse;</p><p>• Criação do cassete de expressão e insersão do gene (clonagem) – uma</p><p>vez localizado, o gene-alvo precisa passar por uma série de modificações</p><p>mediadas por enzimas de restrição e pela enzima ligase, a fim de originar o</p><p>cassete de expressão. Como vimos, as enzimas de restrição clivarão o DNA</p><p>do plasmídio e da célula hospederia em locais específicos. Posteriormente, a</p><p>enzima ligase agregará o fragmento do plasmídio ao DNA da célula hospedeira</p><p>pela complementaridade de suas bases e criação de pontes de hidrogênio para</p><p>criar um DNA recombinante. Antes de ser utilizado no próximo processo</p><p>– transformação –, esse DNA recombinante precisa ser introduzido em um</p><p>organismo vetor para que se multiplique, ou seja, para que seja clonado. Na</p><p>maioria dos casos, devido ao amplo conhecimento de seu ciclo de vida, utiliza-</p><p>se a bactéria Escherichia coli como vetor, no entanto, esse organismo não é</p><p>ideal para expressar genes eucarióticos, devido às diferenças no processo de</p><p>síntese proteica entre eucariotos e procariotos. Com isso, para experimentos</p><p>utilizando células eucarióticas, na maioria dos casos utiliza-se a levedura</p><p>Saccharomyces cerevisae, sendo este um organismo eucarioto e de fácil cultivo</p><p>em laboratório;</p><p>• Transformação do gene – o processo de entrada do vetor – contendo o plasmídio</p><p>recombinado – no interior do hospedeiro é denominado transformação. Para</p><p>que este processo ocorra, a célula hospedeira, necessariamente, deve estar em</p><p>um meio com condições fisiológicas adequadas, de modo que tais condições</p><p>sejam recriadas em laboratório. Muitas técnicas de transformação são</p><p>possíveis, dependendo do tipo celular em questão, no entanto, a técnica mais</p><p>empregada se dá através da aplicação de forças elétricas que dilatam os poros</p><p>das membranas celulares, facilitando a passagem do plasmídio modificado</p><p>18</p><p>19</p><p>para o interior celular. Na maioria dos casos, o plasmídio introduzido no</p><p>hospedeiro carrega um marcador para que possam ser selecionados apenas os</p><p>hospedeiros infectados, por exemplo, então insere-se um gene ao plasmídio</p><p>que possui resistência a um determinado antibiótico, de modo que esse</p><p>plasmídio é inserido em um vetor e prepara-se um meio de crescimento para</p><p>esse vetor contendo o antibiótico em questão; isso induzirá ao crescimento</p><p>apenas dos organismos contendo o gene resistente ao antibiótico.</p><p>Transferência Gênica em Células Vegetais e Animais</p><p>O principal objetivo da transferência de genes específicos em espécies vegetais</p><p>está relacionado a processos de melhoramento genético, em especial para espécies</p><p>de interesse comercial, seja voltado à alimentação ou à produção de fármacos. A</p><p>Engenharia Genética tem auxiliado, por exemplo, na produção de vegetais contendo</p><p>genes resistentes a pesticídas e tolerância a pragas, aumentando significativamente</p><p>o setor produtivo. Entre os principais vegetais transgênicos produzidos, estão o</p><p>milho, a soja, o algodão e a canola, sendo o Brasil um dos maiores produtores</p><p>mundiais de plantas transgênicas.</p><p>Os experimentos relacionados a processos de transgenia em animais</p><p>foram iniciados no começo da década de 1970 e visavam, principalmente, o</p><p>desenvolvimento de fármacos no combate a alguns tipos de câncer. O primeiro</p><p>animal transgênico foi obtido no ano de 1982, nos Estados Unidos, em experimento</p><p>no qual os pesquisadores injetaram um gene do crescimento de ratos em óvulos</p><p>fecundados de camundongo; como resultado, surgiu um “supercamundongo”,</p><p>sendo esse trabalho considerado um marco na criação de animais transgênicos.</p><p>No Brasil, o primeiro animal transgênico criado foi um camundongo, batizado de</p><p>Christian, no ano de 2001. Esse projeto foi liderado pela doutora Lygia Pereira,</p><p>do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo e seu principal objetivo</p><p>foi obter animais mutantes para o desenvolvimento de fármacos relacionados à</p><p>síndrome de Marfan.</p><p>Em geral, a transgenia em animais pode ser aplicada em muitas áreas, como no</p><p>estudo de patologias, no desenvolvimento de órgãos para transplante, na produção</p><p>de proteínas e hormônios, no melhoramento genético de animais de cultivo, entre</p><p>outros propósitos.</p><p>Importante!</p><p>Que a síndrome de Marfan é uma patologia genética que causa uma anormalidade no</p><p>tecido conjuntivo e é caracterizada pelo alongamento dos membros superiores e infe-</p><p>riores, afetando também pulmões, olhos e vasos sanguíneos? Recebeu este nome pois</p><p>foi originalmente descrita pelo pesquisador francês Antonie Marfan, no ano de 1896.</p><p>Você Sabia?</p><p>19</p><p>UNIDADE Ferramentas Moleculares Básicas da Biotecnologia</p><p>Material Complementar</p><p>Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:</p><p>Sites</p><p>Transgênicos: Perigo para a Agricultura e a Diversidade</p><p>https://goo.gl/1HsOhd</p><p>Livros</p><p>Biologia Molecular da Célula</p><p>ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da célula. 5. ed. Porto Alegre, RS: Artmed,</p><p>2010. p. 1-54.</p><p>Fundamentos de Biologia Molecular</p><p>MALACINSKI, G. M. Fundamentos de Biologia Molecular. 4. ed. Rio de Janeiro:</p><p>Guanabara Koogan, 2005. p. 460.</p><p>Vídeos</p><p>A Engenharia Genética</p><p>https://youtu.be/emG4e8jHUJA</p><p>20</p><p>21</p><p>Referências</p><p>DE ROBERTS, E. M. F.; HIB, J. Base da Biologia Celular e Molecular. Rio de</p><p>Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.</p><p>FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M.; REIS JUNIOR, F. B. dos. Biotecnologia:</p><p>estado da arte e aplicações na agropecuária. [S.l.]: Embrapa Cerrados, 2011.</p><p>MALAJOVICH, M. A. Biotecnologia 2011. Rio de Janeiro: ORT, 2012.</p><p>ZAHA, A. Biologia Molecular Básica. 3. ed. Porto Alegre, RS: Mercado</p><p>Aberto, [20--].</p><p>21</p>