Sémen

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Tecnologia do sémen 
Por: Professora Teresa Montenegro Correia 
Teresa Montenegro Correia 
Características do sémen Touro Carneiro Varrasco Cavalo Coelho 
Volume do ejaculado (ml) 5-8 0,8-1,2 150-200 60-100 0,4-0,6 
C. espermática (milhões/ml) 800-2000 2000-3000 200-300 150-300 50-350 
Esperma/ejaculado (biliões) 5-15 1,6-3,6 30-60 5-15 0,03 
Motilidade espermática (%) 40-75 60-80 50-80 40-75 80 
Formas normais (%) 65-95 80-95 70-90 60-90 80 
pH 6,4-7,8 5,9-7,3 7,3-7,8 7,2-7,8 6,6-7,5 
Ejaculações/semana 4 20 3 3 6 
 
Padrões de classificação mínimos da “possível fertilidade” dos touros, carneiros, 
porcos, cavalos e coelhos são os seguintes 
Teresa Montenegro Correia 
Teresa Montenegro Correia 
Esquema representativo do processo de Espermatogénese. Adaptado de 
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/nucleo15.php. 
Recolha de Sémen 
• Vagina artificial 
 
• Método de eleição. 
• Necessário treino- 6-10meses (ovinos). 
• Adaptação ao meio 
• Adaptação ao operador 
• Fémea dócil- ou tratada com estrogénios 
• Tronco de contensão 
 
Teresa Montenegro Correia 
Preparação da vagina artificial 
 
• Encher a camisa externa com água de 
forma a obter 45º. 
• Introduzir ar na válvula para 
incrementar a pressão do ar. 
• Lubrificar com gel não espermicida. 
• Usar uma vagina para cada macho. 
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Recolha de sémen 
Tronco de contensão da fêmea para 
recolha de sémen. 
Recolha de sémen em vagina 
artificial. Teresa Montenegro Correia 
Recolha de sémen com electro ejaculador 
 
• Deveremos usar quando: 
 
• Os animais não são dóceis. 
• Pouca líbido 
 
• Animais com alguns problemas 
• físicos. 
 
• Animais não treinados. 
Teresa Montenegro Correia 
Teresa Montenegro Correia 
Parâmetros Garanhão Touro Carneiro Varrasco 
Idade 2 anos 1 ano 9 meses 1 ano 
Utilização inicial Cobrições 
semanais 
1 1-2 ocasional 3 
Nº de fêmeas por 
época 
15-20 5-10 
Idade 3 anos 1 ano 
Adolescentes Cobrições 
semanais 
2 
Nº de fêmeas por 
época 
40-50 até 15 25-30 
Adultos Cobrições 5-6 semanais 3-4 semanais 3 diárias 1 diária 
Nº de fêmeas por 
época 
80 25-40 100/2-3 machos 
Possível esquema de utilização dos machos como reprodutores 
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Electro ejaculação 
 
• A electro ejaculação está baseada na aplicação rítmica de um estímulo elétrico 
por via transretal estimulando o sistema nervoso autónomo e somático, que 
conduz á obtenção de secreções das glândulas acessórias e finalmente á 
ejaculação. 
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Avaliação do sémen 
Volume 
concentração 
Mobilidade 
Viabilidade 
Funcionalidade 
espermática 
Teresa Montenegro Correia 
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Cuidados com o material utilizado 
• Todo o material usado e meios de diluição devem estar a 37º para evitar a 
morte dos espermatozoides por choque térmico. 
Teresa Montenegro Correia 
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Análise de rotina 
• Volume e aspeto 
- O volume pode variar entre (0,8-
1,5)ml. 
- Branco leitoso 
- Tonalidade avermelhada indica 
contaminação. 
- Odor 
- Viscosidade 
- pH 
 
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Concentração 
• Câmaras de contagem 
 
• Para fazer a contagem dos 
espermatozoides, diluímos o sémen cerca 
de 2000 vezes. 
• Se usarmos água matamos os 
espermatozoides, o que nos dá jeito para 
os contar. 
• Normalmente os ejaculados têm cerca de 
2 000 a 7000 milhões por ml. 
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Avaliação da mobilidade 
• Devemos diluir 100 vezes, o sémen 
para avaliar a mobilidade de (0-
100%). Lâminas aquecidas e porta-
objetos aquecidos. 
• Como varia muito de operador para 
operador, hoje em dia usam-se os 
sistemas computorizados para fazer 
essa avaliação. “Sistema Casa”. 
Teresa Montenegro Correia 
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Viabilidade 
• Para avaliar a viabilidade de uma forma rigorosa teríamos que usar técnicas como 
a fecundação in vitro (FIV), para estimar o nº de espermatozoides que se uniriam 
ao oócito . Nas análises de rotina apenas se utiliza a integridade da membrana e 
do acrossoma. Usam-se corantes não fluorescentes e fluorescentes. 
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Corantes mais usados 
• Não fluorescentes 
• Azul “Tripán” e eosina. São corantes que não podem penetrar no interior da célula 
se a membrana está intacta, por isso só ficam coloridos os espermatozoides com 
membrana danificada. No caso da eosina pode-se combinar com a nigrosina, que 
só serve para dar contraste, já que o funda da preparação fica preto e permite 
visualizar também os que não foram tingidos (deveremos fazer um diluição de 
1/100 Se virmos com objetiva de emersão 100X podemos observar o acrossoma. 
Teresa Montenegro Correia 
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Corantes Fluorescentes 
• Microscópio de fluorescências com filtros específicos, adaptados aos 
comprimentos de onda de excitação e emissão de cada corante. 
• O mais usado é o iodeto de propídio. Entra em membranas danificadas e tem 
afinidade pelo DNA. 
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Técnicas não baseadas em corantes 
• Outra forma de avaliar a integridade da membrana plasmática, neste caso só 
aplicado a espermatozoides chamado HOS (hipoosmotic swelilng, test). Consiste 
em pôr em contacto com as células um meio hiposmótico (citrato de sódio 25mM 
e frutose a 75mM; mOsm/l), de modo que as tenham a sua membrana intacta 
responderão captando água, e por isso incham, levando a uma torção do flagelo. 
As que têm a membrana danificada não respondem. 
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Análise da capacitação 
• . Durante a capacitação e a reacção acrossómica, produz-se uma série de 
alterações no espermatozóide, as quais podem ser avaliadas mediante 
diversas técnicas laboratoriais . Esta avaliação é muito importante, 
especialmente quando se pretende aplicar técnicas de fecundação in vitro 
(FIV). Estes métodos laboratoriais podem ser classificados em técnicas 
morfológicas (vesiculação, pode usar-se microscopia electrónca), de 
marcadores de membrana (Lecitinas, neoglucoconjugados e anticorpos), 
provas funcionais e outras (Vásquez, 1991). 
 
Teresa Montenegro Correia 
Determinação das alterações resultantes da 
capacitação e da reação do acrossómica 
Tem sido utilizada com frequência a observação de uma alteração fisiológica, 
facilmente encontrada e que está associada ao desenvolvimento da 
capacidade fertilizadora do SPZ, como é o caso da aparição da motilidade 
hiperativa, momentos após o SPZ ter sofrido a capacitação. Contudo, existem 
outros métodos, como sejam as técnicas de coloração e posterior 
observação dos espermatozoides num microscópio ótico ou eletrónico e as 
provas de fecundação in vitro (10). 
 
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Provas de Funcionalidade FIV heteróloga 
Yanagimachi et al. , (1976 ) informaram que os oócitos nus 
(sem o cumulus oophorus e sem a membrana pelúcida) de 
hamster dourado podem ser penetrados pelos 
espermatozoides humanos capacitados, esta prova tem sido 
adaptada a outras espécies. 
Teresa Montenegro Correia 
Test do Hamster 
• O Test do Hamster realiza-se segundo a metodologia descrita por Yanagimachi et 
al. (1976). Após a obtenção dos oócitos, estes são tratados com hialuronidase e 
tripsina (a fim de se eliminar, respetivamente, o cumulus oophorus e a zona 
pelúcida). Posteriormente, os oócitos morfologicamente idóneos são submetidos a 
um co-cultivo junto com a amostra espermática, durante um período de 3 a 5 
horas). 
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Continuação 
• Transcorrido este período de tempo, os oócitos são examinados sob um 
microscópio de contraste de fases. A presença de um só pronúcleo não é aceite 
como sinal de uma adequada penetração, dado que os oócitos de hamster podem 
ativar-se partenogeneticamente. 
• A visualização de cabeças descondensadas ou de pronúcleos masculinos, 
acompanhados da presença de flagelos no citoplasma, constituem sinaisde uma 
adequada penetração . 
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Refrigeração e conservação do sémen 
• Quando se iniciou a IA, esta tinha de 
ser realizada pouco tempo após a 
colheita do sémen, uma vez que a 
sobrevivência dos SPZ fora do 
aparelho genital masculino se 
limitava a um curto período de 
tempo . Desta forma, a aplicação em 
grande escala da IA implicou o 
desenvolvimento de condições 
técnicas que permitissem preservar 
os SPZ por largos períodos de tempo. 
 
http://file.ranchodasamericas.com.br/Editor
/embriao_editada.jpg 
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Refrigeração e conservação do sémen 
• Em nenhuma espécie, a motilidade espermática pós-congelação é 
superior a 50% (as lesões acrossómicas são muito frequentes). 
Logicamente, a sobrevivência destes SPZ, no aparelho genital feminino, 
reduz-se significativamente. Contudo, nos bovinos, a inseminação com 
20 milhões de SPZ que foram congelados resulta numa taxa de 
fertilidade semelhante à que se obtém com a monta natural ou com a 
inseminação de sémen fresco não diluído (taxas de não retorno, aos 60 
dias, próximas dos 80% e taxas de fertilidade aparente de 55-60%) 
 
Teresa Montenegro Correia 
Congelamento de sémen 
http://www.minitube.de/var/StorageMi
nitube/Produktbilder/13440-
0000_minitubes.jpg 
http://4.bp.blogspot.com/-
sDudFXqezcQ/UVrhYHf6xvI/AAAAAAAAAlw/-
3RaVHQKixI/s1600/img_1359-2.jpg 
Azoto líquido ou gelo seco 
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Metodologia do congelamento do sémen 
• O plasma seminal, per se, confere uma proteção limitada aos SPZ face às variações 
de temperatura . Para ser armazenado a baixas temperaturas, é necessário 
misturar o sémen com diluidores especiais. 
• Os diluidores deverão reduzir a concentração de células espermáticas, fornecer um 
suplemento energético, estabilizar o pH, conferir um ambiente osmoticamente 
controlado e proteger os SPZ dos choques térmicos. 
 
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O que devem conter os diluidores? 
• Sais 
• Substância tampão 
• Elementos nutritivos 
• Agentes bacterianos 
• Crioprotetor 
• Nota: O diluidor deverá ser preparado pouco tempo antes da colheita do sémen e 
deverá ser conservado no frigorífico, à temperatura de 4°C, até à altura da sua utilização 
 
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Agentes salinos 
• A força iónica parece não ser um elemento crucial, uma vez que a fertilidade 
se mantém constante dentro de uma ampla margem de forças iónicas . A 
osmolaridade é importante, sendo a maioria dos diluidores hiperosmóticos 
(350-400 mOsmols/kg, antes da adição do crioprotetor) . 
• Esta hiperosmolaridade leva a uma desidratação das células espermáticas, 
antes de se dar início ao processo de congelação, o que constitui um 
fenómeno muito útil . 
 
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Substância tampão 
• A substância tampão tem por função neutralizar as substâncias residuais, 
resultantes do metabolismo espermático. Em particular, deverá neutralizar o ácido 
láctico (7). 
• O citrato de sódio, diluído a 2,9%, é a substância com capacidade tamponizante 
mais utilizada. Também poderá ser utilizado o fosfato de sódio. 
 
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Porção nutritiva 
• Gema de ovo de galinha (proteção das membranas) 
 
• O leite, outra possível fonte de nutrientes para os SPZ; tem de ser fervido, durante 
10 minutos, à temperatura de 92-95°C, para que se dê a destruição das enzimas 
capazes de diminuir a sobrevivência dos SPZ. 
 
• Outras possíveis fontes de nutrientes são o leite de coco e a gema de ovo da pata. 
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Bactericidas e outros aditivos 
• A utilização destes agentes, na constituição dos diluidores do sémen, tem a dupla 
função de destruir os microrganismos patogénicos (e de reduzir o metabolismo 
espermático . 
• Os agentes antibacterianos mais comuns são a penicilina e a estreptomicina 
(normalmente, são até utilizados em conjunto). 
 
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Crioprotetor 
• Para além dos crioprotetores já mencionados o glicerol é o mais 
usado em ovinos. Tem a vantagem de manter a água em dissolução 
e reduzir a sua temperatura de congelação, contrariando o stress 
osmótico. A concentração utilizada varia geralmente entre os 6 e os 
8%, podendo reduzir-se se se aumentar à gema de ovo. 
 
• Recomenda-se não adicionar maiores concentrações de glicerol, 
pois é tóxico, nem o devemos adicionar muito tempo antes de 
congelar o sémen. 
 
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Outros aditivos 
• Alguns estimulantes metabólicos, como é o caso da cafeína, parecem elevar a 
motilidade espermática, embora não afetem de modo significativo a fertilidade . 
 
• Enquanto que alguns trabalhos demonstram que a adição de prostaglandinas 
eleva a fertilidade do sémen de carneiro, outros trabalhos demonstram 
precisamente o contrário . 
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Processo de Congelação 
• O processo de congelação realiza-se em duas 
etapas, refrigeração e a congelação 
propriamente dita. 
• Depois da termos diluído, parcialmente o 
sémen. 
• Refrigera-se até 5 ºC a uma velocidade de -
0,2 a -0,4ºC/minuto. Uma refrigeração a uma 
velocidade mais rápida diminui a mobilidade 
pós-descongelação dos espermatozoides. 
Adiciona-se a segunda fração do diluidor com 
o glicerol. Deveremos manter a esta 
temperatura 1-2 horas . 
Palhetas utilizadas no congelamento do 
sémen. 
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Preparação de sémen congelado 
• De forma manual- vapores de azoto 
• De forma automatizada-biocongelador programável 
• Pastilhas- gelo seco (-80 e -95ºC) 
• Vantagens de congelação do sémen 
• Descongelar a 37ºC- 30segundos 
• a 50ºC-9 segundos 
• Após a descongelação, vamos ter que avaliar o lote (uma amostra por lote). 
 
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Lote para inseminação 
 
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Inseminação exo-vaginal 
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Inseminação intra-uterina 
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Observação da sincronização 
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Inseminação intrauterina e exo- vaginal 
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