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Cromatografia aplicada ao 
controle de qualidade de 
medicamentos
Rita Estrela
CROMATOGRAFIA
•Método físico-químico de separação, 
fundamentado na migração diferencial dos 
componentes de uma mistura (fases imiscíveis);
•O termo cromatografia foi empregado pela 
primeira vez em 1906 e sua utilização atribuída a 
um botânico russo;
CROMATOGRAFIA - história
• Separação dos componentes de extratos de folha 
usando éter de petróleo passando através de uma 
coluna de vidro cheia de CaCO2 – separação dos 
componentes em faixas coloridas (chrom = cor e 
graphie = escrever)
Carbonato de cálcio em pó
Pequena quantidade de amostra
Éter de petróleo 
Bandas separadas e de cores distintas.
éter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
PRINCÍPIO BÁSICO
•Separação de misturas por interação diferencial 
dos seus componentes entre uma FASE 
ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE 
MÓVEL (líquido ou gás).
SISTEMA CROMATOGRÁFICO 
• Fase móvel: solvente (gás ou líquido) que se move 
através da coluna, carregando os solutos. 
• Fase estacionária: sólido (ou líquido impregnado em 
um sólido) que permanece dentro da coluna de 
separação. 
princípio
CROMATOGRAFIA
Planar Em coluna
Gás Fluido
supercrítico
LíquidoLíquido
L S FL L LS S SFL FL FL
Técnica
Fase
Móvel
Fase
Estacionária
L= líquido, S = sólido, FL= fase ligada
Mecanismos de separação:
•Adsorção
•Partição (Fase normal e reversa)
• Troca Iônica
• Exclusão
•Biofinidade
Fase estacionária: sílica, alumina
Cromatografia de adsorção
Separação baseada nas diferenças de afinidades adsorventes dos componentes 
pela superfície do sólido ativo. Baseia-se nas atrações eletrostáticas ou 
dipolares da superfície da fase estacionária pelas moléculas da substância a 
separar. 
• competição entre soluto e FM pelos sítios ativos da FE
• FM apolar (hexano, heptano) com add de solvente moderadamente 
polar (EtOAc, álcool) – sem água!
• grau de retenção depende da polarização de cada molécula ou grupo 
funcional
Cromatografia de partição
Interação/separação baseada nas diferenças de solubilidade dos 
componentes na fase estacionária (GC) ou entre a duas fases líquidas (LC). 
A FE é líquida!
Fase normal: F. Estacionária mais polar que F. Móvel
Fase reversa: F. Estacionária menos polar que F. Móvel
HPLC – Fases Estacionárias
Sílica – um suporte adequado para funcionalização - Grupos silanóis
HPLC – Fases Estacionárias
Modificação de superfície da sílica para interações hidrofóbicas – 
cromatografia líquida em fase reversa
Si O H + Si
C H 3
C H 3
RC l S i O Si
C H 3
C H 3
R + HC l
Grupo Polar
Grupo apolar
R= CH3 ; C H 3
(C8)
C H 3
(C18)
HPLC – Fases Estacionárias
Partículas esféricas de silica porosa com diâmetro de 10 m –
Tamanho típico de poros = 100 Å. 
Aumento de 800X ©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6th Ed. (Wiley)
Partículas microporosas, 
permeáveis ao solvente, são 
as mais comuns em HPLC.
São disponíveis como a sílica 
pura (SiO2) para cromatografia 
de adsorção, ou com fase 
ligada – em muitos casos para 
cromatografia de partição.
 
Cromatografia por partição 
 
fase ligada 
✓ superfície da sílica (altamente polar) é alterada pela adição de 
diversos grupos funcionais => diferentes tipos de seletividade 
 
 
FASE NORMAL FE polar (-NH2 ; -CN) 
 FM apolar ou medianamente polar 
 
FASE REVERSA FE apolar ( -C8H17 ; -C18H37; -C6H5 ) 
 FM polar 
 
 
 FASE NORMAL FASE REVERSA 
polaridade da FE alta baixa 
polaridade da FM baixa-média alta-média 
FM típica heptano/clorofórmio CH3OH:H2O 
ordem de eluição menos polares primeiro mais polares primeiro 
para aumentar Tr dos 
solutos 
diminuir polaridade da 
FM 
aumentar polaridade da 
FM 
para diminuir Tr dos 
solutos 
aumentar polaridade da 
FM 
diminuir polaridade da 
FM 
 
 
Para usar coluna de fase reversa! 
Aumentar a retenção!
 
 
INTERAÇÃO AMOSTRA/REAGENTE NO 
MODO PAR IÔNICO 
 
 
 
 SOLUTO + CONTRA-ÍON → SOLUTO=CONTRA ÍON 
 
 par iônico de carga neutra 
 SOLUTO CONTRA-ÍON 
 
 
 
Cromatografia de troca iônica
Interação é devida a equilíbrio de troca iônica 
•fortemente catiônica (sulfônico)
•fortemente aniônica (amina quater.)
•fracamente catiônica (carboxílico)
•fracamente aniônica (amina prim.)
 
✓ FE mais comuns (suporte): sílica ou resina de poliestireno cruzada com 
divinilbenzeno (ES-DVB), às quais são ligados GRUPOS IÔNICOS 
 
✓ os contra-íons serão deslocados pelos íons da FM 
 
 
Resina trocadora aniônica 
(sítios positivos contra-íons aniônicos) 
 
Resina trocadora catiônica 
(sítios negativos contra-íons catiônicos) 
Tipos de Colunas de Troca Iônica 
Cromatografia de exclusão
Interação é devida a processos mecânicos de exclusão
FE é um gel que recobre um sólido com 
porosidade controlada (permeação em gel)
Aplicação importante: análise de polímeros 
(GPC) 
 
Cromatografia por permeação em gel 
 
✓ separação de acordo com o tamanho da molécula (PM: 1000 – milhões) 
✓ FE é um material inerte com tamanhos de poros diferentes e controlados 
✓ materiais empregados: copolímero ES-DVB ; sílica ; vidro poroso 
✓ moléculas de menor PM penetrarão mais nos poros, sofrendo mais 
retenção 
 
 
diâmetro poro (Å) Faixa de PM 
100 50 – 1500 
500 100 – 104 
103 200 – 3.104 
104 5.103 – 6.105 
105 5.104 – 4.106 
106 2.105 – 1.107 
 
 
 
✓ análises de polímeros orgânicos sintéticos e biopolímeros 
 
limite de permeação 
limite de exclusão 
Cromatografia de Bioafinidade
Utilizam grupos com especificidade biológica, quimicamente ligado às matrizes.
FE: agarose, celulose, dextrano, poliacrilamida e outros polímeros, partículas porosas de 
alumina, vidro de porosidade controlada.
 interação seletiva com proteínas e anticorpos
Resumo dos tipos de separação cromatográficos
Mecanismos de separação
CLAE
• técnica para separação e análise de qualquer mistura de substâncias 
VANTAGEM:
1.Grande número de amostras
2.Bom limite de quantificação
3.Rapidez
 DESVANTAGENS:
1.Descarte de solventes orgânicos em grande volume
Bombas reciprocadoras são bombas que escoam volumes 
constantes de forma não contínua, isto é, pulsante. Essas
bombas operam mediante o movimento de um pistão e através
de um sistema de válvulas que alternadamente se abrem e 
fecham, onde se enche e esvazia de modo alternativo, uma
pequena câmara. Estas bombas apresentam um volume 
interno de 100-200 µL.
Sistema de injeção sob pressão
Propriedade dos solventes:
-Dissolver a amostra;
- k` de 1 a 10;
-Alta pureza;
-Custo, viscosidade, toxicidade, pto de ebulição
SISTEMAS DE SOLVENTES TIPICAMENTE USADOS
Fase normal ou adsorção solvente não-polar ou mistura de solventes, 
como hexano, ciclohexano, acetonitrila, 
clorofórmio, tolueno ou diclorometano
Fase reversa mistura de dois ou mais, como água ou 
tampão aquoso com metanol, acetonitrila, ou 
tetrahidrofurano (THF).
Troca iônica tampão aquoso
Permeação em gel Tetrahidrofurano, tolueno
Filtração e degaseificação da Fase Móvel
Filtração da amostra
• Acetato de celulose
•Nylon hidrofílico
•PES (Polietersulfona)
•PTFE (politetrafluoretileno hifrofóbico e 
hidrofílico)
•PDVF (fluoreto de polivinilideno hidrofóbico)
•13 mm
•25 mm
•0,22 µm
•0,45 µm
Poro
Tipos
Diâmetro
colunas
Fase móvel
Isocrático: 
•Composição da fase móvel permanece constante. 
•Capaz de separar um número limitado de picos. 
Gradiente:
•Composição da fase móvel varia durante a análise. 
•Sistema aplicável quando a polaridade dos compostos é muito diferente. 
•Separação de amostras complexas. A determinação de impurezas relacionadas 
em uma matéria-prima é um exemplo. 
Considerando coluna de Fase Reversa
Usando gradiente
Detectores
Gera sinal elétrico que é proporcional a alguma 
propriedade da FM e/ou soluto
▪ Alta sensibilidade e baixo limite de detecção
▪ Resposta rápida a todos os solutos▪ Insensibilidade a mudanças na temperatura e na vazão da FM
▪ Resposta independente da FM
▪ Pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume morto da cela 
▪ Resposta que aumente linearmente com a quantidade de soluto
▪ Não destruição do soluto
▪ Informação qualitativa do pico
NÃO EXISTE DETECTOR UNIVERSAL EM CLAE
BCA =
Requer:
❖ Luz monocromática 
❖ Solução sem turbidez 
❖ Concentrações baixas
- Espectrofotométrico de absorbância da luz UV/Vis
Ligações  e elétrons não emparelhados => maioria dos fármacos
 Lei de Lambert-Beer =>
FM não deve absorver no mesmo 
Opções:
Comprimento de onda fixo e variável
Lâmpada de 2D ou W
Detector UV de Arranjo de Fotodiodos
Cromatogramas
Espectro 
dos picos
 
 
Características de alguns detectores de CLAE 
 
 Detector por 
espectrofoto- 
metria UV. 
Detector por 
fluorescência. 
Detector por 
índice de 
refração. 
Detector por 
eletroquímico 
(eletrodo Hg 
gotejante). 
Detector por 
condutividade 
elétrica. 
Princípio 
de operação 
absorbância 
de luz na faixa 
do UV 
excitação com 
luz produz 
uma emissão 
fluorescente 
mudanças no 
índice de 
refração da 
fase móvel 
oxidação ou 
redução em 
potencial fixo 
condutividade 
elétrica 
devido a 
presença de 
íons. 
Tipo seletivo 
depende prop. 
do composto 
altamente 
seletivo 
depende prop. 
do composto 
universal 
depende prop. 
fase móvel 
seletivo 
depende prop. 
do composto 
seletivo 
depende prop. 
do composto 
 
Quantidade 
mínima de 
detecção 
(g/mL) 
 
10-9 
 
10-9 e 10-12 
 
10-7 
 
10-12 
 
10-8 
 
Volume de 
cela (L) 
1-20 10-25 3-15 5-10 1,5-2,5 
 
 
Características de alguns detectores de CLAE 
 
 Detector por 
espectrofoto- 
metria UV. 
Detector por 
fluorescência. 
Detector por 
índice de 
refração. 
Detector por 
eletroquímico 
(eletrodo Hg 
gotejante). 
Detector por 
condutividade 
elétrica. 
 
Sensibilidade 
à temperatura 
 
baixa 
 
baixa 
 
alta 
 
média 
 
Média 
 
 
Sensível à 
vazão da fase 
móvel 
 
não 
 
não 
 
não 
 
sim 
 
sim 
 
Útil com 
gradientes 
 
sim 
 
sim 
 
 
não 
 
não 
 
não 
Aplicações composto que 
absorvem no 
comprimento 
de onda 
selecionado 
Composto ou 
derivados que 
fluorescem 
geral Espécies que 
oxidam ou 
reduzem 
Soluções 
aquosas com 
compostos 
iônicos 
 
Análise Quantitativa – CLAE 
_______________________________________________________
Os requisitos para uma quantificação exata e precisa:
➢Boa resolução dos picos: cada pico é apenas uma substância.
➢Não pode haver adsorção e/ou decomposição dos compostos no sistema 
cromatográfico.
➢Existência de substância de pureza confiável para serem usadas como padrões – 
identificação e fator de correção da área.
➢A amostra a ser analisada deve ser representativa do total.
➢Não deve haver perdas no preparo
➢Não deve haver contaminação
➢Técnica de injeção correta
➢A temperatura e vazão da fase móvel não deve alterar a resposta do detector
➢A amostra injetada deve estar dentro da faixa linear do detector.
Parâmetros cromatográficos
Tempo de retenção (tr) – tempo em que a amostra permanece na coluna. É o tempo que 
transcorre desde o momento em que a amostra é introduzida no sistema até o momento em 
que se obtém o máximo de detecção 
 
Tempo morto (t0) – tempo gasto para percorrer a coluna, por um composto que não é retido 
pela coluna. 
 
Tempo de retenção corrigido (tr´) 
 
tr`= (tr - t0) 
 
Razão de distribuição das massas ou Fator de capacidade – Indica quanto tempo um 
componente permanece parado na FE, comparado com o tempo que migra na FM, durante a 
corrida. Indica o grau de afinidade que a FE e a FM possuem para o composto. 
 
K ou Dm = tr - tm / tm 
Fator de separação – Compara a retenção de um componente com a retenção de 
outro componente, indicando até que grau o sistema diferencia um do outro; valores 
elevados significam melhores separações >1 
 
 = tr2´ / tr1´ = Dm2 / Dm1 
 
 
Resolução – Expressa o grau de separação entre dois compostos consecutivos. 
 
R = (t2 – t1) / 0,5 (W1 + W2) 
 
 
Eficiência – É medida em termos de pratos teóricos gerados. Quanto maior N maior 
a eficiência da coluna 
 
 
Número de pratos teóricos - Equivale a uma etapa de equilíbrio entre as 
fases móvel e estacionária. 
 
 
N = 16 (tr/ Wb)
2 
 
Altura equivalente a um prato teórico – É a relação entre o comprimento da 
coluna e o número de pratos teóricos. 
 
H = L/ N 
• Resolução é uma medida da habilidade de uma coluna separar 
dois componentes.
Assimetria de Pico (As)
Teste de Adequação do Sistema
▪ Parâmetros e recomendações para o teste de verificação da 
adequação do sistema (SHABIR, 2003)
Parâmetros Recomendações
Fator de capacidade ( k') O pico deve estar bem resolvido de outros
picos e do volume morto k'  2,0.
Repetitividade É desejável um DPR  1% para N  5
Tempo de retenção relativo Não é essencial se a resolução é declarada
Resolução ( R ) R  2 entre o pico de interesse e o potencial
interferente que elui mais próximo
Fator de cauda ( T ) T  2
Número de pratos teóricos ( N ) Em geral deve ser  2000
	Slide 1: Cromatografia aplicada ao controle de qualidade de medicamentos
	Slide 2: CROMATOGRAFIA
	Slide 3: CROMATOGRAFIA - história
	Slide 4
	Slide 5
	Slide 6: PRINCÍPIO BÁSICO
	Slide 7: SISTEMA CROMATOGRÁFICO 
	Slide 8: princípio
	Slide 9
	Slide 10
	Slide 11: Mecanismos de separação:
	Slide 12
	Slide 13
	Slide 14
	Slide 15: HPLC – Fases Estacionárias
	Slide 16: HPLC – Fases Estacionárias
	Slide 17
	Slide 18: HPLC – Fases Estacionárias
	Slide 19
	Slide 20
	Slide 21
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	Slide 28
	Slide 29
	Slide 30: Resumo dos tipos de separação cromatográficos
	Slide 31: Mecanismos de separação
	Slide 32
	Slide 33
	Slide 34: CLAE
	Slide 35
	Slide 36
	Slide 37
	Slide 38
	Slide 39
	Slide 40
	Slide 41
	Slide 42: colunas
	Slide 43
	Slide 44
	Slide 45: Fase móvel
	Slide 46: Considerando coluna de Fase Reversa
	Slide 47
	Slide 48: Usando gradiente
	Slide 49
	Slide 50
	Slide 51
	Slide 52
	Slide 53
	Slide 54: 
	Slide 55
	Slide 56
	Slide 57
	Slide 58
	Slide 59
	Slide 60
	Slide 61
	Slide 62
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