bioquímica na odontologia (placa)

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Bioquímica da placa 
Zilda Figueirêdo 
DBQ-UFPE
2014
 
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A cavidade oral fornece condições ideais para o crescimento de microrganismos (ambiente úmido, mantido a uma temperatura de 34 a 36 °C e um pH próximo à neutralidade (pH 6·75 - 7·25) na maioria das áreas)
A grande diversidade anatômica acarreta o crescimento de uma comunidade microbiana diferente para cada habitat. A existência de sulcos, fissuras favorecem o desenvolvimento de bactérias anaeróbicas (ou aeróbicas facultativas)
O ecossistema oral
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Sistema aberto – as bactérias são continuamente introduzidas e removidas do sistema.
 Se estabelece aquele microrganismo que possui capacidade de aderência às superfícies da cavidade bucal, ou que fiquem retidos
 
Principais ecossistemas bucais:
Epitélio bucal – a descamação contínua da superfície das células epiteliais permite uma rápida eliminação da bactéria aderida.
Dentes - apresentam diversos locais que podem ser colonizados por bactérias abaixo (região subgengival) e acima da margem da gengiva (região supragengival). 
Língua - com suas papilas na superfície fornecem locais para colonização que são protegidos de remoção mecânica.
 
O ecossistema oral
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A saliva e o fluido encontrado no sulco gengival (fluido crevicular gengival) são essenciais para a manutenção do ecossistema oral fornecendo água, nutrientes, aderência e fatores antimicrobianos. 
Funções dos microrganismos residentes quando em equilíbrio em relação ao seu hospedeiro
• Barreira contra instalação de microrganismos patogênicos (resistência a colonização)
• Modulação do sistema imunológico
• Produção de substâncias utilizáveis pelo hospedeiro - vitaminas
• Degradação de substâncias tóxicas
A microbiota também constitui um reservatório de bactérias potencialmente patogênicas que podem infectar os tecidos do hospedeiro. Ex. endocardite bacteriana.
O ecossistema oral
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Os microrganismos da placa exibem vantagens sobre espécies livres tais como:
 Maior disponibilidade de nutrientes, tais como fontes de C, N e fosfato
 Resistência aumentada a agentes antimicrobianos
– Taxa de crescimento lenta
– Limitações de difusão/reação
– Inativação/neutralização por enzimas
 Resistência a mecanismos de defesa do hospedeiro (PMNs não podem c/ agregados superiores a 5 bactérias). 
 Resistência a formas reativas de oxigênio
 Resistência a proteases
 Aquisição de novos genes, expressão de novas características 
Microbiota oral
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A composição da flora microbiana oral sofre a influência de vários fatores, que incluem: saliva, idade, mecanismos de defesa do hospedeiro, tratamento com antibióticos, estado dentário, frequência de ingestão de açucares e hábitos de higiene oral. 
Muitas patologias orais como cáries, doença periodontal e periimplantites são relacionadas com a placa bacteriana. 
Conhecer os mecanismos que controlam a formação e o desenvolvimento da placa pode ajudar a entender as patologias orais e a planejar um tratamento efetivo.
Microbiota oral
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Placa dentária - é uma massa mole concentrada e aderente de microrganismos contidos numa matriz orgânica, formada por polímeros bacterianos, substâncias salivares e elementos da dieta do hospedeiro. 
É uma comunidade complexa de mais de 800 espécies diferentes. (Siqueira e Rôças – 2005)
Placa dentária
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A composição da placa dental varia em diferentes superfícies anatômicas (fissuras, superfícies interproximais e lisas, sulco gengival) em virtude das propriedades físicas e biológicas de cada local.
A placa é constituída de uma fase sólida e uma fase líquida.
As bactérias compreendem a cerca de 70% do volume da placa, enquanto que a matriz compreende aos 30% restantes. 
Placa dentária – composição 
Cell cluster = aglomerado de células formando o biofilme 
Streamer = fase planctônica (bactéria em suspensão)
Void = espaço vazio
 Channel – canais que permitem a passagem de nutrientes e outras substâncias
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Componentes orgânicos 
Carboidratos 
uma grande proporção corresponde a políssacarídeos extracelulares (PECs) (glucanos e frutanos). 
polissacarídeos intracelulares (PICs) que atuam como um reservatório energético para serem usados durante os períodos de ausência de substratos da dieta. 
Lipídeos 
Proteínas (alta concentração de proteínas bacterianas e salivares). 
Componentes inorgânicos - compreendem de 5-10% do peso seco da placa. 
A concentração de Ca e P na placa é alta, em relação a saliva. K, Na, Mg, Cu, Fe e F também estão presentes. 
Placa dentária – composição 
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1. Formação da película adquirida
Adesão de glicoproteínas salivares na superfície dos dentes
2. Colonização primária (espécies pioneiras) (Gram (+) cocos e bastonetes
S. sanguis, S. oralis, S. mitis, A. viscosus
 Resistem a força de cisalhamento (saliva) e à repulsão eletrostática
3. Colonização secundária - predominância de Gram (-) filamentos (em 5 dias)
Interação microbiana, substituição dos cocos e bastonetes Gram (+)
Matriz de microorganismos e substância fundamental
4. Biofilme estável
Etapas de formação da placa
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A placa bacteriana não se forma diretamente na superfície dos dentes e sim na película adquirida. 
Película adquirida 
Camada orgânica acelular formada pela adsorção seletiva de certos componentes salivares ao dente e a outras superfície sólidas (amálgama, ouro, porcelana) presentes na boca. 
No seu estágio inicial não contem bactérias, entretanto, é rapidamente colonizada passando a se tornar parte da placa dental. 
A película pode ser removida após vigorosa escovação com agentes abrasivos, porém é rapidamente reconstituía pela exposição a saliva. 
Película adquirida 
Imagem de microscopia eletrônica mostrando a película como uma camada homogênea entre o esmalte e a placa.
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 A película tem várias propriedades e atividades, que são importantes na saúde e na patologia bucal
 Se interpõe entre o dente e a placa, atuando como uma barreira à difusão dos ácidos da dieta e da fermentação bacteriana.
 Atua na proteção mecânica do esmalte contra abrasão e atrito.
 Confere permeabilidade seletiva ao esmalte, permitindo a remineralização de lesões cariosas. 
 Juntamente com a mucina forma um meio lubrificante entre as superfícies opostas dos dentes.
Interfere na aderência dos microrganismos (contem receptores específicos que promovem a colonização) e serve de substrato para os microrganismos.
Funções da película adquirida
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hidroxiapatita [Ca5(PO4)3(OH)] 
a superfície do esmalte apresenta carga negativa decorrente dos grupos fosfatos que compõem a hidroxiapatita. Íons cálcio (Ca+) são então atraídos, formando uma camada de hidratação com carga positiva. Componentes salivares com partes eletronegativas se adsorvem a esta camada por interações não covalentes fracas, formando a película adquirida do esmalte (PA).
 B) Proteínas da superfície bacteriana (adesinas) se ligam especificamente a componentes da película adquirida, permitindo ligações mais estáveis . As ligações bacterianas inespecíficas, que ocorrem inicialmente por ligações eletrostáticas e/ou ligações de van der Waals não estão representadas nesta figura.
Formação da película adquirida
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Esmalte dentário
Esmalte dentário
Película adquirida
Adesina
Bactéria presente na saliva
A
B
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Os mecanismos de aderência são essenciais para a colonização bacteriana na cavidade oral. Na sua ausência, a bactéria se torna parte do fluido salivar e é engolida. 
Os colonizadores iniciais precisam resistir a altas concentrações de oxigênio e, ao mesmo tempo aos fatores naturais de remoção como a mastigação, a deglutição e o próprio fluxo salivar. Posteriormente eles devem crescer e aderir uns aos outros permitindo o acúmulo da placa.
A adesão ocorre em três fases
– Fase 1 - Colonização primária
– Fase 2 - Colonização secundária
– Fase 3 - Biofilme
estável
Mecanismos de aderência bacteriana
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Fase 1 - nessa fase o microorganismo é mantido por um curto período por forças atrativas.
Ocorrem interações principalmente entre bactérias específicas e a película adquirida. 
 As interações podem ser uma combinação do tipo lectina, interações eletrostáticas e hidrofóbicas ou podem envolver estruturas delicadas chamadas fibrilas ou fimbrias que se projetam da superfície do microorganismo.
Adesão dos microrganismos
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Fase 2 - a adesão é tornada essencialmente irreversível pela síntese de um polímero extracelular.
A dextrana, mantém as células unidas na forma de filamentos. Células individuais apresentam diâmetro de aproximadamente 1 μm.
Adesão dos microrganismos
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Fase 3 – A coagregação entre espécies diferentes são mediadas através proteínas específicas, chamadas adesinas, que são expressas na superfície de ambas as células e que interagem com seus receptores específicos na outra célula.
Adesão dos microrganismos
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O F. nucleatum funciona como uma ponte entre os colonizadores iniciais e os colonizadores tardios.
Adesão dos microrganismos - coagregação entre espécies diferentes 
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Colonização primária de um substrato; 
(b) crescimento, divisão celular e produção do exopolissacarídeo (PEC), com o desenvolvimento de microcolônias; 
(c) coadesão de células individuais, de células coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de múltiplas espécies; 
(d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme maduro. (Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003) 
Etapas de formação da placa
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Placa bacteriana supragengival
Existe uma maior densidade de células na base da placa. Estas geralmente apresentam uma parede celular grossa, característica de células com crescimento lento devido a escassez de nutrientes. A parte externa da placa tem menor densidade de células e uma maior diversidade de espécies, ilustrado pela presença de bastonetes. O material entre as células é o PEC.
E - esmalte
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Fatores que influenciam na ecologia microbiana 
 Temperatura - 36°C – 36,5°C (influencia na atividade enzimática, solubilidade, crescimento);
 pH
 Potencial de Óxido-Redução (Eh) - reflete a quantidade de oxigênio
 Nutrientes
 Saliva 
pH (saliva) = 6,25 - 7,25; 
fluxo salivar;
fatores agregantes - proteínas Ac;
capacidade tampão;
atividade antimicrobiana
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Temperatura – durante a alimentação, os microrganismos que colonizam a boca são expostos a alimentos quentes e frios e provavelmente devem se adaptar a essas variações extremas de temperatura. 
pH – Na cavidade oral, o pH é mantido próximo da neutralidade pela saliva. 
Entretanto, a área subgengival é banhada pelo fluido gengival e não sofre controle pela ação tamponante da saliva. 
Fatores que influenciam na ecologia microbiana 
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Potencial de oxido-redução (Eh) 
A proporção entre compostos oxidados e reduzidos constitui o potencial de oxido-redução ou potencial redox. 
O Eh é muito influenciado pela presença ou ausência de oxigênio molecular, que é o aceptor de elétrons mais comum.
Bactérias anaeróbicas precisam de um ambiente reduzido (Eh negativo) para seu crescimento, enquanto bactérias aeróbicas precisam de um ambiente oxidado (Eh positivo). 
Fatores que influenciam na ecologia microbiana
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A boca é caracterizada por uma grande faixa de potenciais de oxido-redução o que permite o crescimento de bactérias aeróbicas, anaeróbicas facultativas, e anaeróbicas. 
Fatores que influenciam na ecologia microbiana
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Nutrientes – na cavidade oral os nutrientes são derivados de cinco fontes:
 Alimento ingerido - 
 Saliva - Contém 1% de glicoproteínas, sais inorgânicos, aminoácidos e glicose e vitaminas. Essas quantidades são suficientes para sustentar o crescimento bacteriano nos períodos de jejum do hospedeiro.
 Fluido gengival - O sulco gengival é banhado por pequenas quantidades de transudato sérico, que contém proteínas tissulares e séricas, assim como aminoácidos livres, vitaminas e glicose.
 Células epiteliais descamativas
 As próprias bactérias - muitas inter-relações nutricionais também acontecem entre os microorganismos. Alguns microorganismos cooperam para a degradação de nutrientes. Algumas bactérias também usam nutrientes e outras substâncias produzidas por outros microorganismos.
Fatores que influenciam na ecologia microbiana
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Algumas interações possíveis entre as bactérias da placa 
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Saliva - a saliva tem uma grande influência na ecologia da boca, seus componentes orgânicos (glicoproteínas e proteínas) podem:
 
 influenciar o estabelecimento e seleção da microflora oral recobrindo a superfície oral e promovendo a adesão de certos organismos, ou agregando outras espécies e facilitando sua eliminação quando a saliva é engolida, 
 atuar como nutriente endógeno. 
 inativar microrganismos (ex. lisozima, lactoferrina, sialoperoxidase, peptídeos antimicrobianos, etc.) e imunidade adaptativa (ex. sIgA), e assim podem inibir alguns microrganismos exógenos diretamente.
Fatores que influenciam na ecologia microbiana
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As setas em preto voltadas para baixo indicam redução nas concentrações de nutrientes, tensão de oxigênio e pH nas regiões mais internas da placa dentária. 
A seta em preto voltada para cima indica maiores concentrações de produtos metabólicos nas áreas internas da placa. 
Área externa da placa
Área interna da placa
Eh - Potencial de oxido-redução
Diagrama representativo das variações nas condições ambientais que influenciam na composição microbiana da placa dental
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Locais onde a placa se forma
Os microrganismos precisam superar diversas forças de remoção para que possam permanecer na cavidade oral. As áreas entre dentes adjacentes e na fenda proximal estão protegidas das forças geradas na mastigação, fluxo salivar e higiene oral. Bem como áreas dos dentes que apresentam imperfeições podem favorecer o desenvolvimento da placa.
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Metabolismo da placa
Os carboidratos representam uma fonte de carbono e a principal fonte de energia da microbiota da placa (alguns microrganismos podem empregar ácidos carboxílicos, aminoácidos ou peptídeos, ao invés de carboidratos). 
Como a concentração de glicose na saliva é muito baixa, as glicoproteínas são a principal fonte de carboidratos para as bactérias da placa. 
Glicosidases produzidas pelas bactérias clivam a parte sacarídica para que as glicoproteínas sirvam de fonte de carbono.
As bactérias apresentam componentes enzimáticos fixos, denominados de enzimas constitutivas, direcionadas ao metabolismo da glicose (via glicolítica). No entanto, os microrganismos bacterianos exibem habilidades enzimáticas latentes para utilizar uma grande variedade de outros açúcares como a sacarose, maltose, lactose, frutose e álcoois-açúcares como sorbitol e manitol. No entanto, essas enzimas são sintetizadas apenas quando o açúcar está presente, sendo denominadas de enzimas indutíveis
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Para que um açúcar possa ser metabolizado há necessidade de dois sistemas enzimáticos, um para transportá-lo para o interior da célula e outro para convertê-lo em um intermediário da via glicolitica.
Um dos principais sistema de transporte de carboidratos para o interior da célula é o sistema fosfotransferase (PTS). O PTS atua em baixas concentrações de açúcar.
É um mecanismo de transporte ativo no qual as moléculas ao serem transportadas são fosforiladas, sendo o fosfoenolpiruvato (PEP) o doador de fosfato.
PEP + açúcar (fora da célula)  piruvato + açúcar-P (dentro da célula)
Sistema de transporte fosfotransferase (PTS)
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Sistema PTS
Nos estreptococos orais, o produto da glicose-PTS é a glicose 6-P, a sacarose-PTS gera a sacarose-P, antes de efetuar a hidrólise para frutose e glicose-6P, ao passo que a lactose-PTS produz lactose-P, que é subsequentemente hidrolisada em glicose e galactose-6P
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Pesquisas realizadas com o S. mutans indicam que a glicose também pode ser transportada por enzimas, denominadas permeases, e fosforilada por um processo dependente de ATP. Esse mecanismo parece funcionar com altas concentrações de glicose, baixos níveis de pH e altos índices de crescimento.
Transporte alternativo de açúcar não PTS
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via glicolítica ( __ ) 
via das pentoses (----)
PTS
Transporte e metabolismo da glicose nos estreptococos
Permeases
NADH + H+
ADP
ATP
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O destino do piruvato depende da quantidade e tipo de açúcar disponível, bem como da presença de O2 e CO2.
Concentrações elevadas de açúcar - o principal produto formado é o ácido lático.
Baixas concentrações de açúcar e em anaerobiose - resulta na geração de ácido fórmico, ácido acético e etanol como produtos finais.
Vias metabólicas de conversão do piruvato nos estreptococos
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Os produtos finais de excreção do metabolismo bacteriano dependem da concentração de açúcares no meio oral.
A contribuição das diferentes espécies de bactérias para a acidez do ambiente dentário varia. Os microrganismos que fermentam açucares em ácido butírico ou propiônico contribuem muito menos para a acidez da placa dental do que os que produzem ácido fórmico, acético ou láctico como produtos finais. Os Eubacterium alanctolyticum possuem a capacidade de absorver ácido acético do ambiente e condensá-lo em ácido butírico e capróico. Isto provoca uma diminuição de acidez do ambiente, assim como do consumo de ácidos láctico e fórmico.
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Na cavidade oral há carência de nutrientes na maior parte do tempo, mas podem ocorrer períodos repentinos de excesso de nutrientes. Tais excessos podem ser prejudicais as bactérias e, com isso, o metabolismo bacteriano deve ser rigorosamente controlado.
Durante o dia, há períodos de baixa concentração de açúcares e períodos em que as concentrações de açúcares são extremamente altas, advindas da dieta. Nestas fases, a concentração de açúcares na placa pode abruptamente subir cerca de 10.000 vezes e muitas bactérias morrem por um processo denominado “morte acelerada pelo substrato”. 
Os estreptococos orais e outras bactérias se protegem deste risco usando vários mecanismos:
 Regulando o índice de glicólise,
 Convertendo o piruvato em diferentes produtos finais, 
 Síntetizando polissacarídeos intra e extracelulares
 Inibindo o sistema de transporte de açúcares. 
Atividade metabólica e níveis de açúcar
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 Microrganismos como S. mutans, S. salivarius e S. sanguis sintetizam PECs a partir da sacarose, através das glicosiltransferases (GTFs). 
Glucanos
As glicosilransferases (GTFs) hidrolisam a sacarose em glicose e frutose e polimerizam as moléculas de glicose liberadas, formando polissacarídeos extracelulares (PEC) denominados glucanos. 
Síntese de polissacarídeos extracelulares (PECs)
A hidrólise da sacarose pelas GTFs gera energia para a síntese de polímeros de glicose, os glucanos (G)n, liberando “n” moléculas de frutose. 
A solubilidade destes polímeros é dependente do grau de ramificação bem como a proporção de cada tipo de ligação (1-3) e (1-6).
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glucosiltransferases
+ 
N (Frutose)
glucano (G)n 
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Síntese de polissacarídeos extracelulares (PEC)
Frutanos
	Os frutanos também são polissacarídeos extracelulares formados pela ligação de moléculas de frutose liberadas com a hidrólise da sacarose. 
A síntese de frutanos também ocorre extracelularmente, sendo catalizada pela enzima frutosiltransferase (FTF). Os frutanos são solúveis em água; assim, seu papel na formação da matriz extracelular de PECs é limitada. Acredita-se que o principal papel dos frutanos na virulência de S. mutans, seja o fato de atuarem como reservatórios extracelulares de substratos, durante os períodos de escassez de nutrientes. Assim, nestas fases, exoenzimas denominadas frutanases (sintetizadas pelo S. mutans) hidrolisam estes polissacarídeos, para que os monossacarídeos de frutose sejam transportados para o interior das células e metabolizados. 
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S. mutans também é capaz de sintetizar polissacarídeos intracelulares semelhantes ao glicogênio, os quais funcionam como uma reserva interna de carboidratos. Esta característica torna esta espécie ainda mais acidogênica, pois permite a fermentação de açúcares e conseqüente produção de ácidos durante os períodos em que não há disponibilidade de substratos da dieta 
Síntese de polissacarídeos intracelulares (PIC)
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