apostila_2016

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1 
 
 
 
 
 
 
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 
QBQ-1453, 2016 
 
Departamento de Bioquímica- Instituto de Química - USP 
 
 
Professores 
 Sandro R. Marana e M. Terêsa Machini 
 
 
 
 
 
Monitores 
Marcela F. Mineiro e Railmara P. da Silva 
 
 
 
Os protocolos que constam desta disciplina foram originalmente 
desenvolvidos por: 
 Bayardo B. Torres 
 Iolanda M. Cuccovia 
 M. Terêsa Machini 
 Pedro S. de Araújo 
 Remo Trigoni Jr. 
 Sandro R. Marana 
 
Textos contendo fundamentos sobre estruturas e propriedades das 
biomoléculas em estudo e das técnicas empregadas para isso ou, ainda, 
instruções específicas ou guias para execução de cálculos específicos serão 
fornecidos pelos professores ao longo do semestre. 
 
 
2 
 Prática 1: Lise de Células de Levedura 
 
Objetivos 
Romper as células de Saccharomyces cerevisiae e preparar um lisado. 
 
Reagentes Materiais Aparelhagem 
água destilada banho de gelo centrífuga 
células de levedura (fase log tardia) pérolas de vidro 0,5 mm  estufa 
etanol pipetadores freezer 
fluoreto de -fenilmetilsulfonila 
(PMSF) 
 100 mM em etanol 
pipetas vórtice 
provetas 
hipoclorito de sódio 20 g/L 
 (água sanitária) 
suporte para tubos 
tubos de centrífuga 
tampão fosfato 100 mM pH 7,0 com 
 EDTA 5 mM (tampão de lise) 
tubos de ensaio 
tubos Falcon 
 
Procedimento A – Fracionamento celular 
 
OBSERVAÇÃO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
 
1. Em um tubo de centrífuga com tampa colocar aproximadamente 1 g (peso úmido) de células de 
leveduras crescidas até a fase logarítmica tardia. 
2. Adicionar 4 mL de tampão de lise. 
3. Ressuspender as células usando um vórtice. 
4. Adicionar 40 µL de PMSF 100 mM em etanol. 
5. Homogeneizar em vórtice. 
6. Adicionar à suspensão 8 mL de pérolas de vidro lavadas e secas. 
7. Agitar ininterruptamente e com firmeza em vórtice por 1 min (processo de lise). 
8. Resfriar em banho de gelo por 1 min 
9. Repetir as operações 7 e 8 por mais 4 vezes. 
10. Centrifugar a suspensão de células + pérolas de vidro a 850x g por 2 min. 
11. Remover cuidadosamente o sobrenadante – evitar coletar o material precipitado – para um 
tubo Falcon limpo e identificado como LISADO. 
12. Manter tubo LISADO em banho de gelo. 
13. Ressuspender o precipitado + pérolas de vidro em 4 mL de tampão de lise. 
14. Adicionar 40 µL de PMSF 0,1 M em etanol. 
15. Homogeneizar em vórtice. 
16. Repetir as etapas 10 a 15 por mais 2 vezes, reunindo os sobrenadantes no mesmo tubo LISADO. 
17. Usando uma proveta ou pipetas, determinar o volume total do LISADO. 
18. Dividir o lisado em 3 alíquotas de igual volume em tubos plásticos 
19. Identificar os tubos com o nome do grupo como 1, 2 e 3. 
20. Armazenar em freezer a –20oC. 
 
 
 
 
3 
 
FLUXOGRAMA 
 
 
 
1 g de Saccharomyces cerevisiae 
(PESO ÚMIDO) 
4 mL de tampão de lise 
40 L de PMSF 
Suspensão 
8 mL de pérolas de vidro 
Agitação em vórtice 
Centrifugação 
850X g por 2 min 
Precipitado Sobrenadante 
Suspensão 
Centrifugação 
850X g por 2 min 
Precipitado Sobrenadante 
Tubo 
LISADO 
4 mL de tampão de lise 
40 L de PMSF 
REPETIR 
2 X 
 
4 
Prática 2: a) Dosagem dos açúcares redutores presentes no 
lisado; b) Extração de lipídeos do precipitado e do material 
retido nas pérolas de vidro 
 
Objetivos 
Detectar e quantificar açucares redutores solúveis no lisado de Saccharomyces cerevisiae. 
 
Reagentes Materiais Aparelhagem 
água destilada tubos de ensaio grandes espectrofotômetro 
albumina 0,2 g/L cubetas para leitura 
Vórtice 
balança 
lisado de leveduras (P1) pipetadores 
DNS 10 g/L pipetas 
glicose 5 mM ponteiras 
 suportes para tubos de ensaio 
 
tubos de ensaio 
funil de separação 
erlenmeyers 
barra magnética 
agitador magnético 
 
 
Procedimento A - Curva padrão de glicose 
 
1. Em cada tubo, adicionar as quantidades estipuladas de água e de glicose, conforme a tabela 1; 
2. adicionar a quantidade necessária do reagente de DNS; 
3. homogeneizar em vórtex; 
4. colocar os tubos em banho-maria fervente por 10 min; 
5. esfriá-los em água corrente 
6. adicionar 8 mL de água destilada, completando o volume para 10 mL totais; 
7. ler as absorbâncias a 540 nm contra a água 
 
Solução padrão de glicose = 5 mM = 5 mmol/L = 5 µmol/mL; 
Massa Molar Glicose = 180 g/mol 
 
Tabela 1 
tubos 
solução-padrão 
glicose 
(mL) 
água 
(mL) 
DNS 
(mL) 
massa 
glicose 
(mg) 
A540 A540 - branco 
branco 0,0 1,0 1,0 
1 0,1 0,9 1,0 
2 0,2 0,8 1,0 
3 0,3 0,7 1,0 
4 0,4 0,6 1,0 
5 0,5 0,5 1,0 
6 0,6 0,4 1,0 
7 0,7 0,3 1,0 
8 0,8 0,2 1,0 
9 0,9 0,1 1,0 
10 1,0 0,0 1,0 
 
 
Procedimento B – Dosagem de açucares redutores no lisado obtido 
1. Agitar o lisado recebido (tubo 1 do grupo) suavemente por inversão. 
2. Dilui-lo como indicado abaixo. 
 
 
5 
OBSERVAÇÃO: para esse procedimento é necessário que o lisado seja diluído. Para isso segue o 
procedimento para diluição. 
1. Transferir 0,1 mL do lisado para um tubo de ensaio grande identificado como L10X. 
2. Adicionar 0,9 mL de água destilada. 
3. Homogeneizar em vórtice. 
4. Transferir 0,1 mL do tubo L10X para um tubo de ensaio grande identificado como L100X. 
5. Adicionar 0,9 mL de água destilada 
6. Homogeneizar em vórtice. 
 
3. Preparar os tubos segundo a Tabela 2. 
Tabela 2 
tubos 
amostras 
(mL) 
água 
(mL) 
DNS 
(mL) 
A540 A540 - branco 
Lis 1 
Lis 2 
 Lis 3 
 
0,25 
0,25 
0,25 
 
0,75 
0,75 
0,75 
 
1,0 
1,0 
 1,0 
 
 
X1 10X 0,25 0,75 1,0 
X2 10X 0,25 0,75 1,0 
X3 10X 0,25 0,75 1,0 
 
Y1 100X 0,25 0,75 1,0 
Y2 100X 0,25 0,75 1,0 
Y3 100X 0,25 0,75 1,0 
Caso a absorbância esteja fora dos limites da curva padrão, repita a dosagem com as 
modificações necessárias para que o valor obtido fique dentro dos limites da curva 
padrão. 
 
 
Procedimento C – Extração de lipídeos do material retido nas pérolas de vidro 
 
1. Colocar as pérolas de vidro e o precipitado da prática anterior em um erlenmeyer contendo 
uma barrinha magnética. 
2. Adicionar 2 mL de água e misturar. 
3. À suspensão obtida adicionar 15 mL da mistura metanol/clorofórmio (2:1, v/v) e 
imediatamente fechar o erlemeyer. 
4. Misturar bem a nova suspensão obtida mediante agitação manual do erlemeyer. 
5. Agitar por 24 horas. 
(As etapas 6-13 serão executadas pelos monitores) 
6. Filtrar a suspensão usando funil de Buchner coberto com papel de filtro. 
7. Lavar o filtro com 2 ml da mistura metanol/clorofórmio/água (2:1:0.8, v/v/v). 
8. Transferir o filtrado total obtido para um funil de separação de volume adequado. 
9. Acrescentar 10 mL de clorofórmio e 10 mL de água. 
10. Agitar o funil vigorosamente por 4 vezes. 
11. Aguardar a separação de fases e transfira a fase inferior para um erlemeyer. 
12. Adicionar sulfato de sódio a ela para a remoção da água residual “overnight”. 
13. Eliminar totalmente o clorofórmio da fase inferior em um evaporador rotatório. 
14. Determinar a massa de lipídeos totais mediante pesagem do resíduo obtido. 
 
 
Procedimento D – Lavagem das pérolas de vidro 
(Executado por monitores ou técnica) 
1. Transferir as pérolas de vidro para um erlenmeyer. 
2. Adicionar hipoclorito de sódio no erlenmeyer. 
3. Agitar algumas vezes durante 15 min. 
4. Descartar cuidadosamente o hipoclorito de sódio 
5. Repetir a lavagem com hipoclorito de sódio. 
6. Adicionar água no erlenmeyer 
7. Lavar as pérolas. 
8. Descartar cuidadosamente a água. 
 
6 
9. Repetir as etapas 6 a 8 por mais 5 vezes. 
10. Adicionar etanol no erlenmeyer. 
11. Colocar o erlenmeyer numa estufa. 
12. Aguardar a secagem das pérolas. 
 
 
Tratamento de Dados e Análise dos Resultados 
 
PRÁTICA 2 - DOSAGEM DE AÇUCARES REDUTORES E LIPÍDEOS 
 
INSTRUÇÕES: 
1. Completar as tabelas com os resultados experimentais da práticas 2. 
2. Construir a curva padrão para quantificaçãode glicose com o reagente DNS. 
3. Calcular a concentração de açucares redutores (mg/mL) no lisado de Saccharomyces 
cerevisiae. 
 
tubos massa de glicose Abs540 
 (mg) --- 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
 
Equação de reta: y = ax + b 
coeficiente angular = a 
Intercepto no eixo y = b 
 
TABELA PARA O CÁLCULO DACONCENTRAÇÃO DE AÇUCARES REDUTORES NO LISADO DE S. CEREVISIAE 
tubos A540 
Massa de açucar 
calculdada 
utilizando a curva-
padrão 
Volume da 
amostra 
concentração 
Diluição 
prévia 
Concentração de 
açúcar redutor 
no lisado original 
(sem diluição) 
 (mg) (mL) (mg/mL) (x) (mg/mL) 
 
X1 0,25 
X2 0,25 
X3 0,25 
Y1 0,25 
Y2 0,25 
Y3 0,25 
 
 
Massa de lipídeos obtida por grupo: _________ mg 
 
 
7 
Prática 3: Dosagem das Proteínas presentes no lisado 
 
Objetivos 
Detectar e quantificar proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae. 
 
Reagentes Materiais Aparelhagem 
água destilada papel de filtro espectrofotômetro 
albumina 0,2 g/L cubetas para leitura vórtice 
lisado de leveduras (P1) pipetadores 
reagente de Bradford pipetas 
 ácido fosfórico 85% ponteiras 
 Coomassie Blue G® suportes para tubos de ensaio 
 metanol tubos de ensaio 
 
 
Procedimento A – Curva-padrão de proteína 
 
1. Adicionar em cada tubo os volumes de albumina e água estipulados na Tabela 1. 
2. Adicionar o reagente de Bradford. 
3. Homogeneizar em vórtice. 
4. Aguarda 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente 
5. Usar o “branco” para calibrar (“zerar”) o espectrofotômetro. 
6. Ler as absorbâncias a 595 nm. 
7. Completar a Tabela 2. 
8. Construir a curva-padrão para detecção de proteínas com reagente de Bradford. 
 
Tabela 1 
tubos 
albumina 
0,2 g/L (L) 
água 
(L) 
reagente de 
Bradford (mL) 
branco 0 100 1,0 
1 10 90 1,0 
2 20 80 1,0 
3 30 70 1,0 
4 40 60 1,0 
5 50 50 1,0 
6 60 40 1,0 
7 70 30 1,0 
8 80 20 1,0 
 
 
Tabela 2 
tubos 
massa de 
proteína (mg) 
A595 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
 
 
8 
Procedimento B – Dosagem de proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisiae 
 
OBSERVAÇÃO: para esse procedimento é necessário que o lisado seja diluído. Para isso segue o 
procedimento para diluição. 
Diluição 100X: 
7. Transferir 0,1 mL do lisado para um tubo de ensaio grande identificado como L100X. 
8. Adicionar 9,9 mL de água destilada. 
9. Homogeneizar em vórtice. 
 
1. Adicionar em cada tubo os volumes de água e amostras do lisado (devidamente diluído) 
estipulados na Tabela 3. 
2. Adicionar o reagente de Bradford. 
3. Homogeneizar em vórtice. 
4. Aguardar 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente. 
5. Usar o “branco” para calibrar (“zerar”) o espectrofotômetro. 
6. Ler as absorbâncias a 595 nm. 
7. Completar a Tabela 4. 
 
OBSERVAÇÃO: Caso a absorbância das amostras experimentais esteja fora dos limites das 
absorbâncias obtidas na curva-padrão. Discuta com o professor ou monitor um novo valor de 
diluição. 
 
Tabela 3 
tubos 
L100X 
(L) 
H2O 
(L) 
reagente de 
Bradford (mL) 
branco - 100 1,0 
A1 100 - 1,0 
A2 50 50 1,0 
A3 30 70 1,0 
A4 20 80 1,0 
 
tubos A595 
A1 
A2 
A3 
A4 
 
 
9 
Prática 4: Determinação da Atividade Enzimática do lisado 
 
Objetivo 
Determinar a atividade da -glicosidase no lisado de Saccharomyces cerevisiae 
 
Reagentes Materiais Aparelhagens 
água destilada banho de gelo banho a 30oC 
lisado de leveduras cubetas para leitura espectrofotômetro 
p-nitrofenil--glicosídeo (NPGlc) 4 mM 
 em tampão fosfato 100 mM pH 7,0 
pipetadores vórtice 
pipetas 
tampão carbonato-bicarbonato 250 mM 
 pH 11,0 
ponteiras 
suportes para tubos de ensaio 
 tubos de ensaio 
 
 
 
Procedimento A – Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae 
 
OBSERVAÇÃO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
 
Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do lisado de Saccharomyces 
cerevisiae. 
 
1. Transferir 0,2 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado como L10X. 
2. Adicionar 1,8 mL de água destilada gelada. 
3. Homogeneizar suavemente 
4. Transferir 0,4 mL de L10X para um novo tubo identificado como L50X. 
5. Adicionar 1,6 mL de água destilada gelada. 
6. Homogeneizar suavemente 
7. Transferir 0,2 mL de L50X para um novo tubo identificado como L500X. 
8. Adicionar 1,8 mL de água destilada gelada. 
9. Homogeneizar suavemente 
10. Manter todos os tubos no gelo 
 
 
 
Procedimento B - Determinação da atividade da -glicosidase 
 
OBSERVAÇÃO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
Este procedimento deve ser feito para cada uma das diferentes diluições do lisado que foram 
preparadas. Todos estes ensaios podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento 
sempre pela adição do substrato. Somente quando todos os tubos já tiverem recebido o substrato 
deverá ser iniciada a adição das diferentes diluições de lisado. 
 
1. Preparar os tubos em banho de gelo. 
2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc estipulados na Tabela 1 e 2. 
3. Adicionar em cada tubo o lisado devidamente diluído. 
4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para o banho a 30oC. 
5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 1. 
6. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 mL de tampão carbonato-
bicarbonato pH 11,0. 
7. Agitar manualmente 
8. Deixar os tubos em temperatura ambiente. 
9. Usar a água para calibrar (zerar) o espectrofotômetro. 
10. Uma vez que todos os tubos tenham sido retirados, ler as absorbâncias a 420 nm. 
11. Completar a Tabela 3. 
 
 
 
 
 
 
 
10 
Tabela 1 
tubos 
NPGlc 4 mM 
(mL) 
lisado diluído 
(mL) 
Tempo de 
incubação a 30°C 
(min) 
1 0,2 0,2 5 
2 0,2 0,2 10 
3 0,2 0,2 15 
4 0,2 0,2 20 
Branco de Enzima --- 0,2 20 
 
 
Tabela 2 
Basta preparar este tubo apenas uma única vez, mesmo quando se trabalha com 
diferentes diluições do lisado 
tubo 
NPGlc 4 mM 
(mL) 
lisado diluído 
(mL) 
Tempo de 
incubação a 30°C 
(min) 
A420 
Branco de Substrato 0,2 --- 20 
 
 
Tabela 3 
 L10x L50X L500x 
tubos A420 A420 A420 
1 
2 
3 
4 
Branco de Enzima 
Branco de Substrato 
 
 
y = 0.006x + 0.009
R² = 0.999
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
0 50 100 150 200 250
A
b
s
o
r
b
â
n
c
ia
 a
 4
2
0
 n
m
no de mols (hmols)
Curva Padrão de p-nitrofenolato
 
11 
Tratamento de Dados e Análise dos Resultados 
PRÁTICA 3 - DOSAGEM DE PROTEÍNA 
PRÁTICA 4 - DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
 
INSTRUÇÕES: 
4. Completar as tabelas com os resultados experimentais das práticas 3 e 4. 
5. Construir a curva padrão para quantificação de proteínas com o reagente de Bradford. 
6. Calcular a concentração de proteínas (mg/mL) no lisado de Saccharomyces cerevisiae. 
7. Construir o gráfico do ensaio de atividade da -glicosidase (nmols de produto x tempo) 
para cada diluição de lisado utilizada 
8. Calcular a Concentração de Atividade Enzimática (U/mL) e a Atividade específica 
(U/mg) do lisado de Saccharomyces cerevisiae. 
 
 
TABELA PARA O MONTAGEM DA 
CURVA-PADRÃO DE PROTEÍNA 
tubos massa de proteína Abs595 
 (mg) --- 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
 
Equação de reta: y = ax + b 
coeficiente angular = a 
Intercepto no eixo y = b 
 
TABELA PARA O CÁLCULO DACONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NO LISADO DO 
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 
tubos A595 
Massa de proteína 
calculdada 
utilizando a curva-
padrão 
Volume da 
amostra 
concentração 
Diluição 
prévia 
concentração 
do lisado original 
(sem diluição) 
 (mg) (mL) (mg/mL) (x) (mg/mL) 
 
A1 0,10 
A2 0,05 
A3 0,03 
A4 0,02 
 
TABELA PARA O CÁLCULO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
 L10x L50X L500x 
tubos Tempo A420 produto A420 produto A420 produto 
 (min) (nmol) (nmol) (nmol)1 5 
2 10 
3 15 
4 20 
 
 
 
 
 
12 
Prática 5: Simulação computacional de purificação de 
proteínas 
 
 
Objetivo 
Assimilar os fundamentos das diferentes técnicas cromatográficas empregadas na purificação de 
proteínas e simular tentativas de purificação de algumas delas. 
 
Procedimento: 
Cada grupo deverá tentar purificar uma proteína. As proteínas são identificadas por números, assim 
a proteína indicada para cada grupo é definida pelo “número do grupo” +1. Logo, o grupo 1 deverá 
purificar a proteína 2, já o grupo 2 deverá purificar a proteína 3 e assim por diante. 
Ao final da purificação, cada grupo deverá apresentar uma lista com as informações essenciais do 
processo de purificação que foi desenvolvido. 
São consideradas informações essenciais: 
Precipitação com sulfato de amônio: concentração final de (NH4)2SO4, material escolhido 
(sedimento ou sobrenadante) 
Cromatografia de hidrofobicidade: nome da coluna, concentração inicial e final do gradiente de 
(NH4)2SO4, números das frações coletadas 
Cromatografia de troca iônica: nome da coluna, pH, concentração inicial e final do gradiente de 
NaCl, números das frações coletadas 
Filtração em gel: nome da coluna e números das frações coletadas 
Ao final da lista, os dados de recuperação e enriquecimento deverão ser apresentados. 
 
Exemplo da lista de informações a serem entregues para proteína 1: 
Passo 1 – Precipitação com sulfato de amônio 
Concentração inicial: 0 – concentração final: 50% 
Material escolhido: sedimento 
 
Passo 2 – Cromatografia de hidrofobicidade 
Coluna: Phenyl sepharose 
Concentração inicial: 1,7 M – Concentração final: 0 
Frações coletadas: 50 a 53 
 
Passo 3 – Cromatografia de troca iônica 
Coluna: Q sepharose 
Concentração inicial: 0 – Concentração final: 1M 
Frações coletadas: 12 a 15 
 
Recuperação final: 97,5% (8389U) 
Enriquecimento final: 19,2x (330,8 U/mg) 
 
Avaliação final: concluir se com estes passos foi possível ou não purificar totalmente a 
proteína. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
 
Prática 6: Cromatografia para purificação de glicosidase do 
lisado 
 
Objetivo 
Isolar a alfa-glicosidase utilizando coluna contendo uma resina de troca iônica. 
 
Procedimento A – Hidratação da DEAE-Sephadex 
(Executado por monitores ou técnica) 
8. Pesar 0,5 g de DEAE-Sephadex em um béquer. 
9. Adicionar 100 mL de tampão fosfato 10 mM pH 6,8. 
10. Misturar bem utilizando um bastão de vidro. 
11. Decantar de um dia para o outro. 
 
 
Procedimento B – Montagem da coluna de troca iônica 
(Executado por monitores ou técnica) 
 
Montagem da coluna 
1. Utilizar o barril de uma seringa (~ 20 mL) como suporte da resina. 
2. Prender a seringa em um suporte. 
3. Colocar um pouco de lã de vidro no seu interior. 
4. Compactar a lã de vidro na base utilizando um bastão de vidro. 
5. Lavar a coluna com água destilada para retirar fragmentos de lã de vidro. 
6. Adaptar uma mangueira de aproximadamente 6 cm na saída da pipeta. 
7. Fechar a mangueira com uma presilha. 
 
Processo de empacotamento 
8. Fechar a presilha. 
9. Homogeneizar com um bastão de vidro a suspensão contendo a resina (Procedimento A). 
10. Adicionar a suspensão até a marca de 1,0 mL. 
11. Deixar decantar. 
12. Repetir essa operação até a resina sedimentada ocupar o interior da seringa até 1,0 mL 
13. Com a resina empacotada, lavá-la com 20 mL de tampão fosfato 10 mM sem NaCl. 
14. Após a lavagem, fechar a presilha. 
15. Deixar 3 mm de tampão acima do topo da resina. NUNCA DEIXAR A RESINA SECAR. 
 
Procedimento C – Cromatografia de troca iônica 
 
Preparação da amostra 
1. Descongelar o lisado, transferir uma alíquota de 1,0 mL para um tubo “tipo eppendorf” e 
centrifugar a 10.000xg por 13s. Coletar o sobrenadante e usar nas etapas abaixo. 
2. Parte de material (0,4 mL) será usada na cromatografia abaixo, enquanto que o restante (0,6 
mL) deverá ser guardado (congelado) para a próxima aula prática. 
 
Cromatografia em coluna 
 
3. Diluir 0,4 mL do sobrenadante do lisado (ver etapa 1) adicionando 0,6 mL de tampão fosfato 
10 mM sem NaCl. É muito importante que apenas o sobrenadante do lisado seja usado para 
evitar “entupimento” da coluna. 
4. Verificar se a presilha está fechada. 
5. Utilizar uma pipeta para transferir toda a amostra (devidamente diluída) homogeneamente para 
a coluna. 
6. Colocar o tubo 1 na saída da coluna e abrir a presilha. 
7. Deixar a amostra escoar pela coluna até cerca de 3 mm acima do topo da resina. 
8. Fechar a presilha e transferir o tubo 1 para o gelo. 
Eluição das proteínas não retidas pela coluna 
9. Adicionar cuidadosamente tampão fosfato sem NaCl (2 mL). 
10. Colocar o tubo 2 na saída da coluna e abrir a presilha permitindo que o tampão flua pela resina. 
 
14 
11. Coletar 1 mL em cada tubo de ensaio. 
12. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais 1 mL de tampão. 
13. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 8. 
14. Adicionar cuidadosamente mais 1,0 mL de tampão. Assim, acima da resina deverá haver 2,0 
mL de tampão. 
15. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampão. 
16. Ao final da coleta do tubo 10, o tampão deverá estar cerca de 3mm acima do topo da resina. 
Eluição das proteínas retidas pela coluna 
17. Adicionar cuidadosamente tampão fosfato com NaCl (2,0 mL). 
18. Abrir a presilha e permitir que o tampão flua pela resina. 
19. Coletar 1,0 mL (mililitro) em cada tubo de ensaio. 
20. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais 1 mL de tampão 
21. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 18. 
22. Adicionar 1,0 mL de tampão. Assim, acima da resina deverá haver 2,0 mL de tampão. 
23. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampão. 
24. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 20. Não deixar a coluna secar. 
 
Procedimento D – Identificação das frações eluídas da cromatografia que contêm a -
glicosidase 
 
MANTER OS TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
 
1. Preparar um conjunto de tubos numerados de 1 a 20. Adicionar em cada tubo 0,2 mL de NPGlc 
Transferir os tubos em banho de gelo. 
2. Adicionar em cada um destes tubos 0,2 mL das frações coletadas durante a cromatografia. 
3. Transferir todos os tubos 1-20 ao mesmo tempo para um banho de 30oC. 
4. Incubar os tubos por 10 min. 
5. Ao remover os tubos, adicionar em cada um 2 mL de tampão carbonato-bicarbonato pH 11,0. 
6. Agitar manualmente 
7. Deixar os tubos em temperatura ambiente. 
8. Usar água para calibrar (zerar) o espectrofotômetro usando água. 
9. Ler as absorbâncias a 420 nm 
10. Completar a Tabela 4. 
11. Construir um gráfico Absorbância versus números dos tubos (perfil cromatográfico). 
12. Uma vez identificados as frações que contém atividade enzimática neste perfil, juntá-
las em um tubo “Falcon” identificado como MATERIAL DEAE-grupo X e guardá-las para 
os próximos procedimentos. 
 
Tabela 4 
tubos A420 tubos A420 
1 11 
2 12 
3 13 
4 14 
5 15 
6 16 
7 17 
8 18 
9 19 
10 20 
 
15 
 
 
Procedimento E – Determinação das atividades enzimáticas do LISADO e do MATERIAL 
DEAE 
 
a) Diluição do sobrenadante do lisado de Saccharomyces cerevisiae 
 
MANTER OS TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
 
Deve ser utilizado o procedimento de diluição que proporcionou o melhor resultado na prática 4. 
 
 
B) Determinação da atividade da -glicosidase no sobrenadante do lisado 
 
MANTER OS TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
Todos os tubos deste ensaio podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento 
sempre pela adição do substrato. Somente quando todos os tubos já tiverem recebido o substrato 
deverá ser iniciada a adição do sobrenadante do lisado previamente diluído. 
 
12. Preparar os tubos em banho de gelo. 
13. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc estipulados na Tabela 1 e 2. 
14. Adicionar em cada tubo o sobrenadante do lisado devidamente diluído. 
15. Transferir todos os tubosao mesmo tempo para o banho a 30oC. 
16. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 1. 
17. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 mL de tampão 
carbonato-bicarbonato pH 11,0. 
18. Agitar manualmente 
19. Deixar os tubos em temperatura ambiente. 
20. Usar a água para calibrar (zerar) o espectrofotômetro. 
21. Uma vez que todos os tubos tenham sido retirados, ler as absorbâncias a 420 nm dos seus 
conteúdos. 
22. Completar a Tabela 3. 
 
Tabela 1 
tubos 
NPGlc 4 mM 
(mL) 
Sobrenadante 
do lisado 
diluído 
(mL) 
Tempo de 
incubação a 30°C 
(min) 
1 0,2 0,2 5 
2 0,2 0,2 10 
3 0,2 0,2 15 
4 0,2 0,2 20 
Branco de Enzima --- 0,2 20 
 
Tabela 2 
tubo 
NPGlc 4 mM 
(mL) 
Água 
destilada 
(mL) 
Tempo de 
incubação a 30°C 
(min) 
A420 
Branco de Substrato 0,2 0,2 20 
 
Tabela 3 
tubos A420 
1 
2 
3 
4 
BE 
 
23 – Com os dados obtidos determinar a concentração de atividade enzimática de -glicosidase 
(U/mL) presente no sobrenadante do lisado. 
 
 
16 
 
 
 
 
C) Determinação da atividade da -glicosidase no material DEAE 
 
1. Dilua 10x o MATERIAL DEAE seguindo o procedimento sugerido abaixo 
Transferir 0,2 mL do MATERIAL DEAE para um tubo identificado com DEAE-10X. 
Adicionar 1,8 mL de água destilada. 
Homogeneizar suavemente 
Manter no gelo 
 
2. Adicionar em cada tubo de ensaio os volumes de NPGlc e MATERIAL DEAE (diluído 10x) 
estipulados na Tabela 5. Preparar os tubos em banho de gelo. 
3. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho a 30oC. 
4. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 5. 
5. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 mL de tampão carbonato-
bicarbonato pH 11,0. 
6. Deixar os tubos em temperatura ambiente. 
7. Usar água para calibrar (zerar) o espectrofotômetro. 
8. Uma vez que todos os quatro tubos tenham sido retirados, ler as absorbâncias a 420 nm. 
9. Completar a Tabela 6. 
10. Calcular a atividade da -glicosidade no Material DEAE. 
 
 
Tabela 5 
tubos 
NPGlc 4 mM 
(mL) 
material DEAE 
(diluído 10x) 
(mL) 
tempo 
(min) 
1 0,2 0,2 5 
2 0,2 0,2 10 
3 0,2 0,2 15 
4 0,2 0,2 20 
 
Tabela 6 
tubos 
 
A420 
nmols 
de 
produto 
Tempo 
(min) 
1 
2 
3 
4 
 
 
Procedimento F – Dosagem de proteínas no material DEAE 
Atenção – O material DEAE não deve ser diluído. 
 
8. Adicionar em cada tubo os volumes de água e material DEAE estipulados na Tabela 7. 
9. Adicionar o reagente de Bradford. 
10. Homogeneizar em vórtice 
11. Aguardar 5 minutos 
12. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotômetro. 
13. Ler as absorbâncias a 595 nm. 
14. Completar a Tabela 8 
Tabela 7 
tubos 
material 
DEAE 
(mL) 
água 
(mL) 
reagente de 
Bradford 
(mL) 
branco - 0,1 1,0 
1 0,1 - 1,0 
2 0,1 - 1,0 
3 0,1 - 1,0 
 
 
17 
 
 
Tabela 8 
tubos 
A595 Massa de 
proteína 
(mg) 
Volume da 
amostra 
(mL) 
Concentração 
de proteína 
(mg/mL) 
1 
2 
3 
 
 
 
Tratamento de Dados e Análise dos Resultados 
PRÁTICA 6 - PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
Cálculos e Gráficos 
1. Construir o gráfico necessário para a determinação da concentração de atividade enzimática de 
alfa-glicosidase no material DEAE. Expressar os resultados em mU/mL 
 
2. Em seguida, baseado na determinação da concentração de proteínas (mg/mL) feita no material 
DEAE, determinar a atividade específica de alfa-glicosidase (mU/mg) do material DEAE. 
 
3. Calcular a recuperação e o enriquecimento da atividade de alfa-glicosidase após a cromatografia 
de troca iônica. 
 
18 
Prática 7: Caracterização do material DEAE por SDS-PAGE 
 
Objetivos 
Determinar o perfil proteico do material que contém -glicosidase eluído na cromatografia de troca-
iônica. 
 
solução A 
acrilamida 29,2 g 
N’N’bis metilenoacrilamida 0,80 g 
água qsp 100 mL 
 
solução B 
tris 1,5 M pH 8,8 
(acertar valor de pH com HCl) 
 
solução C 
tris 0,5 M pH 6,8 
(acertar valor de pH com HCl) 
 
tampão de amostra 
água 3,55 mL 
solução C 1,25 mL 
glicerol 2,50 mL 
SDS 100 g/L 2,00 mL 
azul de bromofenol 5 g/L 0,20 mL 
-mercaptoetanol 0,05 mL 
 
tampão de corrida 
tris 3,03 g 
glicina 14,4 g 
SDS 1,0 g 
água qsp 1 L 
Obs.: Não acertar o pH desta solução tampão. 
 
solução de coloração 
Coomassie blue R® 0,1 g 
metanol 40 mL 
ácido acético 10 mL 
água qsp 50 mL 
 
solução de descoloração 
metanol 40 mL 
ácido acético 10 mL 
água qsp 50 mL 
 
 
Procedimento A – Preparação das amostras 
 
1. Aplicar as seguinte amostras no gel de SDS-PAGE: 
a. lisado de Saccharomyces cerevisiae (30 microlitros); 
b. frações eluídas na cromatografia de troca-iônica e que contém alfa-glicosidase, 
denominado Material DEAE (maior volume possível até 1 mL) 
 
Diálise das amostras 
2. Transferir para um microtubo o volume indicado de amostra. 
3. Identificar o microtubo com: 
a. Nome da amostra. 
b. Número do grupo. 
4. Adicionar água, caso necessário, até completar 600 L. 
5. Cobrir o microtubo com um pedaço de membrana de diálise. 
6. Prender a membrana de diálise com um anel de borracha. 
7. Transferir o microtubo para um suporte de isopor. 
8. Colocar o suporte dentro de um béquer contendo água. 
 
19 
9. Manter sob agitação por pelo menos 16 horas. 
 
Secagem a vácuo (Executado pelos monitores) 
10. Após a diálise, transferir as amostras para um concentrador a vácuo. 
11. Secar as amostras. 
 
Desnaturação das proteínas presentes nas amostras 
12. Transferir para cada microtubo 20 L de tampão de amostra. 
13. Transferir os microtubos para um banho fervente. 
14. Incubar os microtubos por 5 min. 
15. Retirar os microtubos. 
16. Aplicar as amostras no gel de eletroforese com o auxílio de micropipetadores. 
 
 
Procedimento B – Preparação do gel de SDS-PAGE (Feito pelas técnicas) 
 
Preparação do gel de separação 
1. Adicionar em um tubo os volumes estipulados na Tabela 1. 
2. Homogeneizar rapidamente. 
3. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro previamente 
montadas. 
4. Aguardar a polimerização – cerca de 60 min. 
5. Colocar o pente sobre entre as placas de vidro. 
 
Preparação do gel de empilhamento 
6. Após a polimerização do gel de separação, adicionar em outro tubo os volumes estipulados na 
Tabela 2. 
7. Homogeneizar rapidamente. 
8. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro (com o pente) 
contendo o gel de separação polimerizado. 
9. Aguardar a polimerização – cerca de 40 min. 
10. Após a polimerização do gel de empilhamento, retirar cuidadosamente o pente. 
11. Adicionar o tampão de corrida. 
Tabela 1 Tabela 2 
soluções volume soluções volume 
água 4,02 mL água 3,05 mL 
SDS 100 g/L 100 L SDS 100 g/L 50 L 
solução A 3,33 mL solução A 0,65 mL 
solução B 2,5 mL solução C 1,25 mL 
TEMED 5 L TEMED 5 L 
persulfato de amônio 50 L persulfato de amônio 25 L 
 
 
Procedimento C – Eletroforese; coloração e descoloração do gel 
 
1. Correr a eletroforese com 100V, durante aproximadamente 40 min. 
2. Desligar a fonte quando o corante marcador de frente atingir a base do gel. 
3. Desconectar os cabos. 
4. Retirar o gel. 
5. Colocar o gel no frasco contendo a solução de coloração. 
6. Corar o gel por 40 min. 
7. Retirar o gel do frasco de coloração. 
8. Colocar o gel no frasco contendo a solução de descoloração. 
9. Descorar o gel. 
10. Visualizar as bandas de proteínas. 
 
20 
Procedimento D – Desidratação do gel (Opcional) 
 
1. Colocar o gel num frasco contendo água. 
2. Trocar tantas vezes quanto for necessário a água do frasco até a remoção completado ácido 
acético. 
3. Retirar o gel hidratado do frasco com água. 
4. Colocar o gel num frasco contendo solução de glicerol 50 g/L. 
5. Molhar com a solução de glicerol lâminas de celofane natural 
6. Dispor as folhas de celofanesobre placas limpas de vidro. 
7. Colocar os géis sobre as lâminas de celofane devidamente hidratadas e limpas. 
8. Colocar outra folha de celofane previamente hidratada sobre o gel, formando assim um 
sanduíche. 
9. Retirar delicadamente as bolhas de ar que estiverem aprisionados pelas folhas de celofane. 
10. Esticar as folhas e prendê-las. 
11. Deixar secar à temperatura ambiente. 
 
FÓRMULAS ESTRUTURAIS E MASSAS MOLARES 
 
SDS (288,38 g/mol) 
 
O S
O
O
O Na
+
 
TEMED (116,20 g/mol) 
 
N
N
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3 
CONVERSÃO DE PERSULFATO EM ÍON SULFATO 
 
S2O8
2- + e-  SO4
2- + SO4
-* 
REAÇÃO DE 
POLIMERIZAÇÃO DA 
ACRILAMIDA E COM A 
BIS-ACRILAMIDA 
 
 
 
Tratamento de Dados e Análise dos Resultados 
PRÁTICA 7 – CARACTERIZAÇÃO DO MATERIAL DEAE 
 
INSTRUÇÕES: 
1. Identificar a banda correspondente à -glicosidase no gel de SDS-PAGE. 
2. Calcular o provável peso molecular relativo da enzima através dos padrões utilizados 
na eletroforese. 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
Prática 8: Caracterização da alfa-glicosidase isolada: 
Km e Vmax 
 
Objetivos 
Determinar a afinidade (Km) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol--glicosídeo) e a velocidade 
máxima (Vmax) de hidrólise do substrato. 
 
Reagentes Materiais Aparelhagens 
água destilada banho de gelo banho 30oC 
lisado de levedura (P6) cubetas para leitura espectrofotômetro 
p-nitrofenil–-glicosídeo (NPGlc) 1,0 mM 
 em tampão fosfato 100 mM pH 7,0 
pipetadores vórtice 
pipetas 
p-nitrofenil–-glicosídeo (NPGlc) 2,0 mM 
 em tampão fosfato 100 mM pH 7,0 
ponteiras 
suporte para tubos de ensaio 
p-nitrofenil–-glicosídeo (NPGlc) 8,0 mM 
 em tampão fosfato 100 mM pH 7,0 
tubos de ensaio 
 
tampão carbonato-bicarbonato 250 mM 
 pH 11,0 
 
 
tampão fosfato 100 mM pH 7,0 
 
Procedimento A – Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae 
 
OBSERVAÇÃO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
 
UTILIZE A DILUIÇÃO USADA NA PRÁTICA 3. SOMENTE CASO NÃO SEJA POSSÍVEL, 
EMPREGUE O PROCEDIMENTO ABAIXO. NOTE QUE O VOLUME TOTAL NECESSÁRIO SERÁ 
DE 5,0 mL. 
Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do lisado de Saccharomyces 
cerevisiae. 
 
11. Transferir 0,1 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com L10X. 
12. Adicionar 0,9 mL de água destilada gelada. 
13. Homogeneizar SUAVEMENTE. 
14. Transferir 0,5 mL de L10X para um novo tubo identificado com L100X. 
15. Adicionar 4,5 mL de água destilada gelada. 
16. Homogeneizar SUAVEMENTE. 
 
Procedimento B – Medidas de velocidade da reação de hidrólise do substrato 
 
OBSERVAÇÃO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 
 
1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc estipulados na Tabela 1. 
ATENÇÃO: prestar atenção nas diferentes concentrações de substrato. 
 
2. Preparar os tubos em banho de gelo 
3. Adicionar em cada tubo os volume de tampão e lisado (devidamente diluído) estipulados na 
Tabela 1. Agitar manualmente com cuidado. 
4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30oC 
5. Incubar todos os tubos por 40 min (OU PELO DOBRO DO MAIOR TEMPO USADO NA PRÁTICA 3). 
6. Remover todos os tubos do banho. 
7. Adicionar 2 mL de tampão carbonato-bicarbonato. 
8. Deixar os tubos em temperatura ambiente. 
9. Homogeneizar em vórtice. 
10. Usar a água para calibrar (zerar) o espectrofotômetro. 
11. Ler as absorbâncias a 420 nm. 
12. Completar a Tabela 2. 
13. Construir os gráficos necessários para a determinação do Km e Vmax da -glicosidase para o 
substrato utilizado. 
 
22 
 
 
 
Tabela 1 
tubos 
NPGlc 
1,0 mM 
(mL) 
NPGlc 
2,0 mM 
(mL) 
NPGlc 
8,0 mM 
(mL) 
tampão fosfato 
100 mM pH 7 
(mL) 
lisado 
diluído 
(mL) 
1 0,02 - - 0,28 0,10 
2 0,04 - - 0,26 0,10 
3 0,08 - - 0,22 0,10 
4 0,12 - - 0,18 0,10 
5 0,16 - - 0,14 0,10 
6 0,20 - - 0,10 0,10 
7 - 0,16 - 0,14 0,10 
8 - 0,20 - 0,10 0,10 
9 - - 0,10 0,20 0,10 
10 - - 0,13 0,17 0,10 
11 - - 0,15 0,15 0,10 
 
 
Tabela 2 
tubos 
[S] 
(no tubo 
de 
ensaio) 
(mM) 
A420 
nmols de 
produto 
Tempo 
da 
reação 
(min) 
Velocidade 
(nmol/min) 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
11 
 
 
Tratamento de Dados e Análise dos Resultados 
PRÁTICA 8 – CARACTERIZAÇÃO DA GLICOSIDASE ISOLADA 
 
INSTRUÇÕES: 
1-Construir um gráfico de velocidade versus concentração do substrato (dados tabela 2). 
2-Construir um gráfico de 1/v versus 1/[S] 
3-Determinar o Vmax e Km a partir do segundo gráfico 
 
 
23 
Prática 9: Seqüenciamento de proteinas 
 
Objetivos 
Após o isolamento e purificação da -glicosidase de Saccharomyces cerevisiae, um próximo passo 
na sua caracterização seria a análise da estrutura primária, isto é, seu seqüenciamento. Como este 
objetivo é impossível de ser atingido no período disponível em laboratório optou-se por sequenciar 
um dipeptídeo, tomado como modelo. 
Para tanto serão feitas: 
(1) a hidrólise ácida do peptídeo e a cromatografia dos aminoácidos resultantes em camada 
delgada; 
(2) a derivatização do peptídeo com 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNF), sua hidrólise e subseqüente 
cromatografia em camada delgada. 
 
Reagentes Materiais Aparelhagens 
ácido acético borrifador balança 
ácido clorídrico 6M capilares de vidro banho 30oC 
aspartato (Asp) 10 g/L em ácido 
 clorídrico 6M 
cuba de vidro com tampa para 
 cromatografia 
banho fervente 
bloco térmico 
aspartato (Asp) derivatizado lápis bomba de vácuo/pressão 
bicarbonato de sódio (NaHCO3) 
 14g/L 
luvas estufa 
papel de filtro secador 
clorofórmio placas de vidro com sílica-gel de 
 0,25 mm de espessura 
 
2,4-dinitrofluorobenzeno (DNF) 
 50g/L em etanol 
 
proveta 
etanol suporte para tubos 
fenilalanina (Phe) 10 g/L em ácido 
 clorídrico 6M 
tubos com tampa de rosca 
 
fenilalanina (Phe) derivatizada 
prolina (Pro) 10 g/L em ácido 
 clorídrico 6M 
 
 
prolina (Pro) derivatizada 
metanol 
ninidrina 20 g/L em etanol 
peptídeo desconhecido 
sílica-gel 
 
CUIDADOS ESPECIAIS 
 
Usar luvas durante as etapas de aplicação das amostras, 
revelação e manipulação do DNF e ninhidrina. 
 
Não tocar na camada delgada em nenhuma destas etapas. 
 
Não assoprar, falar ou espirrar sobre a camada delgada. 
 
Não inalar o pó que se desprende da placa quando 
manuseada incorretamente. 
 
24 
Procedimento A – Determinação da composição em aminoácidos de um peptídeo 
 
Preparação da fase móvel clorofórmio/metanol/ácido acético 60:30:10 (v/v/v) 
(executado pela técnica) 
1. Adicionar na proveta os volume necessários de clorofórmio, metanol e ácido acético tal que ao 
final haja 50 mL de fase móvel. 
2. Colocar a fase móvel na cuba de vidro contendo um pedaço de papel de filtro na parede da cuba. 
3. Fechar imediatamente a cuba. 
4. Aguardar 10 min para usá-la. 
5. 
Hidrólise total em meio ácido do peptídeo desconhecido (feito pelos monitores). 
6. Pesar 10 mg do peptídeo desconhecido. 
7. Colocá-lo num tubo com tampa de rosca. 
8. Adicionar ao tubo 1 mL de ácido clorídrico 6M. 
9. Fechar o tubo. 
10. Homogeneizar em vórtice. 
11. Transferir o tubo para um bloco térmico a 115oC. 
12. Incubar o tubo por 3h. 
13. Retirar o tubo após esse período. 
14. Resfriar o tubo em temperatura ambiente. 
15. Secar este material em concentrado à vácuo e ressuspender em 1 mL de água. Nestas condições 
está pronto para aplicação na cromatografia de camada delgada 
 
Preparação da placa de sílica 
16. Fazer uma marca com um lápis APENAS nas bordas laterais da placa a 1 cm da borda inferior 
da sílica. Cuidado para não cortar a sílica. A linha imaginária será a origem da aplicação das 
amostras. 
 
Cromatografia em camada delgada 
17. Aplicar na placa como auxílio de um micropipetador, em pontos distintos, cerca de 1 L das 
soluções de aminoácidos e do peptídeo hidrolisado. Manter na bancada até a evaporação do 
solvente 
18. Abrir a cuba contendo a fase móvel. 
19. Colocar a placa contendo as amostras em contato com o solvente. Segurar a placa pela parte 
superior. 
20. Fechar a cuba contendo a fase móvel. 
21. Aguardar até a fase móvel atingir 0,5 cm abaixo da borda superior da placa. 
22. Retirar a placa da cuba. 
23. Marcar com o lápis a linha de frente do solvente. 
24. Deixar o solvente evaporar espontaneamente na capela. 
 
Revelação e cálculo do Rf 
25. Apoiar a placa sobre a superfície da capela e segurá-la verticalmente. 
26. Borrifar a solução de ninhidrina sobre toda a placa cerca de 15 cm de distância. Usar luvas 
durante essa etapa. 
27. Colocar a placa na estufa a cerca de 80oC. 
28. Aguardar 10 min. 
29. Retirar as placas da estufa. 
30. Deixar as placas resfriarem. 
31. Medir a distância total percorrida pelo solvente e as distâncias percorridas pelos padrões e 
produtos de hidrólise para a determinação do Rf dos compostos. 
32. O Rf é dado por: 
 
Rf=
distância percorrida pela substância
distância percorrida pelo solvente 
 
25 
Procedimento B – determinação do aminoácido amino-terminal de um peptídeo 
 
Preparação da fase móvel (feito pela técnica) 
Fase móvel: clorofórmio/metanol/ácido acético 95:5:1 (v/v/v). 
1. Adicionar na proveta os volume necessários de clorofórmio, metanol e ácido acético tal que ao 
final haja 50 mL de fase móvel. 
2. Colocar a fase móvel na cuba de vidro contendo um pedaço de papel de filtro na parede da cuba. 
3. Fechar imediatamente a cuba. 
4. Aguardar 10 min para usá-la. 
 
Derivatização do aminoácido amino-terminal do peptídeo desconhecido (feito pelos 
monitores) 
 
5. Pesar 10 mg do peptídeo desconhecido. 
6. Colocá-lo num tubo com tampa de rosca. 
7. Adicionar ao tubo 0,75 mL de bicarbonato de sódio. 
8. Adicionar ao tubo 0,5 mL de DNF. 
9. Fechar o tubo. 
10. Transferir o tubo para um banho a 30oC. 
11. Incubar o tubo por 3h. 
12. Retirar o tubo após esse período. 
13. Resfriar o tubo. 
14. Acidificar o meio com duas gotas de ácido clorídrico 6M. 
15. Transferir o tubo para um concentrador a vácuo (tipo speedvac). 
16. Incubar o tubo por 15 min para secar o etanol. 
17. Retirar o tubo após esse período. 
18. Adicionar ao tubo 1 mL de ácido clorídrico 6M. 
19. Transferir o tubo para um bloco térmico (115° C). 
20. Incubar o tubo por 3h. 
21. Retirar o tubo após esse período. 
22. Resfriar o tubo em temperatura ambiente. 
23. Retirar 20 L de peptídeo derivatizado e adicioná-lo num tubo de ensaio. 
24. Transferir o tubo de ensaio para um concentrador a vácuo (tipo speedvac). 
25. Aguardar a amostra secar completamente. 
26. Retirar o tubo após esse período. 
27. Resfriar o tubo. 
28. Adicionar 20 L de etanol ao tubo contendo o produto seco da hidrólise. 
 
Preparação da placa de sílica 
29. Fazer uma marca com um lápis APENAS nas bordas laterais da placa a 1 cm da borda inferior 
da sílica. Cuidado para não cortar a sílica. A linha imaginária será a origem da aplicação das 
amostras. 
 
Cromatografia em camada delgada 
30. Aplicar na placa com o auxílio de um micropipetador, em pontos distintos, cerca de 2 L dos 
padrões derivatizados de aminoácidos e do peptídeo derivatizado. 
31. Manter na bancada até a evaporação do solvente 
32. Abrir a cuba contendo a fase móvel. 
33. Colocar a placa contendo as amostras em contato com o solvente. Segurar a placa pela parte 
superior. 
34. Fechar a cuba contendo a fase móvel. 
35. Aguardar até a fase móvel atingir 0,5 cm abaixo da borda superior da placa. 
36. Retirar a placa da cuba. 
37. Marcar com o lápis a linha de frente do solvente. 
38. Deixar o solvente evaporar espontaneamente na capela. 
39. Não é necessário aplicar revelador, pois os produtos derivatizados têm cor. 
40. Medir a distância total percorrida pelo solvente e as distâncias percorridas pelos padrões e 
produtos derivatizados para a determinação do Rf dos compostos. 
41. O Rf é dado por: 
Rf=
distância percorrida pela substância
distância percorrida pelo solvente 
 
 
 
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Tratamento de Dados e Análise dos Resultados 
PRÁTICA 9 – SEQUENCIAMENTO DE PROTEÍNAS 
 
INSTRUÇÕES: 
1-Identificar os aminoácidos no hidrolisado peptídico através de cor e valores de Rf 
2- Identificar o aminoácido N-terminal do peptídeo através de cor e valores de Rf 
3-Determinar a sequência do peptídeo 
 
 
 
Fevereiro/2016