GENETICA 4

Prévia do material em texto

ROTEIRO DO 
LABORATÓRIO 
MORFOFUNCIONAL 
 CURSO DE MEDICINA 
Orientadores: 
Profª Arannadia Barbosa 
Prof. Matheus Alves 
Profª Maiara Marques 
Profª Roberta Carvalho 
Expressão e regulação genica 
OBJETIVO(S): 
1. DEFINIR EXPRESSÃO GÊNICA. 
2. EXPLICAR MECANISMO DE REGULAÇÃO GÊNICA. 
3. EXPLICAR MECANISMO DE REGULAÇÃO NÃO-GÊNICA. 
INTRODUÇÃO 
Os diferentes tipos celulares em um organismo multicelular diferem dramaticamente tanto em 
estrutura como em função. Se compararmos um neurônio de mamíferos com um linfócito, por 
exemplo, as diferenças são tão extremas que é difícil imaginar que as duas células contêm o mesmo 
genoma. Por essa razão, e porque a diferenciação celular frequentemente é irreversível, os biólogos 
originalmente suspeitaram que genes deveriam ser seletivamente perdidos quando uma célula se 
diferencia. Agora sabemos, entretanto, que a diferenciação celular geralmente depende de 
mudanças na expressão gênica ao invés de quaisquer alterações na sequência de nucleotídeos do 
genoma da célula. 
01) COM O AUXÍLIO DOS LIVROS DE BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA, LISTE E 
DESCREVA OS DIFERENTES TIPOS DE POLIMERASES DE DNA, DETALHANDO SUAS 
FUNÇÕES ESPECÍFICAS. 
POLIMERASES DE DNA EM PROCARIONTES (EXEMPLO: E. COLI) 
 DNA Polimerase I: Envolvida na remoção do primer de RNA e preenchimento das lacunas de 
DNA na fita descontínua (lagging strand) durante a replicação. Possui atividade exonuclease 
5’→3’ e 3’→5’ para correção de erros e reparo. Também participa de recombinação e reparo 
do DNA. 
 DNA Polimerase II: Atua principalmente em reparo do DNA e como um backup da DNA 
Polimerase III. Tem atividade exonuclease 3’→5’ para proofreading. 
 DNA Polimerase III: Principal enzima responsável pela replicação do DNA, realizando a síntese 
da maior parte da fita nova. Possui alta processividade e atividade de proofreading (3’→5’ 
exonuclease). É composta por múltiplas subunidades formando complexos que aumentam sua 
eficiência. 
 DNA Polimerase IV e V: Envolvidas principalmente em reparo e síntese translesão durante a 
resposta SOS a danos extensos no DNA, permitindo assim a continuidade da replicação 
apesar da presença de danos. 
POLIMERASES DE DNA EM EUCARIONTES 
 DNA Polimerase α (alfa) 
 Função: Inicia a síntese da nova fita de DNA associando-se à primase para sintetizar 
um primer híbrido de RNA-DNA. É responsável pelo início da replicação. 
 Localização: Encontrada no núcleo celular, associada ao complexo primossomo. 
 Detalhe: A Pol α não possui função proofreading, sua principal tarefa é lançar a cadeia 
iniciante para as polimerases δ e ε continuarem a replicação. 
 DNA Polimerase δ (delta) 
 Função: Principalmente responsável pela síntese da fita descontínua (lagging strand) 
durante a replicação. Possui atividade exonuclease 3’→5’ para correção de erros 
(proofreading). 
 Localização: Núcleo celular, se associa ao fator de alongamento PCNA (proliferating 
cell nuclear antigen) para alta processividade. 
 Detalhe: Além da replicação, a Pol δ participa de diversas vias de reparo do DNA. 
 DNA Polimerase ε (epsilon) 
 Função: Principal enzima para a síntese da fita líder (leading strand) durante a 
replicação do DNA. Também possui proofreading para garantir fidelidade. 
 Localização: Núcleo celular, também interage com PCNA para eficiência. 
 Detalhe: Participa ainda no reparo da fita líder e possível reparo de lesões no DNA. 
 DNA Polimerase β (beta) 
 Função: Envolvida principalmente no reparo do DNA através da via de reparo de 
excisão de base (BER). Não está envolvida na replicação. 
 Localização: Núcleo, atuando em processos de manutenção da integridade genômica. 
 Detalhe: Possui atividade de síntese de DNA com baixa processividade, adequada para 
preenchimento de pequenas lacunas. 
 DNA Polimerase γ (gama) 
 Função: A única DNA polimerase responsável pela replicação e reparo do DNA 
mitocondrial. 
 Localização: Mitocôndrias. 
 Detalhe: Tem atividade proofreading para manter a integridade do genoma mitocondrial, 
que é crítico para a função celular energética. 
OUTRAS POLIMERASES ESPECIALIZADAS 
As polimerases especializadas em eucariotos, pertencentes à família Y, são principalmente 
envolvidas na síntese translesão (TLS), que permite a progressão da replicação apesar da presença 
de danos no DNA que bloqueiam as polimerases replicativas comuns. As mais estudadas são: 
 DNA Polimerase η (eta) 
 Especializada em ultrapassar dímeros de pirimidina (lesões causadas por radiação UV) 
com alta fidelidade. 
 Atua diretamente nas regiões do DNA onde há dano por radiação, permitindo que a 
replicação continue mesmo com esses bloqueios. 
 Tem papel importante na proteção contra mutações induzidas por radiação UV, e sua 
deficiência está associada a xeroderma pigmentoso variante (XPV). 
 DNA Polimerase ι (iota) 
 Possui uma fidelidade relativamente baixa e pode incorporar nucleotídeos incorretos. 
 Sua função exata não é tão bem caracterizada, mas participa da síntese translesão em 
lesões específicas no DNA, contribuindo para a tolerância a danos que bloqueiam a replicação. 
 Atua em conjunto com outras polimerases TLS para aumentar a diversidade de danos 
que podem ser tolerados. 
 DNA Polimerase κ (kappa) 
 Tem capacidade de ultrapassar várias lesões no DNA, como danos causados por 
agentes alquilantes e lesões volumosas. 
 É uma polimerase TLS que tem uma fidelidade maior que a Pol ι, mas ainda menor do 
que as polimerases replicativas convencionais. 
 Participa no bypass de danos no DNA e pode ajudar na prevenção da parada da 
replicação e colapsos do garfo replicativo. 
Mecanismo geral e importância 
 Essas polimerases TLS são menos processivas e menos fiéis que as DNA polimerases 
replicativas tradicionais (α, δ, ε), mas permitem que a replicação prossiga mesmo na presença 
de danos extensos, evitando rupturas e instabilidade genômica imediata. 
 Atuam em substituição temporária das polimerases replicativas bloqueadas, resolvendo 
bloqueios ao longo do DNA e possibilitando reparos posteriores. 
Essas polimerases TLS são cruciais para a manutenção da integridade genômica em condições de 
estresse genotóxico e estão localizadas no núcleo, engajando-se quando ocorre parada da replicação 
por danos no DNA. São muito estudadas em contextos de câncer e doenças genéticas relacionadas à 
resposta ao dano do DNA. 
02) CONSIDERANDO QUE OS EVENTOS DE MODIFICAÇÕES PÓS-TRANSCRICIONAIS DE 
RNA FORAM ABORDADOS NO ROTEIRO ANTERIOR, EXPLIQUE OS MECANISMOS DO 
SPLICING ALTERNATIVO, INCLUINDO EXEMPLOS DE COMO DIFERENTES ISOFORMAS DE 
PROTEÍNAS SÃO GERADAS E JUSTIFICANDO POR QUE TEMOS CERCA DE 25 MIL GENES E 
APROXIMADAMENTE 100 MIL PROTEINAS: 
 
 
O splicing alternativo é um processo complexo e altamente regulado que permite a geração de 
múltiplas variantes de mRNA a partir de um único pré-mRNA, aumentando a diversidade proteica. Ele 
ocorre no núcleo da célula e envolve uma maquinaria molecular chamada spliceossomo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
PASSO A PASSO DO MECANISMO DO 
SPLICING ALTERNATIVO 
1. Reconhecimento dos sítios de splicing 
no pré-mRNA 
O pré-mRNA contém íntrons e éxons. Nos 
íntrons, existem sequências específicas: 
 O sítio de splicing 5’ (5’ SS), na 
extremidade inicial do íntron. 
 O sítio de splicing 3’ (3’ SS), na 
extremidade final do íntron. 
 O ponto de ramificação (branch 
site), localizado cerca de 15-50 nucleotídeos 
antes do 3’ SS. 
 Regiões ricas em pirimidina 
próximas ao 3’ SS que auxiliam no 
reconhecimento. 
2. Formação do Complexo E (inicial) 
O spliceossomo começa se formando com a ligação da pequena ribonucleoproteína nuclear 
(snRNP) U1 ao sítio 5’ do íntron. O fator U2AF (U2 auxiliary factor) reconhece a região rica em 
pirimidina perto do 3’ SS. Ainda nesta etapa, ocorre o reconhecimento do sítio 3’, mas sem gasto 
de energia. 
3. Formação do Complexo A (pré-catalítico) 
A snRNP U2 liga-se ao ponto de ramificação no pré-mRNA, em um processo que requer ATP. 
Issoposiciona o branch point para a catalisação das reações subsequentes. 
4. Recrutamento do Complexo B 
As snRNPs U4, U5 e U6 se juntam à montagem, formando o spliceossomo completo pré-
catalítico. U1 e U4 se desligam, e há rearranjos conformacionais para ativar o complexo para a 
reação química. 
5. Primeira reação de transesterificação 
O spliceossomo catalisa a clivagem do 5’ SS, formando um laço em formato de "lariat" no intron 
ligado através do ponto de ramificação. 
6. Formação do Complexo C e segunda reação 
A segunda reação catalítica remove o intron na extremidade 3’, liberando o lariat intrônico e 
unindo os dois éxons adjacentes. 
7. Liberação e reciclagem 
O mRNA maduro com os éxons unidos é liberado, enquanto o lariat intrônico é degradado e os 
componentes do spliceossomo são reciclados. 
 
 
 
REGULAÇÃO DO SPLICING ALTERNATIVO 
 O spliceossomo é regulado por proteínas chamadas fatores de splicing, que podem ser 
ativadores ou repressores. 
 Essas proteínas se ligam a elementos cis-regulatórios no mRNA: elementos potenciadores 
(ESE/ISE) promovem o uso de certos éxons, enquanto silencers (ESS/ISS) inibem. 
 A localização dessas proteínas e a interação entre elas determinam quais éxons são incluídos 
ou excluídos. 
 Exemplos de fatores incluem as proteínas da família SR (ricas em serina e arginina), que atuam 
como ativadores, e as hnRNPs (heterogêneas ribonucleoproteínas), que 
IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA DO SPLICING ALTERNATIVO 
 Esse processo gera diferentes isoformas de proteínas que podem ter domínios funcionais 
alterados, diferentes locais de expressão, ou atividades regulatórias distintas. 
 Permite que um gene codifique múltiplas proteínas com funções diversas, contribuindo para a 
complexidade do proteoma humano. 
 Regulação fina do splicing alternativo é essencial para o desenvolvimento, diferenciação celular 
e resposta a sinais ambientais. 
 geralmente atuam como repressores. 
 
03) COM O AUXÍLIO DOS LIVROS DA BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA, ESCLAREÇA O TERMO 
“TRANSCRIÇÃO DE DNA CONTROLADA”, COM ÊNFASE NOS 6 PONTOS DE CONTROLE 
APRESENTADOS NA FIGURA ABAIXO: 
ALBERTS, Bruce. Biologia molecular da célula. Porto Alegre: Grupo A, 2017. E-book. ISBN 9788582714232. 
A transcrição de DNA controlada refere-se ao principal ponto onde a célula regula a expressão de 
genes, determinando quais genes do DNA serão transcritos em RNA, quando e em que quantidade. 
Esse controle é fundamental porque evita o gasto de energia na produção desnecessária de RNAs e 
proteínas e permite a diferenciação celular e a resposta a sinais ambientais. 
ETAPAS DE CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA 
A expressão gênica em eucariotos pode ser controlada em seis etapas principais: 
1. Controle transcricional 
 Ocorre no nível do DNA, regulando o início da transcrição de genes em RNA mensageiro 
(mRNA). 
 É o principal ponto de controle da expressão gênica porque previne a produção desnecessária 
de RNA e proteínas. 
 Ocorre via proteínas chamadas fatores de transcrição (ativadores e repressores) que se ligam 
a sequências reguladoras do DNA, promovendo ou bloqueando a montagem da maquinaria de 
transcrição (RNA polimerase e cofatores). 
 No caso de eucariotos, a estrutura da cromatina, modificações em histonas e metilação do DNA 
também influenciam o acesso ao DNA e a regulação gênica. 
 
A remodelagem nucleossômica pode alterar a estrutura do 
nucleossomo, possibilitando que reguladores transcricionais acessem o DNA. Entretanto, ainda 
que na ausência de remodelagem, reguladores transcricionais podem obter acesso limitado ao 
DNA em um nucleossomo. O DNA na extremidade de um nucleossomo “respira”, expondo 
transitoriamente o DNA e permitindo a ligação de reguladores. Essa “respiração” ocorre a uma 
taxa muito mais baixa no centro do nucleossomo; portanto as posições nas quais o DNA sai do 
nucleossomo são mais propensas a serem ocupadas. 
res transcricionais. Se uma proteína reguladora entra no DNA de um nucleossomo e impede que 
esse DNA seja uma vez mais firmemente enrolado ao redor do cerne do nucleossoma, então 
essa proteína irá aumentar a afinidade de um segundo regulador transcricional por uma 
sequência reguladora cis-atuante vizinha. Se, além disso, os dois reguladores transcricionais 
também interagirem um com o outro (como anteriormente descrito), então o efeito cooperativo 
será ainda maior. Em alguns casos, a ação combinada de proteínas reguladoras pode 
eventualmente deslocar o cerne de histonas do nucleossomo por completo. A cooperação entre 
reguladores transcricionais pode se tornar ainda muito maior 
quando complexos de remodelagem de nucleossomos estiverem envolvidos. Se um regulador 
transcricional se liga à sua sequência reguladora em cis e atrai um complexo de remodelagem 
da cromatina, a ação localizada do complexo de remodelagem pode permitir que um segundo 
regulador transcricional se ligue de maneira eficiente na vizinhança. 
2. Controle do processamento de RNA 
 O RNA recém-transcrito (pré-mRNA) sofre modificações antes de estar pronto para exportação e 
tradução. 
 As principais modificações incluem splicing (remoção de íntrons e junção de éxons), adição de 
“cap” 5’ e de cauda poli-A 3’, além de eventuais edições de bases. 
 Splicing alternativo permite a formação de diferentes variantes proteicas a partir do mesmo 
gene, aumentando a diversidade de proteínas geradas por um organismo. 
 O padrão de processamento também pode ser controlado por sinais específicos no RNA e por 
proteínas reguladoras. 
3. Transporte e localização do RNA 
 Depois do processamento, o mRNA precisa ser exportado do núcleo para o citosol para ser 
traduzido em proteína. 
 Apenas mRNAs completamente processados (com “cap” e cauda poli-A) e adequadamente 
montados com proteínas são transportados. 
 Em muitos casos, sinais específicos no mRNA determinam para onde ele será transportado ou 
em que região do citoplasma ficará controlando onde a proteína correspondente será 
sintetizada. 
4. Controle da tradução 
 Regulação de quais mRNAs disponíveis no citosol vão ser realmente traduzidos pelos 
ribossomos em proteínas. 
 Pode envolver proteínas que se ligam ao mRNA e impedem a montagem do complexo de 
iniciação da tradução, microRNAs (miRNAs) que inibem a tradução de mRNAs específicos, ou 
alterações químicas (ex: fosforilação de fatores de iniciação). 
 Sinais nas regiões 5’ UTR e 3’ UTR dos mRNAs frequentemente determinam a eficiência e a 
frequência de tradução para cada transcrito. 
5. Controle de degradação do mRNA 
 A estabilidade dos mRNAs no citoplasma é outro nível crucial de regulação; quanto mais tempo 
um mRNA permanece intacto, mais proteína pode ser produzida a partir dele. 
 mRNAs possuem sequências específicas (geralmente na 3’ UTR) que determinam sua meia-
vida, podendo ser reconhecidas por proteínas ou miRNAs que aceleram ou retardam sua 
degradação. 
 mRNA defeituosos ou desnecessários podem ser rapidamente degradados por mecanismos 
especializados. 
6. Controle da atividade proteica 
 Após a tradução, muitas proteínas ainda precisam ser modificadas para se tornarem ativas (ex: 
fosforilação, acetilação, clivagem proteolítica, etc.). 
 A proteína pode ser ativada ou inativada por sinais, localização intracelular, interação com outros 
compostos, ou degradação direcionada. 
 Esse nível de regulação permite respostas rápidas e finas, já que modifica proteínas já 
existentes em vez de depender de novos ciclos de síntese. 
Cada passo atua como um “filtro”, e a expressão gênica geralmente é regulada por múltiplos 
mecanismos combinados. Para a maioria dos genes, o controle transcricional é o principal, mas as 
outras etapas permitem afinações, resposta rápida e flexibilidade celular. 
 
 
04) COM O AUXÍLIO DOS LIVROS DE BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA, ESCLAREÇA 
COMO OCORRE A EXPRESSÃO GÊNICA. EXPLIQUE O PAPEL DOS ELEMENTOS 
REGULATÓRIOS NESSE PROCESSO: 
 
 
A expressão gênica é o processo pelo qual a informação contida em umgene do DNA é utilizada para 
sintetizar um produto funcional, geralmente uma proteína. Esse processo essencial para o 
funcionamento e desenvolvimento dos organismos envolve duas etapas principais: a transcrição e a 
tradução. 
 
Na transcrição, a enzima RNA polimerase se liga a uma região específica do DNA chamada promotor 
e sintetiza uma molécula de RNA mensageiro (mRNA) complementar à sequência do gene. Depois, o 
mRNA é processado, saindo do núcleo e sendo traduzido no citoplasma pelos ribossomos, onde a 
sequência de nucleotídeos é convertida em uma sequência de aminoácidos que formará a proteína. 
Essa proteína exercerá a função codificada pelo gene. 
 
O processo de expressão gênica é altamente regulado para garantir que os genes sejam ativados ou 
desativados no momento e na quantidade corretos, o que é crucial para a diferenciação celular e a 
adaptação a estímulos. A regulação ocorre principalmente na etapa da transcrição e envolve 
elementos regulatórios localizados no DNA, que podem estar próximos ou distantes do gene que 
controlam. 
 
ELEMENTOS EM CIS (LOCALIZADOS NO MESMO CROMOSSOMO DO GENE REGULADO): 
Essas são as "placas de sinalização" localizadas no próprio DNA, próximas ou distantes do gene que 
elas regulam. Elas não codificam proteínas, mas são sítios de ligação para proteínas regulatórias. 
 Promotores: 
 Estrutura: Geralmente localizados imediatamente a montante (antes) do sítio de início da 
transcrição do gene. Contêm sequências de DNA que são reconhecidas pela maquinaria 
de transcrição basal. 
 Tipos: Existem promotores fortes (que recrutam eficientemente a RNA polimerase, 
levando a alta expressão gênica) e promotores fracos (que resultam em menor 
expressão). 
 Exemplo: A região "TATA box" é um elemento promotor comum em muitos genes, 
servindo como um ponto de reconhecimento para fatores de transcrição e a RNA 
polimerase. 
 Regiões Enhancer (Intensificadores): 
 Localização: Podem estar localizados muito longe do gene que regulam – a montante, a 
jusante, ou até mesmo dentro de íntrons do gene. Sua posição não é tão restritiva quanto 
a dos promotores. 
 Mecanismo de Ação: Atuam ligando-se a proteínas específicas 
chamadas ativadores (um tipo de fator de transcrição). Essa ligação, mediada por 
proteínas intermediárias (como as proteínas do complexo mediador), permite que os 
enhancers "dobrem" o DNA para que os ativadores se aproximem do promotor, facilitando 
a montagem do complexo de transcrição e aumentando a taxa de transcrição. 
 Importância: São cruciais para a expressão gênica em tecidos específicos ou em 
resposta a determinados sinais. Por exemplo, um gene que só precisa ser expresso no 
fígado pode ter um enhancer que só é ativado por fatores de transcrição presentes nas 
células hepáticas. 
 Regiões Silencer (Atenuadores): 
 Localização: Semelhante aos enhancers, podem estar localizados em diversas posições 
em relação ao gene. 
 Mecanismo de Ação: Ligam-se a proteínas específicas chamadas repressores (outro 
tipo de fator de transcrição). Os represores podem funcionar de várias maneiras: 
 Bloqueando fisicamente a ligação de ativadores ao DNA. 
 Competindo com a RNA polimerase ou fatores de transcrição gerais pelo sítio de 
ligação no promotor. 
 Recrutando co-repressores que modificam a estrutura da cromatina (o complexo 
de DNA e proteínas que forma os cromossomos), tornando o DNA menos 
acessível para a transcrição. 
FATORES DE TRANSCRIÇÃO EM TRANS (PROTEÍNAS REGULADORAS QUE SE LIGAM AOS 
ELEMENTOS EM CIS): 
São as proteínas que "leem" e respondem aos sinais dos elementos cis-regulatórios. 
 Fatores de Transcrição (FTs): 
 Domínios: São proteínas com domínios funcionais específicos, como: 
 Domínio de Ligação ao DNA (DBD): Reconhece e se liga a sequências 
específicas de DNA nos elementos cis-regulatórios. Existem diversas "famílias" de 
fatores de transcrição com diferentes DBDs (ex: dedos de zinco, hélice-volta-
hélice, leucina zipper). 
 Domínio de Ativação ou Repressão: Interage com outras proteínas (como 
coativadores, correpressores, a RNA polimerase ou o complexo mediador) para 
modular a taxa de transcrição. 
 Domínio de Ligação a Ligante (opcional): Alguns FTs precisam se ligar a uma 
molécula (como um hormônio ou um cofator) para serem ativados ou desativados. 
 Importância: A combinação de diferentes fatores de transcrição que se ligam a um gene 
específico determina se e como esse gene será expresso. Isso permite a criação de 
padrões complexos de expressão gênica em diferentes tipos celulares e em diferentes 
momentos do desenvolvimento. 
 Coativadores e Correpressores: 
 São proteínas que não se ligam diretamente ao DNA, mas que são recrutadas por fatores 
de transcrição. 
 Coativadores: Ajudam os ativadores a aumentar a transcrição. Eles podem, por exemplo, 
recrutar HATs (histona acetiltransferases), que relaxam a estrutura da cromatina, 
tornando o DNA mais acessível. 
 Correpressores: Ajudam os repressores a diminuírem a transcrição. Eles podem, por 
exemplo, recrutar HDACs (histona deacetilases), que compactam a cromatina, 
dificultando a transcrição. 
 Complexo Mediador: 
 Um grande complexo proteico que atua como uma ponte entre os fatores de transcrição 
ligados aos enhancers/silencers e a maquinaria basal de transcrição (incluindo a RNA 
polimerase) no promotor. Ele integra os sinais recebidos dos diferentes elementos 
regulatórios. 
POR QUE ESSA REGULAÇÃO É TÃO IMPORTANTE? 
 Diferenciação Celular: É a base para que uma célula se torne um neurônio, um cardiomiócito ou 
um hepatócito. Diferentes conjuntos de genes são ativados e desativados em cada tipo celular. 
 Desenvolvimento Embrionário: Padrões precisos de expressão gênica guiam o desenvolvimento 
do embrião, desde a formação de tecidos até a organogênese. 
 Resposta a Estímulos: Células precisam responder a mudanças no ambiente (hormônios, 
nutrientes, estresse). A regulação gênica permite essa adaptação rápida. 
 Manutenção da Homeostase: Garantir que as funções celulares essenciais ocorram de forma 
contínua e equilibrada. 
05) CONSULTE A LITERATURA RECOMENDA E EXPLIQUE COMO ACONTECE O MECANISMO 
DE DEGRADAÇÃO DE MRNA? 
O mecanismo de degradação do mRNA ocorre em etapas coordenadas, que garantem a remoção 
controlada e eficiente do mRNA quando ele já não é mais necessário. Abaixo, as principais etapas 
detalhadas: 
1. Desadenilação (remoção da cauda poli-A) 
 O mRNA possui uma cauda poli-A na extremidade 3’ que protege a molécula da degradação e 
ajuda na estabilidade e tradução. 
 Enzimas chamadas desadenilases encurtam progressivamente essa cauda poli-A, reduzindo sua 
extensão de cerca de 200 a 250 adeninas para cerca de 30-40 nucleotídeos. 
 Essa redução da cauda poli-A sinaliza que o mRNA está prestes a ser degradado. 
 Proteínas ligantes à cauda poli-A (PABP) regulam a atividade das desadenilases, protegendo 
parcialmente o mRNA enquanto necessário e permitindo a degradação quando sinalizado. 
2. Decapagem (remoção do cap 5’) 
 Após a desadenilação, ocorre a remoção do cap 5’ (7-metilguanosina), que é uma modificação 
protetora na extremidade 5’ do mRNA. 
 A decapagem é realizada por um complexo enzimático formado pelas proteínas DCP1 e DCP2. 
 A remoção do cap deixa a extremidade 5’ vulnerável à degradação por exonucleases. 
3. Degradação exonucleolítica 
 Com o cap removido, o mRNA fica exposto para degradação da extremidade 5’ para 3’ pela 
exonuclease XRN1, que gradualmente degrada a molécula. 
 Paralelamente, da extremidade 3’ para 5’, o mRNA pode ser degradado pelo complexo 
enzimático exossoma, que atua degradando a molécula restante. 
4. Endonucleólise 
 Em alguns casos, enzimas endonucleares realizam clivagem interna do mRNA, criando 
fragmentos que são depois degradados pelas exonucleases. 
5. Degradação mediada por microRNAs (miRNAs) 
 Os miRNAs regulam a estabilidade do mRNA pós-transcricionalmente. 
 Formam complexos (como o complexo RISC) que se ligam a regiõesespecíficas no mRNA alvo, 
geralmente na extremidade 3’ UTR. 
 Isso pode levar à inibição da tradução, desadenilação acelerada, decapagem e degradação do 
mRNA pelo exossoma e XRN1. 
Compartimentos envolvidos 
 Esses processos ocorrem principalmente em estruturas citoplasmáticas chamadas P-bodies, que 
são compartimentos especializados contendo enzimas responsáveis pela degradação e 
regulação do mRNA. 
Em resumo, o mRNA é primeiramente marcado para degradação pela remoção da cauda poli-A, 
seguido pela retirada do cap 5’ e depois degradado por exonucleases, com regulação fina pela ação 
de miRNAs e clivagens internas. Esse controle é crucial para o ajuste da quantidade proteica na 
célula conforme suas necessidades e estímulos. 
 
06) COM O AUXÍLIO DOS LIVROS DE BIOLOGIA MOLECULAR, EXPLIQUE O CONCEITO DE 
EPIGENÉTICA E OS PRINCIPAIS FATORES QUE TEM INFLUÊNCIA SOBRE O ENTENDIMENTO 
DO CONCEITO: 
Com a conclusão do projeto do genoma em 2003, existiam grandes expectativas quanto às 
informações da sequência de DNA para fornecer respostas sobre as mutações causais para 
doenças comuns. No entanto, este não foi completamente o caso. Outro achado interessante que 
resultou do projeto do genoma foi que o nível percebido de complexidade dos seres humanos não foi 
acompanhado por um aumento relativo no número de genes quando comparado às 'espécies 
inferiores'. A epigenética é capaz de fornecer respostas para perguntas relacionadas à saúde, 
anteriormente não respondidas, e pode explicar as diferenças no nível de complexidade entre os 
organismos. Os estudos epigenéticos realizados nos últimos anos expuseram um mecanismo 
regulador multicamada muito complexo que é capaz de responder a perguntas intrigantes em 
biologia. A compreensão e a interpretação do papel das modificações epigenéticas no genoma 
humano progrediram rapidamente na última década, com o avanço das tecnologias baseadas em 
microarrays e baseadas em sequência. A interação complexa entre a metilação do DNA, 
modificações de histonas, complexos de proteínas e microRNAs tornou-se mais bem apreciada no 
contexto do controle epigenético local e de longo alcance da transcrição, tanto na diferenciação 
celular normal quanto na tumorigênese. 
Fonte:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20962634/ 
What is epigenetics? https://youtu.be/_aAhcNjmvhc 
 
Epigenetics: Nature vs nurture: https://youtu.be/k50yMwEOWGU 
 
Epigenetics: https://youtu.be/kp1bZEUgqVI 
Introduction to epigenetics: https://youtu.be/IAu44BkOaSs 
*Todos os vídeos estão em inglês, mas é possível usar o recurso legenda (português), nas 
configurações do próprio Youtube 
 
O termo foi originalmente usado por Conrad Waddington para descrever as interações entre genes e 
seus produtos que levam a mudanças fenotípicas. Atualmente, epigenética refere-se especificamente 
às modificações químicas e estruturais que alteram a acessibilidade do DNA à maquinaria celular, sem 
modificar a sequência nucleotídica. Essas alterações são dinâmicas e reversíveis, podendo ser 
transmitidas às células filhas (herança mitótica) e, em alguns casos, a gerações seguintes (herança 
meiótica e transgeracional). 
Principais fatores que influenciam o conceito de epigenética 
1. Modificações químicas do DNA: 
 A metilação do DNA, principalmente na citosina em contextos CpG, é um dos 
mecanismos mais estudados. Essa metilação pode silenciar genes ao impedir a ligação 
de fatores de transcrição ou recrutando proteínas represoras. 
2. Modificações nas histonas: 
 Hidroxilações, metilações, acetilações, fosforilações e outras modificações covalentes nas 
proteínas histonas que enrolam o DNA influenciam a compactação da cromatina. A 
cromatina mais condensada (heterocromatina) é geralmente associada à repressão 
gênica, enquanto a mais aberta (eucromatina) favorece a transcrição. 
 
3. RNAs não codificadores: 
 Pequenos RNAs, como microRNAs (miRNAs), e grandes RNAs não codificadores 
desempenham papel fundamental na regulação pós-transcricional e podem influenciar a 
estrutura da cromatina e a expressão gênica. 
4. Ambiente e estilo de vida: 
 Fatores externos, como dieta, estresse, exposição a toxinas, doenças e até 
comportamentos, podem induzir modificações epigenéticas, influenciando a saúde e o 
desenvolvimento ao longo da vida do organismo. 
 
5. Plasticidade e reversibilidade: 
 As marcas epigenéticas são dinâmicas, apresentando plasticidade que permite aos 
organismos adaptarem a expressão gênica conforme o ambiente e condições internas. 
Importância para a biologia e medicina 
A epigenética explica como células com o mesmo DNA (como em diferentes tipos celulares) podem ter 
funções e expressões gênicas distintas. Também é fundamental para a compreensão de doenças 
complexas, incluindo câncer, doenças autoimunes e transtornos neuropsiquiátricos, onde alterações 
epigenéticas alteram padrões normais de expressão gênica. 
07) COM BASE NOS LIVROS DE BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA, EXPLIQUE 
DETALHADAMENTE OS MECANISMOS DE CONTROLE EPIGENÉTICO DA EXPRESSÃO 
GÊNICA. DÊ ÊNFASE AOS SEGUINTES PROCESSOS: 
A) METILAÇÃO DO DNA 
 Etapa 1: As DNA metiltransferases (DNMTs) adicionam grupos metil (-CH3) na posição 5 da 
citosina, geralmente em dinucleotídeos CpG. 
 Etapa 2: A metilação pode ocorrer de novo (DNMT3A e DNMT3B) ou ser mantida durante a 
replicação (DNMT1, que reconhece o DNA hemimetilado e replica o padrão na nova fita). 
 Etapa 3: A presença do grupo metil impede a ligação de fatores de transcrição e/ou recruta 
proteínas repressoras de metil-CpG, que por sua vez recrutam histona desacetilases e 
metilases. 
 Etapa 4: Resulta na compactação da cromatina numa configuração de heterocromatina, 
reprimindo a transcrição gênica. 
 Importância: Regula padrões de expressão, imprinting, inativação do cromossomo X e 
supressão de elementos transponíveis. 
B) ACETILAÇÃO DO DNA 
 A acetilação ocorre predominantemente nas histonas (ver c). 
 Para o DNA em si, a acetilação direta é rara e pouco descrita; portanto, geralmente o termo 
refere-se à acetilação das histonas que afeta a acessibilidade do DNA. 
C) MODIFICAÇÕES DE HISTONAS (ACETILAÇÃO E METILAÇÃO) 
Acetilação: 
 Etapa 1: Histona acetiltransferases (HATs) transferem grupos acetil (-COCH3) para resíduos de 
lisina nas caudas N-terminais das histonas. 
 Etapa 2: Essa adição neutraliza a carga positiva das lisinas, reduzindo a afinidade das histonas 
pelo DNA negativo. 
 Etapa 3: A cromatina se torna menos compactada (eucromatina), facilitando o acesso da 
maquinaria de transcrição. 
 Etapa 4: Resulta em ativação da transcrição. 
Metilação: 
 Etapa 1: Histona metiltransferases (HMTs) adicionam grupos metil (-CH3) em lisinas ou 
argininas da histona. 
 Etapa 2: Dependendo do resíduo e do número de grupos metil (mono-, di- ou trimetilação), a 
modificação pode ativar ou reprimir a transcrição. 
 Etapa 3: Exemplo: Metilação de H3K4 está associada à ativação gênica; metilação de H3K9 ou 
H3K27 está ligada à repressão e formação de heterocromatina. 
 Etapa 4: Essas marcas funcionam como sinais para recrutamento de outras proteínas 
reguladoras, remodeladoras de cromatina ou complexos repressivos. 
D) RNAS NÃO CODIFICADORES (SIRNA, MIRNA) 
miRNA: 
 Etapa 1: O miRNA é processado de um precursor maior no núcleo e depois no citoplasma, 
formando uma pequena cadeia RNA (~22nt). 
 Etapa 2: Incorporação do miRNA no complexo RISC (RNA-induced silencing complex). 
 Etapa 3: O complexo se liga ao mRNA alvo pela complementariedade parcial na região 3’ UTR. 
 Etapa 4: OmiRNA inibe a tradução ou promove a degradação do mRNA, silenciando o gene pós-
transcricionalmente. 
siRNA: 
 Etapa 1: Deriva de moléculas duplas de RNA (exógenas ou endógenas) processadas por Dicer. 
 Etapa 2: Incorporação ao RISC, com complementariedade perfeita ao mRNA alvo. 
 Etapa 3: Corte e degradação do mRNA, promovendo silenciamento gênico eficaz. 
E) FOSFORILAÇÃO 
 Etapa 1: Quinases específicas adicionam grupos fosfato (PO4) emresíduos de serina, treonina 
ou tirosina nas caudas das histonas. 
 Etapa 2: Essas modificações podem alterar a carga e a estrutura da cromatina, causando uma 
abertura ou fechamento da cromatina dependendo do contexto. 
 Etapa 3: A fosforilação pode desencadear a ativação de genes em resposta a estímulos, 
replicação, reparo no DNA e outras funções celulares. 
F) UBIQUITINAÇÃO 
 Etapa 1: Ubiquitina, uma pequena proteína, é covalentemente ligada a resíduos de lisina nas 
histonas (principalmente H2A e H2B) por enzimases ubiquitina ligases. 
 Etapa 2: A ubiquitinação pode sinalizar remodelação da cromatina para ativação ou repressão 
gênica, alterando a estrutura e o recrutamento de outros fatores. 
 Etapa 3: Além da regulação gênica, pode marcar proteínas para degradação via sistema 
proteassomal, influenciando a estabilidade dos reguladores epigenéticos. 
Esses processos epigenéticos formam um sistema integrado e dinâmico, que controla a expressão 
gênica em resposta ao desenvolvimento, sinalizações ambientais e diferenciação celular, sendo 
essenciais para a manutenção da identidade celular e para o adequado funcionamento biológico. 
 
08) DENTRO DAS BASES GENÉTICAS DO CÂNCER E DE ACORDO COM OS LIVROS DE 
BIOLOGIA MOLECULAR, DEFINIR: 
a) ONCOGENE 
São formas anômalas de genes normais (proto-oncogenes) que regulam os vários aspectos do 
crescimento e da diferenciação celulares. A mutação desses genes pode resultar no estímulo 
contínuo e direto das vias biológicas moleculares (p. ex., receptores do fator de crescimento da 
superfície celular, vias de transdução do sinal intracelular, fatores de transcrição, fatores de 
crescimento secretados) que controlam o crescimento e a divisão celulares, metabolismo celular, 
reparo de DNA, angiogênese e outros processos fisiológicos. 
Há > 100 oncogenes conhecidos que podem contribuir para a transformação neoplásica humana. Por 
exemplo, o gene RAS codifica a proteína ras, que transporta os sinais dos receptores ligados à 
membrana até a via RAS-MAPKinase ao núcleo da célula, e assim regula a divisão celular. As 
mutações podem resultar na ativação inapropriada da proteína ras, causando crescimento celular 
descontrolado. A proteína ras é anormal em cerca de 25% dos cânceres humanos (1). 
Outros oncogenes têm sido implicados em tipos específicos de câncer. Esses incluem 
 HER2 (amplificado no câncer de mama e gástrico e menos comumente no câncer de pulmão) 
 BCR::ABL1 (um gene quimérico presente na leucemia mieloide crônica e em algumas leucemias 
linfocíticas agudas de células B) 
 CMYC (linfoma de Burkitt) 
 NMYC (câncer de pulmão de células pequenas, neuroblastoma) 
 EGFR (adenocarcinoma do pulmão) 
 EML4ALK (um gene quimérico presente no adenocarcinoma do pulmão) 
 KRAS (câncer pancreático, câncer de pulmão) 
Oncogenes específicos podem ter implicações importantes para diagnóstico, terapia e prognóstico 
(ver discussões individualizadas de cada tipo específico de câncer). 
Oncogenes normalmente resultam de 
 Mutações pontuais de células somáticas adquiridas (p. ex., decorrente de carcinogênicos 
químicos) 
 Amplificação gênica (p. ex., aumento no número de cópias de um gene normal) 
 Translocações (nas quais partes de diferentes genes se fundem formando uma sequência única) 
Essas alterações podem aumentar a atividade do produto gênico (proteína) ou alterar sua função. 
Ocasionalmente, a mutação nos genes das células germinativas resulta em herança da predisposição 
ao câncer. 
 
 
 
 
b) PROTO-ONCOGENE 
 Um proto-oncogene é um gene normal que codifica proteínas envolvidas na regulação do ciclo 
celular, crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. 
 Atua como um "acelerador" fisiológico do crescimento celular. 
 Quando sofre mutações pontuais, amplificações ou rearranjos, pode se transformar em 
oncogene, levando a crescimento celular anormal. 
c) GENES SUPRESSORES TUMORAIS. 
 São genes que codificam proteínas responsáveis por inibir a proliferação celular, reparar danos 
no DNA e induzir apoptose, atuando como "freios" no crescimento celular. 
 Sua função normal é prevenir a transformação celular e o desenvolvimento tumoral. 
 A perda ou mutação dos dois alelos (mutações recessivas) desses genes remove esses 
controles, contribuindo para o câncer. 
 Exemplos incluem TP53 (que regula o reparo do DNA e a apoptose), RB1 (controle do ciclo 
celular) e BRCA1/2 (reparo do DNA). 
POSTERIORMENTE, DESCREVA OS MECANISMOS DE APARECIMENTO DOS ONCOGENES A 
PARTIR DE PROTO-ONCOGENES, EXPLICANDO OS PROCESSOS: 
A imagem mostra o desenvolvimento do câncer a partir de eventos que ocorrem ao longo do tempo, 
desde a fertilização até a resistência à quimioterapia, ilustrando as mutações que ocorrem nos genes. 
Mecanismos de aparecimento dos oncogenes a partir de proto-oncogenes: 
1. Mutações pontuais: 
 Alterações em nucleotídeos específicos da sequência do proto-oncogene que levam a 
uma proteína hiperativa ou que não responde aos mecanismos normais de controle. 
Essas mutações podem ativar o proto-oncogene, transformando-o em oncogene. 
 Exemplo: Mutação no gene RAS que impede sua inativação. 
2. Amplificação gênica: 
 Aumento no número de cópias do proto-oncogene no genoma, resultando em 
superexpressão da proteína codificada, que pode promover crescimento celular 
excessivo. 
 Exemplo: Amplificação do MYC e HER2 em alguns cânceres. 
3. Rearranjos cromossômicos: 
 Translocações, inversões ou fusões de partes dos cromossomos que podem ativar um 
proto-oncogene ao colocá-lo sob controle de um promotor mais ativo ou criar uma 
proteína quimérica com nova função oncogênica. 
 Exemplo: Fusão do gene BCR-ABL na leucemia mieloide crônica. 
 
 
4. Expressão anormalmente regulada: 
 Alterações nos elementos regulatórios, como mutações em promotores ou enhancers, 
resultando em ativação excessiva do proto-oncogene. 
Na imagem, as mutações Driver (estrela) são aquelas que conferem vantagem proliferativa e são 
essenciais para a evolução tumoral, enquanto as mutações Passenger (círculo) são neutras e não 
contribuem diretamente para o desenvolvimento do câncer. A resistência à quimioterapia surge por 
mutações que conferem capacidade de sobrevivência às células tumorais apesar do tratamento 
(triângulo na figura). 
Esses processos ocorrem ao longo da vida, sendo influenciados por mutações espontâneas ou 
induzidas pelo ambiente e estilo de vida, levando a expansão clonal de células com vantagem 
proliferativa e eventual formação do tumor maligno, com capacidade de invasão e resistência ao 
tratamento. 
09) DE ACORDO COM OS LIVROS DE BIOLOGIA MOLECULAR E INTRODUÇÃO A GENÉTICA, 
DESCREVA OS MECANISMOS QUE CARACTERIZAM A HERANÇA EPIGENÉTICA, TAMBÉM 
CONHECIDOS COMO MEMÓRIA EPIGENÉTICA: 
Os mecanismos de memória epigenética, também chamados de herança epigenética, envolvem a 
manutenção e transmissão de marcas epigenéticas que regulam a expressão gênica ao longo das 
divisões celulares e, em alguns casos, entre gerações. Essas marcas funcionam como “memórias” 
que preservam o estado funcional da célula sem alterar a sequência de DNA. A seguir, um 
aprofundamento sobre esses mecanismos, suas funções e localizações: 
1. Metilação do DNA 
 Função: A metilação de citosinas em dinucleotídeos CpG silencia gene ou regula sua expressão 
ao impedir o acesso dos fatores de transcrição e recrutando proteínas repressoras. 
 Mecanismo de herança: Após replicação do DNA, a DNMT1 reconhece o DNA hemimetilado e 
adiciona grupos metil à nova fita, preservando o padrão original. 
 Localização: Ocorre no núcleo, nas regiões regulatórias do DNA, principalmente em promotores 
e ilhas CpG. 
2. Modificações de Histonas 
 Função: Alteram a estrutura da cromatina modulando sua compactação, afetando 
a acessibilidade do DNA para a maquinaria transcricional. Acetilação, metilação, fosforilação 
e outras modificações atuam como sinais para ativação ou repressão gênica. 
 Mecanismo de herança: As enzimasmodificadoras de histonas reconhecem marcas pré-
existentes, recruta-se complexos “escritores” que copiam essas marcas para as novas histonas 
após a replicação. 
 Localização: As modificações ocorrem nas caudas das histonas no núcleo, dentro do 
nucleossomo. 
3. RNAs Não Codificadores (miRNAs, siRNAs) 
 Função: Controlam a expressão gênica pós-transcricionalmente e regulam a organização da 
cromatina e manutenção das marcas epigenéticas. 
 Mecanismo de herança: São capazes de guiar complexos para regiões específicas do genoma 
e podem mediar herança epigenética, especialmente em modelos de células germinativas e 
transgeracional. 
 Localização: Citoplasma (ação pós-transcricional) e núcleo (modulação transcricional e 
cromatina). 
4. Plasticidade e Dinâmica 
 Embora esses mecanismos preservem estados epigenéticos, eles também são reversíveis e 
ajustáveis, permitindo adaptações rápidas e respostas a estímulos ambientais e fisiológicos. 
5. Implicações na Saúde e Desenvolvimento 
 Essas memórias epigenéticas são essenciais para a manutenção da identidade celular e 
funções específicas. Também explicam como fatores ambientais (dieta, estresse, exposição 
química) podem afetar a expressão gênica e a saúde das células filhas e das gerações futuras. 
 
 
 
 
 
 
 
10) EXPLIQUE COMO OS MECANISMOS DE FEEDBACK POSITIVO E NEGATIVO REGULAM A 
EXPRESSÃO GÊNICA. FORNEÇA EXEMPLOS DE CADA TIPO DE FEEDBACK E DISCUTA SUA 
IMPORTÂNCIA NA HOMEOSTASE CELULAR. 
 
FEEDBACK NEGATIVO NA EXPRESSÃO GÊNICA 
Localização: 
 Atua em diversos níveis celulares, tanto no núcleo, regulando fatores de transcrição, quanto no 
citoplasma, controlando a síntese proteica e degradação de moléculas regulatórias. 
Etapas: 
1. Um estímulo inicial (como aumento da concentração de uma proteína) ativa a expressão de um 
gene. 
2. O produto da expressão (proteína) atua para inibir sua própria produção, por exemplo, 
bloqueando a atividade de seu fator de transcrição ou promovendo a degradação do mRNA. 
3. Essa inibição reduz o estímulo inicial, evitando produção excessiva da proteína. 
Exemplo: 
 Regulação dos níveis de glicose no sangue pela insulina, onde altos níveis de glicose estimulam 
a produção de insulina, que reduz a glicose, diminuindo o estímulo para sua própria produção. 
 No controle gênico, proteínas repressoras que se acumulam e bloqueiam seus próprios genes. 
Importância: 
 Mantém a estabilidade dos sistemas biológicos, evitando oscilações extremas na expressão 
gênica. 
 Crucial para a homeostase celular e para a regulação fina da quantidade de proteínas. 
 
FEEDBACK POSITIVO NA EXPRESSÃO GÊNICA 
Localização: 
 Também pode ocorrer no núcleo com ativadores de transcrição ou no citoplasma, amplificando a 
resposta gênica em cascata. 
Etapas: 
1. Um estímulo inicial ativa a expressão de um gene. 
2. O produto desse gene aumenta a ativação do próprio gene ou de genes relacionados, 
promovendo mais produção do produto. 
3. Essa amplificação contínua só cessa quando um mecanismo inibitório externo ou limitante atua. 
Exemplo: 
 No parto, a pressão do bebê no colo do útero estimula a liberação de ocitocina que causa 
contrações uterinas maiores, amplificando o estímulo até o nascimento. 
 Autoativação de fatores de transcrição que mantêm o estado diferencial de uma célula. 
Importância: 
 Amplifica respostas celulares, permitindo decisões rápidas e irreversíveis, como diferenciação, 
morte celular ou resposta a sinais importantes. 
 Fundamental para processos em que a ativação sustentada é necessária. 
 
DISCUSSÃO E IMPORTÂNCIA NA HOMEOSTASE CELULAR 
 O feedback negativo é predominante para manter condições estáveis e equilibrar a expressão 
gênica, evitando excesso ou falta de proteínas. 
 O feedback positivo é estratégico para reforçar e consolidar certos estados celulares ou 
respostas críticas, garantindo que uma mudança uma vez iniciada possa ser completada. 
 Ambos, trabalhando em conjunto, permitem a flexibilidade e robustez necessárias para a 
adaptação celular a diferentes condições e para a manutenção da funcionalidade normal dos 
tecidos e organismos. 
Esses mecanismos são essenciais na regulação do ciclo celular, resposta ao estresse, diferenciação 
celular e em patologias como o câncer, onde seu desequilíbrio pode levar à proliferação descontrolada 
ou falha de respostas celulares. 
 
REFERÊNCIAS 
1. ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da célula. 6 ed. Porto Alegre: Artes. Médicas, 2017 
2. DE ROBERTIS, E. M. F. Biologia Celular e Molecular. 16 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 
2017. 
3. VINAY KUMAR... [et al]. Robbins, patologia básica. 10 ed. - Rio de Janeiro: Elsevier, 2018. 
4. BOGLIOLO, L. Patologia Geral. 10 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2021. 
5. GRIFFITHS, J. F. A. et. al.; Introdução à genética. 12 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 
2022. 
6. LODISH, Harvey et al. Biologia Celular e molecular. 7ª edição, Porto Alegre: Artmed, 2014. 
7. SNUSTAD, D.P.; SIMMONS, M.J. Fundamentos de Genética. 7ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara 
Koogan, 2017 
8. SAITO, R. F. Fundamentos de Oncologia Molecular. São Paulo, Atheneu, 2015.