Aulas práticas bioquímica

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Hidrólise salivar do amido
O amido é um homopolissacarídeo encontrado em grãos nos vegetais. É uma glucana, pois possui unidades monoméricas de D-glucose.
A amilose é linear helicoidal e possue ligações α1-4 .
A amilopectina é ramificada e possui ligações α1-4 e β1-6. 
 
A amilase é responsável pela quebra de ligações α1-4 por hidrólise, essas ligações glicosídicas são responsáveis por formar compostos lineares.
Os produtos obtidos pela hidrólise são: maltose, matotriose e dextrinas.
Os sais de iodo caracterizam exclusivamente o amido, o formato helicoidal da amilose oclui o iodo em suas hélices formando um composto azul escuro.
O espectofotometro mede quanto de luz a solução absorve. 
Branco: Tampão imidazol, saliva diluída em tampão imidazol e solução de iodo/iodeto de potássio.
0’: Todos os compostos acima + solução de amido.
5’: Banho maria.
10’
15’ 
Ocorreu a degradação do amido pela ação da amilase. Quanto mais tempo no banho maria maior a degradação.
Caracterização da enzima uréase
Carbamato de amônia
O vermelho de fenol mostra quando o carbonato de amônia foi formado:
Amarelo pH ≤ 7 ≥ pH Vermelho
Reação do Biureto: Hidróxido de Na+Cu.
Urease + H2O + reativo do biureto: A coloração violeta caracteriza a presença de proteína ou peptídeo.
H2) + reativo do biureto: Não foi formada a coloração violeta.
Teste de atividade da enzima: 
H2O, uréase, ácido nítrico’: A proteína desnatura por extremo de pH formando uma película branca (ácido nítrico precipitado).
Tampão fosfato, uréase, vermelho de fenol. Incubar 5’: Formação do carbamato de amônia eleva o pH tornando a solução avermelhada.
 Efeito do calor/desnaturação:
H2O, uréase, vermelho de fenol. Ferver por 2’: não houve formação do carbamato de amônia devido a inativação da uréase pelo calor.
H2O, uréase. Ferver por 2’: Precipitação no tubo pela desnaturação da uréase pelo calor.
 Efeito de sais de mercúrio:
H2O, Urease, Cloreto de mercúrio 0,01%, tampão fosfato com 1% de ureia, vermelho de fenol. Incubar 5’: Os sais de mercúrio reagem com os grupos SH da urease não permitindo o encaixe ao substrato, pois mudou a conformação do sítio de ação, promovendo uma inibição irreversível.
Especificidade da enzima:
Tampão fosfato com 1% de tioureia, urease, vermelho de fenol. Incubar 5’: O mercúrio se liga em sulfidrila, muda a conformação do sítio de ação não permitindo o encaixe ao substrato, promovendo uma inibição irreversível.
Método diagnóstico para úlcera e gastrite: Antes do exame um líquido com uréia com o carbono marcado é ingerido, a uréase da bactéria H. pylori reage o produz CO2 marcado. Pode também se fazer um biopsia de pedaço do estomago e testar em tubo de ensaio. 
Determinação da glucose no sangue
Hipoglicemia: Jejum, hiperinsulinismo (tumores pancreáticos), alcoolismo. 
Hiperglicemia: Diabetes, estado de intolerância à glucose, hipertireoidismo, hiperpituarismo, hiperadrenocorticismo.
Valores de referência:
	Glucose mg/dL
	
	60 – 99
	Normal
	100-125
	Alterado (pré-diabetes/ síndrome metabólica)
	≥125
	Diabetes
	*Pós-refeição 120-150 é normal
Método: Teste enzimático-colorimétrico.
A glucose oxidase (GOD) catalisa a oxidação da glucose para ácido glicônico e peróxido de hidrogênio. Através de uma reação oxidativa de acoplamento catalisada pela peroxidase (POD), o peróxido de hidrogênio formado reage com aminoatipirina e fenol, formando um complexo de cor vermelha (quinoneimina) cuja absorbância medida (espectofotômetro) em 500nm é diretamente proporcional à concentração de glucose na amostra.
Tubo branco (reagente), padrão (concentração conhecida de glucose) e amostra.
GOD: GLUCOSE + ½ H2O → ÁCIDO GLICÔNICO +H2O2
POD: 2 H2O2 + 4-AMINOANTIPIRINA + FENOL → QUINONEIMINA + H20
Determinção da alanina transaminase
ALT: Presente em grande concentração no fígado e em menor concentração no coração e rins. Está presente no citoplasma dos hepatócitos (90%), e na mitocôndria (10%). Com o rompimento dos hepatócitos devido a hepatites, cirrose, isquemia cardíaca, miosite ou tumor hepático ira ocorrer o aumento da ALT sérica. 
A ALT catalisa especificamente a transferência do grupo amina da alanina para o cetoglutarato com formação de glutamato (irá para mitocôndria realizar o ciclo da ureia) e piruvato (ciclo do ácido cítrico) que será reduzido a lactato pela lactato dsidrogenase, e o NADH será oxidado a NAD.
AST: Aspartato transaminase. Presente na mitocôndria. 
Na cirrose alcoólica os valores de ALT e AST podem estar abaixo do normal.
Valores de referência da ALT:
 
	Homem
	11-45U/L
	Mulher
	10-37U/L
	
ALT= variação da absorbância/minutos x 1746
	ALT > AST
	Lesão mais extensa e menos profunda
	AST>ALT
	Lesão mais profunda
L-ALANINA + α-CETOGLUTARATO →ALT→ PIRUVATO + L-GLUTAMATO
PIRUVATO + NADH →LDH→NAD + L-LACTATO
A monitoração da redução da absorbância em 340nm é consequência da oxidação do NADH, sendo diretamente proporcional a ALT na amostra.
Tampão + Coenzima + Amostra: Ler. Incubar por 3’: Ler. Calcular.
Determinação de HDL Colesterol no sangue
A determinação do colesterol ligado às lipoproteínas é útil na investigação das dislipidemias e faz parte da avaliação do risco de doença coronariana isquêmica. 
As lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL) e as lipoproteínas de baixa densidade (LDL) são quantitativamente precipitadas e, após centrifugação, o colesterol ligado às lipoproteínas de alta densidade (Colesterol HDL) é determinado no sobrenadante. 
	mg/dL 
	 Desejável 
	 Risco moderado 
	 Alto risco 
	 
	 Colesterol LDL 
	 < 130 
	 130 – 159 
	 ≥ 160 
	 
	 Colesterol total 
	 < 200 
	 200 – 239 
	 ≥ 240 
	 
	 Colesterol HDL 
	 > 55 
	 35 - 55 
	 < 35 
	 
Fórmula de Friedewald: LDL = COLt – (HDL+VLDL)
HDL = absorbância do teste/absorbância do padrão x40