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Bioquímica Fundamental e Experimental 12 de outubro de 2015 PURIFICAÇÃO DE DNA DE CEBOLA Alunos: Daniele Mikovski, Felipe Tricarico, Jhonatan Basso, Paulo Alexandre, Thiago Bodeu. OBJETIVOS Extração das moléculas de DNA a partir de fonte vegetal (células do bulbo da cebola) a fim de conhecer os mecanismos básicos envolvidos no isolamento do material genético em laboratório. METODOLOGIA O trituramento da cebola é necessário para que ocorra a separação das células e a ruptura das membranas celulares para a posterior liberação do material genético. A solução de lise adicionada é composta por água, sal e detergente, tendo o sal a função de estabilizar a molécula de DNA, pois seus íons interagem com os fosfatos das moléculas, neutralizando-as e tornando-as menos solúveis em água. Além disso, o sal aumenta a densidade do meio, facilitando a migração do DNA para o álcool. Se não fosse a adição de sal, a molécula poderia desintegrar-se facilmente. A função do detergente é de afetar a permeabilidade das membranas, que são constituídas em partes por lipídios. Com a ruptura das membranas, os constituintes celulares, incluindo-se o DNA e proteínas, são dispersos na solução. A adição do etanol 95% possibilita uma maior desidratação das moléculas, aglutinando-as e, mesmo sendo o DNA solúvel em álcool, o material torna-se insolúvel na presença do sal devido à neutralização dos fosfatos. O etanol forma uma camada na superfície por ser menos denso que a solução aquosa. É observada uma precipitação composta por emaranhados esbranquiçados (o DNA), visto que também é um material menos denso que os outros componentes celulares. A reação do precipitado dissolvido em água com o reativo de difenilamina é essencial para a identificação e determinação do DNA. Em meio ácido, o material é hidrolisado liberando a desoxirribose e, esta, através do grupo CHO livre, reage com a difenilamina obtendo a formação de um composto azulado, com absorção de luz na faixa de 600nm. Essa hidrólise ácida é importante, pois remove de forma seletiva as bases púricas (adenina e guanina), preservando as ligações fosfodiésteres entre os nucleotídeos. O aquecimento em banho-maria favorece a desnaturação das moléculas de DNA. Difenilamina Desoxirribose MATERIAIS E MÉTODOS MATERIAIS - Cebolas; - Liquidificador; - Solução de lise; - Tubos de ensaio; - Pipetas graduadas; - Pipetador pump ou pêra; - Estante para tubos de ensaio; - Béquer; - Funil; - Proveta; - Algodão; - Etanol 95%; - Bastão de vidro; - Água destilada; - Reativo de difenilamina; - Banho Maria. MÉTODOS 1. As cebolas foram descascadas e trituradas em um liquidificador; 2. Pesou-se 50g deste material, sendo adicionados 100ml da solução de lise; 3. A mistura foi deixada a temperatura ambiente de 10 a 15min; 4. Essa suspensão foi filtrada em um funil, recolhendo-se o filtrado em uma proveta; 5. Deste filtrado, transferiu-se 4ml para um tubo de ensaio, ao qual adicionou-se 8ml de etanol 95% cuidadosamente para que as soluções não se misturassem; 6. Observou-se a formação de um precipitado branco, o qual foi enrolado com o auxílio de um bastão de vidro; 7. O material enrolado no bastão foi transferido para um tubo de ensaio, sendo dissolvido com 0,5ml de água destilada, a esta solução adicionou-se 1,5ml de reativo de difenilamina; 8. Em outro tubo de ensaio adicionou-se 0,5ml de água destilada e 1,5ml de reativo de difenilamina; 9. Os dois tubos foram colocados em banho Maria por 10min. RESULTADOS A partir da análise realizada, foram obtidos os seguintes resultados: Figura 1. Tubo A com precipitado, água e reativo após banho maria. No tubo A pode-se observar a reação do difenilamina com a desoxirribose, formando o composto levemente azulado. Figura 2. Tubo B com água e reativo após banho maria. Enquanto no tubo B, composto apenas por água e difenilamina, não houve reação. DISCUSSÃO CONCLUSÃO Os ácidos nucleicos, em sua grande maioria, estão associados a uma série de proteínas e substâncias químicas que, se não fossem removidas, comprometeriam os resultados qualitativos e quantitativos do experimento. Por isso, antes de qualquer caracterização se faz necessário o uso dessa técnica para purificar os ácidos nucleicos. Através de um método simples, neste experimento foi possível obter a extração e comprovar a existência de DNA no bulbo da cebola. Com os resultados obtidos podemos observar a difícil solubilidade da molécula de DNA, sua densidade baixa e a fragilidade das suas pontes de hidrogênio, visto que se quebram com muita facilidade, pois do ponto de vista energético são ligações pouco intensas. O estudo do material genético é essencial para a identificação e correção de doenças e para proporcionar modificações a fim de uma melhor adaptação das espécies em relação aos fatores externos. Essa adaptação em se tratando de vegetais está intimamente ligada à sua produtividade e ao seu melhoramento genético, pontos de extrema importância para as atuais e futuras gerações.
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