Colesterol Total __ Plataforma A

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Roteiro
INSTRUÇÕES GERAIS
1. Neste experimento, você irá aprimorar seus conhecimentos
sobre dosagem bioquímica do colesterol total por meio de uma
reação colorimétrica. Esta técnica é realizada através de um
método analítico que se baseia na interação da matéria com a
radiação eletromagnética, calculando o quanto é absorvido e
quanto é transmitido, com o uso do espectrofotômetro.
2. Utilize a seção “Recomendações de Acesso” para melhor
aproveitamento da experiência virtual e para respostas às
perguntas frequentes a respeito do Laboratório Virtual.
3. Caso não saiba como manipular o Laboratório Virtual, utilize o
“Tutorial” presente neste Roteiro.
4. Caso já possua familiaridade com o Laboratório Virtual, você
encontrará as instruções para realização desta prática na
subseção “Procedimentos”.
5. Ao finalizar o experimento, responda aos questionamentos da
seção “Avaliação dos Resultados”.
RECOMENDAÇÕES DE ACESSO
DICAS DE DESEMPENHO
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Para otimizar a sua experiência no acesso aos laboratórios
virtuais, siga as seguintes dicas de desempenho:
. Feche outros aplicativos e abas: Certifique-se de fechar
quaisquer outros aplicativos ou abas que possam estar
consumindo recursos do seu computador, garantindo um
desempenho mais eficiente.
. Navegador Mozilla Firefox: Recomendamos o uso do
navegador Mozilla Firefox, conhecido por seu baixo
consumo de recursos em comparação com outros
navegadores, proporcionando uma navegação mais fluida.
. Aceleração de hardware: Experimente habilitar ou desabilitar a
aceleração de hardware no seu navegador para otimizar o
desempenho durante o acesso aos laboratórios virtuais.
. Requisitos mínimos do sistema: Certifique-se de que seu
computador atenda aos requisitos mínimos para acessar os
laboratórios virtuais. Essa informação está disponível em
nossa Central de Suporte.
. Monitoramento do sistema: Utilize o Gerenciador de Tarefas
(Ctrl + Shift + Esc) para verificar o uso do disco, memória e
CPU. Se estiverem em 100%, considere fechar outros
aplicativos ou reiniciar a máquina para otimizar o
desempenho.
. Teste de velocidade de internet: Antes de acessar, realize um
teste de velocidade de internet para garantir uma conexão
estável e rápida durante o uso dos laboratórios virtuais.
. Atualizações do navegador e sistema operacional: Mantenha
seu navegador e sistema operacional atualizados para
garantir compatibilidade e segurança durante o acesso aos
laboratórios.
PRECISA DE AJUDA?
Em caso de dúvidas ou dificuldades técnicas, visite nossa Central
de Suporte para encontrar artigos de ajuda e informações para
usuários. Acesse a Central de Suporte através do link:
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aqui para ajudar! Conte conosco!
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OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM
. Aplicar a técnica para realizar a análise de colesterol;
. Analisar os resultados da espectrofotometria, correlacionando
a absorbância com a concentração de colesterol;
. Determinar a concentração de colesterol total na amostra.
Bem-vindo(a) ao Laboratório de
Bioquímica!
Nesta prática, será realizada a análise de
colesterol a partir de uma amostra de
soro, utilizando o espectrofotômetro
para medir a absorbância da solução.
DESCRIÇÃO DO LABORATÓRIO
MATERIAIS NECESSÁRIOS
. Banho-maria;
. Caneta marcadora;
. Cubeta;
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. Espectrofotômetro;
. Kit Colesterol total (reagente de trabalho e solução padrão de
colesterol);
. Micropipeta de 100 µL;
. Micropipeta de 1000 µL;
. Ponteira para micropipeta;
. Recipiente de descarte;
. Suporte para micropipeta;
. Suporte para tubo de coleta;
. Suporte para tubo de ensaio;
. Tubo de coleta com amostra de soro;
. Tubo de ensaio.
PROCEDIMENTOS
Iremos iniciar a prática de
Colesterol Total!
Este laboratório tem como objetivo
proporcionar uma compreensão do
processo de quantificação do colesterol
total, um teste amplamente utilizado na
prática clínica e em laboratórios de
pesquisa. Essa técnica analítica tem
diversas aplicações, incluindo o
desenvolvimento de medicamentos,
estudos sobre fatores de risco para
doenças crônicas e avaliação da eficácia
de tratamentos para controle do
colesterol. A análise de colesterol é
essencial para diagnosticar e monitorar
doenças cardiovasculares, como
aterosclerose e infarto do miocárdio.
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1. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO
Higienize as mãos na pia e coloque os equipamentos de proteção
individual localizados no “Armário de EPIs”. Nesse experimento, é
obrigatório o uso de jaleco, luvas e óculos de proteção.
O uso de EPIs minimiza riscos
de contaminação e protege
contra produtos químicos.
2. IDENTIFICANDO OS TUBOS E CUBETAS
Identifique o primeiro tubo de ensaio com a sigla A. Identifique o
segundo tubo de ensaio com a sigla B, o terceiro tubo de ensaio
com a sigla P. Em seguida faça a identificação das cubetas.
Identifique a primeira cubeta com a sigla A; identifique a segunda
cubeta com a sigla B, e por fim, identifique a terceira cubeta com
a sigla P.
A correta identificação evita
erros na análise e garante que
cada solução seja medida
corretamente.
3. ADICIONANDO A AMOSTRA
Pipete 1000 µL do reagente de trabalho.
O reagente de trabalho contém
substâncias químicas, incluindo
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a colesterol oxidase, reagente
cromogênico (geralmente
contendo uma substância como
o 4-aminofenazona), peroxidase,
entre outros que, em presença
de colesterol, geram uma reação
colorida.
Transfira a solução pipetada para o tubo de ensaio B (branco). Em
seguida, pipete novamente 1000 µL do reagente de trabalho e
transfira para o tubo B.
Este tubo é utilizado como
controle e contém apenas o
reagente de trabalho. Ele é
usado para ajustar o
espectrofotômetro.
Repita as etapas de pipetagem, transfira 2000 µL do reagente de
trabalho para o tubo de ensaio P e transfira 2000 µL do reagente
de trabalho para o tubo de ensaio A. Descarte a ponteira. Ajuste
o volume da micropipeta de 100 µL para 20 µL. Pipete 20 µL da
solução padrão e transfira a solução pipetada para o tubo de
ensaio P (padrão).
Neste tubo, além do reagente
de trabalho, contém a solução
padrão de colesterol (solução
com concentração conhecida de
colesterol). Ele é usado para
gerar uma curva de calibração e
comparar a concentração de
colesterol na amostra
desconhecida com a solução de
referência.
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Descarte a ponteira e pipete 20 µL da amostra de soro.
O soro coletado contém
substâncias do sangue, entre os
quais o colesterol. O objetivo da
prática é justamente medir a
concentração de colesterol
presente nesse soro.
Transfira a amostra pipetada para o tubo de ensaio A (amostra) e
descarte a ponteira.
Este tubo contém reagente de
trabalho e a amostra de soro
que será analisada para
determinar a concentração de
colesterol.
Homogeneíze a solução agitando o tubo por 20 segundos.
A homogeneização garante que
todos os componentes da
solução estejam bem
misturados.
Mova os tubos para o banho-maria.
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A temperatura controlada é
essencial para a atividade
enzimática, garantindo que as
reações ocorram
adequadamente.
Ligue o banho-maria e aguarde por 10 minutos.
A reação de oxidação do
colesterol inicia conforme a
reação:
O peróxido de hidrogênio
(H₂O₂), formado na primeira
reação, reage com um reagente
cromogênico, em presença de
peroxidase, para gerar uma
substância colorida.
Retire os tubos de ensaio do banho-maria.
Observe a mudança de
coloração para rosa escuro. A
cor visível gerada pela reação no
experimento será variada, indo
de um tom de rosa a vermelho,
dependendo da concentração
de colesterol presente na
amostra.
Colesterol + O2
colesteroloxidase
C24H40O5 +
H2O2
−→
H2O2 + reagentecromogên
ico
peroxidase
corante(subpr
odutocolorido) + H2O
−→
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4. REALIZANDO A LEITURA NO ESPECTROFOTÔMETRO
O espectrofotômetro mede a
absorção da luz pela substância
colorida produzida, a partir de
um comprimento de onda
específico (característica da luz,
que define sua cor), o que dá
uma medida objetiva e exata da
concentração de colesterol.
Ligue o espectrofotômetro e configure o comprimento de onda
para 505 nm.
A escolha do 505 nm ocorre
porque é o comprimento de
onda onde se obtém a máxima
absorção para esse tipo de
reação, garantindo a melhor
precisão na medição da
concentração de colesterol.
Abra o equipamento. Pipete 1000 µL do conteúdo do tubo B e
transfira o conteúdo para a cubeta B. Descarte a ponteira.
Coloque a cubeta do branco (B) no equipamento e feche o
equipamento. Zere o equipamento. Abra e retire a cubeta do
espectrofotômetro.
Essa cubeta contém coloração
mais clara, pois se trata do
branco. O objetivo é ajustar o
equipamento, composto apenas
pelos reagentes, sem a amostra
de interesse para eliminar
qualquer interferência causada
pelo solvente ou pelo reagente,
que poderiam absorver luz em
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determinados comprimentos de
onda.
Em seguida, pipete 1000 µL do conteúdo do tubo P e transfira o
conteúdo para a cubeta P. Descarte a ponteira.Coloque a cubeta
com a solução padrão (P) no espectrofotômetro, feche o
equipamento e realize a leitura. Retire a cubeta P.
A cubeta P contém a solução
padrão com concentração
conhecida de colesterol. O valor
de absorbância medido será
usado para calibrar a relação
entre a intensidade da cor e
concentração de colesterol.
Pipete 1000 µL do conteúdo do tubo A e transfira o conteúdo
para a cubeta A. Descarte a ponteira. Coloque a cubeta com a
amostra (A) e realize a leitura. Abra o equipamento e retire a
cubeta. Feche o equipamento.
A cubeta A contém a amostra de
soro com colesterol, e sua cor
gerada pela reação será lida no
espectrofotômetro. O valor de
absorbância da amostra será
utilizado para calcular a
concentração de colesterol na
amostra com base na calibração
feita com o padrão.
Calcule a concentração de colesterol na amostra.
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Utilize a seguinte fórmula para o
cálculo da concentração de
colesterol total na amostra:
Preencha o laudo com o resultado encontrado.
A leitura da cor no
espectrofotômetro permite
determinar a concentração de
colesterol porque a cor gerada
na reação química é
proporcional à quantidade de
colesterol presente na amostra.
A determinação do colesterol total é
essencial na prevenção e controle de
doenças cardiovasculares, uma das
principais causas de morbidade e
mortalidade no mundo.
5. AVALIANDO OS RESULTADOS
Siga para a seção “Avaliação dos Resultados” e responda de
acordo com o que foi observado no experimento, associando
também com os conhecimentos aprendidos sobre o tema.
AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS
Colesterol(mg/dL) =
Abs.amostra
Abs.padrão x200
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1. Explique como a espectrofotometria é utilizada na análise de
colesterol e qual a sua importância para esse experimento.
2. Que enzimas e reações químicas estão envolvidas na
quantificação do colesterol? Como essa reação gera um
composto mensurável?
3. Por que foi utilizado três tubos de ensaio? Qual a finalidade de
cada uma delas?
TUTORIAL
Atenção!
Antes de iniciar o tutorial, é importante
que você leia atentamente o
procedimento descrito acima para
compreender a finalidade de cada etapa.
1. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO
Higienize as mãos clicando com o botão esquerdo do mouse
sobre a pia.
Visualize o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do
mouse na câmera com o nome “Armário de EPIs” localizada
dentro do painel de visualização no canto superior esquerdo da
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tela. Se preferir, também pode ser utilizado o atalho do teclado
“Alt+2”.
Abra o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse
sobre uma das portas.
Selecione o EPI necessário para a realização do ensaio clicando
com o botão esquerdo do mouse sobre ele. Nesse experimento, é
obrigatório o uso de: jaleco, luvas e óculos.
Feche o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do
mouse sobre uma das portas.
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2. IDENTIFICANDO OS TUBOS
Visualize a bancada clicando com o botão esquerdo do mouse na
câmera com o nome “Bancada” ou através do atalho do teclado
“Alt+3”.
Identifique a cubeta e os tubos de ensaio clicando com o botão
esquerdo do mouse sobre a caneta marcadora.
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3. ADICIONANDO A AMOSTRA
Pipete 1000 µL do reagente de trabalho clicando com o botão
direito do mouse sobre a micropipeta e selecione a opção
“Colocar em reagente de trabalho”.
Transfira a solução pipetada clicando com o botão direito do
mouse sobre a micropipeta e selecione a opção: “Colocar em
tubo de ensaio B”.
Repita os procedimentos anteriores, pipete 1000 µL do reagente
de trabalho e transfira para o tubo de ensaio B.
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Repita os procedimentos anteriores, pipete 1000 µL do reagente
de trabalho, transfira para o tubo de ensaio P, pipete 1000 µL do
reagente de trabalho e transfira para o tubo de ensaio P.
Repita os procedimentos anteriores, pipete 1000 µL do reagente
de trabalho, transfira para o tubo de ensaio A, pipete 1000 µL do
reagente de trabalho e transfira para o tubo de ensaio A.
Descarte a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre
a micropipeta e selecione a opção “Trocar ponteira”.
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Ajuste o volume da micropipeta clicando com o botão direito do
mouse sobre a micropipeta e selecione a opção “Reajustar
volume”.
Configure o volume para 20 µL utilizando seu teclado numérico,
em seguida, confirme clicando com o botão esquerdo do mouse
em “OK”.
Pipete 20 µL da solução padrão clicando com o botão direito do
mouse sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em
solução padrão”.
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Transfira a solução pipetada clicando com o botão direito do
mouse sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em tubo
de ensaio P”.
Descarte a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre
a micropipeta e selecione a opção “Trocar ponteira”.
Pipete 20 µL da amostra de soro clicando com o botão direito do
mouse sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em
amostra de soro”.
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Transfira a solução pipetada clicando com o botão direito do
mouse sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em tubo
de ensaio A”.
Descarte a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre
a micropipeta e selecione a opção “Trocar ponteira”.
Homogeneíze o tubo A clicando com o botão esquerdo do mouse
sobre o tubo indicado.
Repita o procedimento anterior, homogeneíze o tubo de ensaio P.
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Ligue o banho-maria clicando com o botão esquerdo do mouse
sobre o banho-maria.
Mova o tubo de ensaio clicando com o botão direito do mouse
sobre o tubo indicado e selecione a opção “Colocar no banho-
maria”.
Repita o procedimento anterior, mova os tubos de ensaio B e P
para o banho-maria.
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Aguarde por 10 minutos ou avance o tempo clicando com o
botão esquerdo do mouse em “Avançar”.
Mova o tubo de ensaio clicando com o botão direito do mouse
sobre o tubo de ensaio indicado e selecione a opção “Colocar no
suporte”.
Repita o procedimento anterior, mova os tubos de ensaio B e P
para o suporte.
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4. REALIZANDO A LEITURA NO
ESPECTROFOTÔMETRO
Visualize o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do
mouse na câmera com o nome “Espectrofotômetro” ou através
do atalho do teclado “Alt+5”.
Ligue o espectrofotômetro clicando com o botão direito do
mouse sobre o aparelho.
Ajuste o comprimento de onda clicando com o botão esquerdo
do mouse sobre o botão indicado.
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Colesterol Total EA󰁭 󰅀
Configure o comprimento de onda para 505 nm utilizando o seu
teclado numérico e confirme clicando com o botão esquerdo do
mouse em “OK”.
Abra a tampa do espectrofotômetro clicando com o botão
esquerdo do mouse sobre o aparelho.
Visualize a bancada clicando com o botão esquerdo do mouse na
câmera com o nome “Bancada” ou através do atalho do teclado
“Alt+3”.
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Colesterol Total EA󰁭 󰅀
Pipete 1000 µL do tubo B clicando com o botão direito do mouse
sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em tubo de
ensaio B”.
Transfira o conteúdo clicando com o botão direito do mouse
sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em cubeta B”.
Descarte a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre
a micropipeta e selecione a opção “Trocar ponteira”.
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Colesterol Total EA󰁭 󰅀
Mova a cubeta B clicando com o botão direito do mouse sobre a
cubeta B e selecione a opção “Colocar no espectrofotômetro”.
Tampe o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do
mouse sobre o equipamento.
Zere o equipamento clicando com o botão esquerdo do mouse
sobre o botão indicado.
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Colesterol Total EA󰁭 󰅀
Abra o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do
mouse sobre o equipamento.
Mova a cubeta para a bancada clicando com o botão direito do
mouse sobre a cubeta e selecione a opção “Colocar na bancada”.
Pipete 1000 µL do tubo P clicando com o botão direito do mouse
sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em tubo de
ensaio P”.
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Transfira o conteúdo clicando com o botão direito do mouse
sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em cubeta P”.
Descarte a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre
a micropipeta e selecione a opção “Trocar ponteira”.
Mova a cubeta P clicando com o botão direito do mouse sobre a
cubeta P e selecione a opção “Colocar no espectrofotômetro”.
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Tampe o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do
mouse sobre o equipamento.
Realize a leitura clicando com o botão esquerdo do mouse sobre
o botão indicado. Anote o valor do resultado da leitura que
aparecer no visor do espectrofotômetro.
Abra o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do
mouse sobre o equipamento.
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Colesterol Total EA󰁭 󰅀
Mova a cubeta para a bancada clicando com o botão direito do
mouse sobre a cubeta e selecione a opção “Colocar na bancada”.
Pipete 1000 µL do tubo A clicando com o botão direito do mouse
sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em tubo de
ensaio A”.
Transfira o conteúdo clicando com o botão direitodo mouse
sobre a micropipeta e selecione a opção “Colocar em cubeta A”.
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Descarte a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre
a micropipeta e selecione a opção “Trocar ponteira”.
Mova a cubeta A clicando com o botão direito do mouse sobre a
cubeta A e selecione a opção “Colocar no espectrofotômetro”.
Tampe o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do
mouse sobre o equipamento.
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Realize a leitura clicando com o botão esquerdo do mouse sobre
o botão indicado. Anote o valor do resultado da leitura que
aparecer no visor do espectrofotômetro.
Abra o espectrofotômetro clicando com o botão esquerdo do
mouse sobre o equipamento.
Mova a cubeta para a bancada clicando com o botão direito do
mouse sobre a cubeta e selecione a opção “Colocar na bancada”.
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Visualize o laudo clicando com o botão esquerdo do mouse sobre
o botão indicado.
Insira o resultado do laudo clicando com o botão esquerdo do
mouse sobre o campo indicado e digite utilizando seu teclado
numérico, em seguida, confirme em “Responder”.
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Colesterol Total EA󰁭 󰅀
Experimento Finalizado!
5. AVALIANDO OS RESULTADOS
Siga para a seção “Avaliação dos Resultados” e responda de
acordo com o que foi observado no experimento, associando
também com os conhecimentos aprendidos sobre o tema.
GABARITO
Os Resultados encontrados foram:
Abs. padrão = 0,104A
Abs. amostra = 0,133A
Assim, o resultado de colesterol foi de aproximadamente
255,769 mg/dL.
Colesterol(mg/dL) = Abs.amostra
Abs.padrão x200
Colesterol(mg/dL) = 0,133
0,104 x200
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