Nucleases

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Nucleases
	As nucleases são enzimas que afetam as ligações fosfodiéster. Lembrando que existem as glicosilases que quebram as ligações entre as bases nitrogenadas e os açúcares que também podem destruir o DNA e o RNA. O foco das nucleases é a ligação entre o fosfato e o açúcar. Essas enzimas podem ter especificidade quanto ao substrato, que reconhecem e clivam DNA (DNAses) e RNA (RNAses). Elas baseiam o reconhecimento dela na presença ou não da hidroxila na posição 2’. Elas também podem ter uma especificidade quanto a localização da ligação clivada. Existem enzimas que só conseguem “pegar” ponta de fita e vão removendo um a um nucleotídeos a partir da extremidade de uma fita. Esse é o mecanismo de ação das exonucleases. Estas podem ainda ter outro nível de especificidade: existem exonucleases que só removem nucleotídeos a partir do terminal 3’OH ou que só fazem essa clivagem a partir do terminal 5’P. Ainda vão existir nucleases que são endonucleases e, portanto, só conseguem clivar essas ligações fosfodiéster se esta estiver no interior de uma fita (seja simples ou dupla). Elas também apresentam um outro nível de especificidade: o ponto da ligação fosfodiéster em que ela cliva, pode ser entre o fosfato e o terminal 3’OH logo acima dele ou deixa o fosfato ligado ao 3’OH e corta no nível da ligação entre o 5’ e o fosfato.
	Quando a ligação é quebrada entre o fosfato e o 3’OH (deixando fosfato ligado ao 5’), essa é uma especificidade a. Quando ela é quebrada entre o fosfato e o carbono 5’, essa é uma especificidade b. 
	Nucleases são hidrolases que atuam na ligação fosfodiéster. Sempre que a nuclease agir o fosfato vai ficar ligado a um dos dois: ou ao carbono 5’ ou ao 3’OH. 
 
	Endonucleases são as que não vão as clivar a primeira e a última ponte fosfodiéster (clivam ligações fosfodiéster não terminais). Ela vai pegar o centro da fita, e pode apresentar uma especificidade a (deixa fosfato ligado ao carbono 5’) ou b (deixa fosfato ligado ao 3’OH). 
 
As exonucleases clivam ligações fosfodiéster terminais. Podem ter preferência pelas fitas que sejam de alguma forma linear ou que apresentam alguma outra forma de abertura (circular aberta OC). Removem nucleotídeos um a um, sempre encurtando a cadeia. E pode ter especificidade quanto à direção da atividade: sentido 5’ -> 3’ ou sentido 3’ -> 5’. Existem algumas que apresentam as duas especificidades. 
	5 exemplo de nucleases:
DNase I: o substrato dela é tanto DNA em fita dupla quanto em fita simples. Ela é uma endonuclease e gera especificidade a, portanto, o fosfato fica ligado ao carbono 5’. O fragmento que sofrer ação da DNase I vai ser clivado em algum ponto no interior da molécula de forma que sempre onde houve a clivagem o fosfato vai ficar ligado ao 5’. As nucleases não atuam de forma sítio específica. As que fazem isso são as endonucleases de restrição. A clivagem vai ocorrer de forma aleatória, não necessariamente gerando fragmentos simétricos. Exemplos desse tipo de ação: degradação de DNA contaminante após a extração de RNA; limpeza de RNA para a realização de PCR em tempo real; criar biblioteca de fragmentos de DNA.
 
RNase A: só pega RNA em fita simples, tem atividade endonuclease em 3’ de purinas (A e G) e faz especificidade b. O fosfato fica ligado à purina. Exemplos de uso: degração de RNAm in vivo; defesa contra vírus de RNA. 
RNase H: o substrato dela será RNA híbrido de DNA + RNA, por exemplo: DNA + PRIMER deRNA. Nesse caso, ela irá degradar somente sempre o RNA. Ela tem atividade endonuclease e especificidade a. 
 
Nuclease SI: atua principalmente em DNA em fita simples e eventualmente em RNA em fita simples. O DNA, no caso, está em fita simples quando há uma região aberta circular (forma OC) ou então quando tem uma cauda de fita simples sobrando de uma fita dupla. Na cauda de fita simples ela tem uma atividade de endonuclease, onde ela vai fazer com que as fitas passem a terminar no mesmo ponto. Ela vai ter especificidade a. Ela é muito usada em biologia molecular para remover terminais coesivos de fragmentos de DNA, gerando terminais abruptos; para linearizar um plasmídeo que já esteja aberto circular; para abrir grampos de RNA. 
 
 		 
Como uma questão dessa deve cair na prova: enzima tal especificidade isso isso isso e aquilo, tem aplicação pra tal coisa? Tenta entender pra que serve e por que, just that.
Exonuclease III: pega DNa de fita dupla, é uma exonuclease, especificidade 3’ pra 5’. É capaz de degradar DNAs que tenham terminais abruptos ou com cauda 5’, assim como pontos OC. Terminais 3’ que sejam caudas de mais de 4 bases são resistentes a esta enzima por estarem em fita simples. O TERMINAL 3’ TEM QUE ESTAR EM FITA DUPLA.
			Endonucleases ou enzimas de restrição
	São enzimas que reconhecem sítios específicos, sequencias específicas de bases e promover clivagem nessas áreas. Ex: EcoRI que cliva sempre que no DNA encontra a seguinte sequência: GAATTC. Outro exemplo é a SmaI, que cliva sempre que encontra CCCGGG. 	Ainda tem a XmaI, que também cliva CCCGGG, só que ela tem uma especificidade, ela corta a última citosina, enquanto a anterior corta no meio. Para haver maior controle sobre a separação e se houver necessidade de renaturação (abrir um plasmídeo, inserir alguma coisa e fechá-lo novamente) convém que se trabalhe com uma enzima de terminal coesivo. 
Existem vários tipos, as do I e III reconhecem mas não clivam no sítio, clivam em algum ponto acima ou abaixo do sítio, isso faz com que perca a especificidade. As do tipo II são específicas e atuam na sequência do reconhecimento, fazendo com que haja um controle muito preciso, ferramenta muito importante para mecanismos de biologia molecular. As ER II, que vão agir no DNA de fita dupla, elas atuam em sequências palindrômicas.
	Obs: um corte assimétrico gera um fragmento com terminais coesivos, onde as duas fitas não se encaixam perfeitamente (sobra um predaço); já um corte simétrico gera fragmentos com terminais abruptos, ou seja, que não sobram pedaços de fita simples.