b i o f i l m e s b u c a i s2161

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BIOFILMES
BUCAIS
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Page e Korman (1997)
DESAFIO
MICROBIANO
RESPOSTA IMUNO-INFLAMATÓRIA
METABOLISMO DO TECIDO ÓSSEO E CONJUNTIVO
Fatores de Risco Ambientais e Adquiridos
Fatores de Risco Genéticos
SINAIS CLÍNICOS DA DOENÇA PROGRESSÃO
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TOLERÂNCIA AO O2
Aeróbias: bactérias crescem muito bem em atmosfera normal;
Microaerófilas: bactérias crescem melhor em atmosfera de O2 reduzido;
Anaeróbias: crescimento na ausência de O2;
Anaeróbicas facultativas: crescem tanto em ambiente anaeróbio quanto aeróbio;
Capnofílicas: bactérias crescem em ambiente com ótimas concentrações de CO2 .
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ECOLOGIA BUCAL
estuda a relação entre a microbiota e a cavidade bucal
(competição pela sobrevivência)
desequilíbrio ecológico
doença infecciosa
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OBJETIVOS
estudo dos mecanismos de implantação e de colonização bacteriana;
estudo das influências da microbiota bucal sobre o hospedeiro;
estudo das relações bióticas entre os diversos componentes da microbiota bucal;
estudo das influências do meio ambiente bucal sobre a microbiota.
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ECOSSISTEMA BUCAL
epitélio bucal;
dorso lingual;
superfície dentária supragengival;
região subgengival;
saliva.
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ECOSSISTEMA BUCAL
 dorso da língua
 região supragengival
 
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MICROBIOTA BUCAL
Podemos observar:
500 espécies de bactérias; 1 indivíduo -150 espécies
750 milhões de bactérias/ml de saliva;
160 bilhões de bactérias/g de material do sulco gengival;
200 bilhões de bactérias/g de biofilme.
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Estágios ecológicos no estabelecimento da comunidade microbiana
transmissão
(número de bactérias e freqüência)
aquisição
espécies pioneiras
(S. salivarius – bacteriocinas)
(S. oralis e S. sanguis / adesinas)
sucessão
aumento da diversidade microbiana
comunidade clímax
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MICROBIOTA BUCAL
 
MICROBIOTA autóctone
espécies >1% (sítio particular)
MICROBIOTA suplementar
espécies < 1%
Lactobacillus (10-5 – 10-3 / microbiota viável)
e S. mutans
MICROBIOTA transitória
 Loesche (1994)
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ANIMAIS
germ-free
convencionais
gnotobióticos
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Fatores que influenciam a aquisição ou que interferem no equilíbrio da microbiota bucal.
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ANAEROBIOSE
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Tensões de O2 na cavidade bucal
meio ambiente
21% (160mmHg)
cavidade bucal
12 – 14%
bolsa periodontal
1 – 2%
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Potencial de
Óxido-Redução (Eh)
reflete a quantidade de oxigênio
Eh da saliva = +200mV
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“O sucesso universal dos anaeróbios nas membranas mucosas indica que esta relação é tão estável que deve ser considerada uma relação simbiótica.”
Loesche (1994)
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temperatura - 36°C – 36,5°C influencia na atividade enzimática, pH, solubilidade, crescimento;
pH (saliva) = 6,25 - 7,25; 
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SALIVA
fluxo salivar;
fatores agregantes - proteínas Ac;
capacidade tampão;
atividade antimicrobiana.
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Aderência ou Adesão
aderência às superfícies bucais – mucosa e dentes – S. salivarius – S. sanguis;
aderência interbacteriana – coagregação / coadesão.
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Fluido Gengival
atividade mecânica
atividade microbiana
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Descamação Epitelial
Fatores Sistêmicos do Hospedeiro
Higiene Bucal
Uso de Antimicrobianos
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FONTE DE NUTRIENTES
DIETA
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composição química
consistência física
freqüência
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SALIVA
glicoproteínas
sais inorgânicos
aminoácidos
vitaminas
glicose
neuraminidase ácido siálico 
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FLUIDO GENGIVAL
exsudato sérico
aminoácidos livres
glicose
vitaminas
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CONSIDERAÇÕES HISTÓRICAS
Leeuwenhoek, 1683
animálculos
Facinus
pequenas formas de vida
Black
placa microbiana gelatinosa
 Gibbons, 1970
conceito da aderência específica
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Até a década de 60: etiologia obscura - cálculo dentário como fator irritante;
Estudos pioneiros da microbiota subgengival (Mac Donald et al., 1960; Socransky et al, 1963);
Estudos pioneiros da etiologia infecciosa (Jordan & Keyes, 1964; Keyes & Jordan, 1964; Löe et al., 1965; Theilade et al., 1966).
Década de 70 - consenso da etiologia infecciosa (Genco et al.,1969; Ellison, 1970; Keyes, 1970; Socransky, 1970).
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Placa (biofilme) bacteriana (o)
1,7 X 1011 por grama
de peso seco
 Socransky et al. (1963)
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POTENCIAL PATOGÊNICO
DO BIOFILME
hipótese do biofilme não-específico
hipótese do biofilme específico
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HIPÓTESE
DOS
SURTOS CASUAIS
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MATÉRIA ALBA
microrganismos
células epiteliais descamadas
restos alimentares
componentes salivares
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Estudos Epidemiológicos;
Animais Germ free – sinais de DP;
Gengivite Experimental
 (Löe et al., 1965; Theilade et al., 1966);
Periodontite Experimental (Lindhe, 1976);
Estudos Longitudinais.
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BIOFILME DENTÁRIO
Agregado estruturado e não calcificado de microrganismos contíguos em matriz orgânica, constituída por polímeros bacterianos e por substâncias da saliva e da dieta do hospedeiro.
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BIOFILMES BUCAIS (Darveau et al., 1977) 
comunidades ecológicas de bactérias desenvolvidas p/ permitir a sobrevivência da comunidade;
exibe cooperatividade metabólica;
sistema circulatório primitivo;
numerosos microambientes com diferentes pHs, tensão de oxigênio, potencial elétrico; 
comportamento total/ diferente do que em culturas planctônicas,
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BIOFILMES BUCAIS
Mais de 65 novas proteínas interligadas entre si;
Resistentes a resposta imuno-inflamatória;
PMNs não podem c/ agregados superiores a 5 bactérias;
Concentração de antibióticos superior 1500X;
Anticorpos são efetivos dentro de um campo elétrico.
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Biofilme Supragengival
Biofilme Subgengival
associado ao dente
associado ao epitélio
associado ao conjuntivo
microbiota móvel
intra-sucular 
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FORMAÇÃO DO
BIOFILME DENTÁRIO SUPRAGENGIVAL
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PELÍCULA ADQUIRIDA
espessura 0,01µm - 1µm
grupamentos sulfatos e
carboxila orientados para saliva
COMPOSIÇÃO QUÍMICA
proteínas (albumina), lisozima, lactoferrina, amilase, IgA, IgG, fosfolipídios, glicoproteínas
 
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PELÍCULA ADQUIRIDA
FUNÇÕES BIOLÓGICAS
proteção da superfície do esmalte
confere permeabilidade seletiva ao esmalte
interfere na aderência dos microrganismos à superfície dentária
nutre e serve de substrato p/ os microrganismos
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BIOFILME DENTÁRIO
FASE DE
COLONIZAÇÃO INICIAL
(DE 0 A 8 HORAS) 
MECANISMOS DE
ADESÃO E ESTRUTURAÇÃO
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superfície dentária
Streptococcus mutans
S. sanguis
Lactobacillus
A. viscosus
dorso da língua
S. salivarius
A. naeslundii
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FORMAÇÃO DO BIOFILME
fase reversível
adsorção de bactérias livres
S.sanguis; A.viscosus; S. mitis;
adesão bacteriana à superfície dentária
 
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fase irreversível
interações hidrofóbicas (LTA)
(S. sanguis, A. viscosus, A. naeslundii, S. mutans)
lecitina (fibrila) X carboidrato (receptor)
(S. sanguis, S. oralis)
especificidade à galactose e ao ácido siálico
interações eletrostáticas – Ca++salivar
(S. mutans)
interação envolvendo IgAs
(S. sanguis)
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interação c/ proteínas salivares ricas em prolina
(A. viscosus, S. mutans)
interações com amilase
(S. gordonii)
interação c/ proteína salivar
submandibular e sublingual
(S. mutans)
interações com glicosiltransferase e glucanos
(S. mutans, S. sobrinus)
(Rölla et al., 1984)
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FASE DE
CRESCIMENTO RÁPIDO
(DE 4 A 48 HORAS)
predominam mecanismos de aderência interbacteriana
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MATRIZ INTERMICROBIANA
25% do volume do Biofilme
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por meio de polissacarídeos
(S. mutans, sanguis, mitis, salivarius e Lactobacillus)
por meio de constituintes
da saliva
e do fluido gengival
(S. sanguis, S. oralis, A. naeslundii)
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PEC
S. mutans
 enzima invertase
s a c a r o s e
glicosiltransferase / frutosiltransferase
polímero de glicose
(glucan binding proteins – GBP)
glucanos (mutano e dextrano)
 levano (frutano)
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PIC
GLICOGÊNIO
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Veillonella e Neisseria
fermentadoras de ácido láctico
modifica o pH final do biofilme
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por meio de constituintes de superfície
de bactérias de diferentes espécies
(A. viscosus ou A. naeslundii e Estreptococos orais)
(S. sanguis e S. oralis e F. nucleatum)
(S. sanguis e P. gingivalis)
(Capnocytophaga gingivalis e A. israelli)
(C. ochracea e A. naeslundii)
(Prevotella loeschei e S. oralis)
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FASE DE REMODELAÇÃO
produtos extracelulares
reações de co-agregação
ecologia da placa
mudanças na dieta
(ingestação de sacarose)
oxigênio no ambiente
interações nutricionais
produção de bacteriocinas
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O2 Carboidratos Saliva
Streptococcus / Actinomyces
Lactato Acetato Formiato
 
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Lactato Veilonella Acetato
 Formiato
 H2 Menadiona
Campylobacter Pi / Pg
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 tiamina, putrescina, isobutirato
 Formato Fusobacterium / Eubacterium
 Bacteroides / Micromonas
 
 Co2
 
 Aa, Capnocytophaga, Ec
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SAÚDE PERIODONTAL
Células bacterianas aderentes, predomínio de cocos Gram-positivos;
Baixo número de Gram-negativos;
Ausência de Espiroquetas;
Ausência de bactérias com flagelos. 
					Listgarten, 1976	
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FORMAÇÃO DO
BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL
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Cemento Radicular Capnocytophaga sp.
Células Epiteliais
Eikenella corrodens
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BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL
associado ao dente
formação do cálculo
cáries radiculares
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BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL
associado ao epitélio
bastonetes e cocos G-
bactérias flageladas
espiroquetas
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BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL
associado ao conjuntivo
GN / PJL
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Espiroquetas - GUNA (Listgarten, 1965)	 
Espiroquetas e bastonetes fusiformes - epitélio gengival vital
(Listgarten, 1965; Heylings, 1967) 
Bastonetes; filamentosos; cocos – espaços intercelulares e epiteliais da bolsa periodontal
(Frank & Voegel, 1978; Frank, 1980) 
Invasão Bacteriana
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Cocos; bastonetes; filamentosos; espiroquetas – epitélio das bolsas periodontais profundas.	 
Aa.; C. sputigena; Mycoplasma; Espiroquetas - PJL (Saglie, 1982) 
Invasão X translocação - gengivite induzida em ratos (Sanavi et al. - 1985)
Invasão bacteriana gengival - sítios recorrentes (Pertuiset et al. - 1987) 
Invasão Bacteriana
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Infecções periodontais: crescimento de bactérias comensais ou transmissão de bactérias ?
Transmissão de Aa e Pg: membros da família (Petit et al., 1993; Alaluusua et al., 1993; Di Rienzo et al., 1990).
Transmissão de Aa e Pg: casais (Saarela et al., 1993; Van Stenhbergen et al., 1993).
Ausência de evidências de transmissão de Aa: famílias com - PJL (Tinoco et al., 1998).
Ausência de evidência de transmissão de Pg: população (Indonésia) (Van Winkelhoff et al., 1996).
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Principais Bactérias Bucais G+
Staphylococcus – cocos, anaeróbios facultativos, 
S. aureus e S. epidermidis - saliva e biofilme supra e subgengival;
Streptococcus – cocos, anaeróbios facultativos, metabolismo predominante/ fermentativo, gênero predominante na cavidade bucal.
 S. oralis – bactéria pioneira na formação do biofilme, IgA1-protease, produz PEC a partir de sacarose; 
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Principais Bactérias Bucais G+
S. mutans – alta/ acidogênico e acidúrico, sua colonização e sua cariogenicidade são principal/ determinadas pela produção de PEC, que esta diretamente relacionada à ingestão de sacarose, isolado de casos de endocardite;
S. salivarius: colonizador inicial da cavidade bucal, alta afinidade de ligação às células epiteliais bucais, língua e saliva;
S. vestibularis: coloniza mucosa, não produz PEC.
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Principais Bactérias Bucais G+
S. sanguis – espécie predominante no biofilme, parece ser adaptado à colonização de superfícies lisas, produz H2O2,, papel protetor nas doenças periodontais, produz IgA1- protease e PEC, tem sido isolado de casos de endocardite;
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Principais Bactérias Bucais G+
Lactobacillus - bacilos regulares, anaeróbios facultativos, metabolismo oxidativo e fermentativo, acidúricos, crescimento ótimo em anaerobiose, mas se desenvolvem bem em 5-10% CO2; encontrados na saliva, cavidades de cárie e biofilme dentário cariogênico;
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Principais Bactérias Bucais G+
Actinomyces – bacilos irregulares curtos ou longos, anaeróbios facultativos, biofilme dentário supra e subgengival;
A. israelli – é o principal causador de actinomicose, e é a espécie de Actinomyces dominante no biofilme dentário maduro;
A. viscosus - associado a gengivite e presente em alta prevalência no biofilme dentário;
A. odontolyticus – habitat principal é o cálculo dentário, placa dentária e cavidades profundas de cárie.
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Principais Bactérias Bucais G-
Veillonella – cocos pequenos, anaeróbios estritos, não fermentam carboidratos, utilizam principal/ piruvato e lactato, produzindo acetato, propionato, CO2, H2, assim, reduz o potencial cariogênico do biofilme dentário, não são consideradas patogênicas;
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Principais Bactérias Bucais G-
 Actinobacillus actinomycetemcomitans
é anaeróbio facultativo, imóvel, bacilo pequenos, retos ou encurvados, possuem vesículas de membrana, com vários sorotipos;
sorotipos mais comuns:
periodontite do adulto - a
PJL – b 
(Aa 97% EUA, 50% São Paulo – Genco et al., 1986) 
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Porphyromonas gingivalis
anaeróbio estrito, Gram -, imóvel, cocobacilo, assacarolítico 
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Prevotella espécies
Prevotella intermedia - bacilos curtos, sacarolíticos, pigmentados em negro ou não anaeróbios estritos
Bacteroides espécies
B. forsythus (T. forsythensis)– sacarolíticos, não pigmentados, bacilos com extremidades afiladas
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Espiroquetas
são microrganismos móveis, helicoidais, anaeróbios estritos e Gram – 
são categorizadas baseado no diâmetro celular (pequeno,médio e grande);
todas as espiroquetas cultivadas da cavidade bucal são do gênero Treponema
30% nas lesões de GN com evidências de invasão tecidual
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PRINCIPAIS FATORES
DE VIRULÊNCIA DOS ORGANISMOS PERIODONTOPATOGÊNICOS
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Propriedades que permitem uma espécie bacteriana colonizar um órgão alvo, defendido pelo hospedeiro, causando dano tecidual.
 Socransky e Haffajee (1991)
Fatores de Virulência
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ENZIMAS DE AGRESSÃO DIRETA
PROTEASES
colagenases (Pg, Pi, Aa, Td)
ação semelhante à tripsina (P, Bf,Td)
aminopeptidases (C, Pg)
gelatinases (Pg, Pi)
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FOSFOLIPASE A
precursores da prostaglandina
(Pg, Pi)
FOSFATASE ALCALINA E ÁCIDA
(Pg, Pi, C, Aa)
PRODUTOS TÓXICOS
EPITELIOTOXINA
(Pg, Pi, Aa, C)
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Fator inibidor da proliferação de fibroblastos suprime síntese de DNA e RNA dos fibroblastos (Pg, Pi, C, Aa, Td)
Toxina de distensão citoletal
efeito tóxico sobre os fibroblastos e células epiteliais (algumas cepas - Aa)
Endotoxinas - LPS
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Toxina indutora de reabsorção óssea
(microvesículas de Aa)
Butirato e Propionato – substâncias tóxicas
Catabólitos de Proteólise
substâncias fétidas – indol, NH3 e compostos sulfurosos voláteis – aumentam a permeabilidade das mucosas e reduzem a síntese protéica (Pg, Pi)
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Fatores de evasão das defesas do hospedeiro
Fibrinolisina – invasão (Pg, Pi, Td)
Inibição da atividade de LPMNs
substâncias que competem com as quimiotáticas / bloqueio dos receptores de LPMNs (Pg, Pi, C, Aa, Td)
Leucotoxina
(Aa)
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Componentes antifagocitários de superfície
ligação de LPMNs (Pg, Aa)
Resistência a digestão intracelular
superoxidodismutase (Pg, Pi)
catalase (Aa)
Proteases para IgA e IgG (Pg, Pi, Bf, Aa, TD)
Resistência às ações opsonizante e lítica do sistema C
proteases para C3b e C5b (Pg)
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Fatores de virulência das 
Porphyromonas gingivalis 
hematoglutinina
Células endoteliais e musculares
lisas da artéria coronária humana
Progulske-Fox et al. (1999)
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Postulados de Koch p/ especificidade bacteriana (clássico):
o agente (bactéria) deve ser isolado em todos os casos da doença;
culturas puras da bactéria causadora da doença podem ser obtidas;
quando inoculada em animais experimentais, a bactéria causa a doença;
a bactéria deve ser isolada dos tecidos doentes do animal experimental.
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Socransky (1977)
presença de patógenos putativos nas lesões periodontais e em concentrações elevadas comparados também c/ a ausência da bactérias ou a presença em concentrações muito menores em indivíduos saudáveis;
pacientes infectados c/ esses patógenos periodontais, freqüente/ desenvolvem altos níveis de anticorpos no soro, saliva e fluido gengival e podem também desenvolver uma resposta imune.
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Socransky (1977)
essas bactérias podem muitas vezes demonstrar in vivo, produção de fatores de virulência que podem ser correlacionados c/ a histopatologia clínica;
a implantação experimental da bactéria em um modelo animal deve conduzir pelo menos a algumas características que ocorrem naturalmente com o aparecimento da doença periodontal;
tratamento clínico que elimina essas bactérias das lesões periodontais devem resultar em melhora nos sinais clínicos da doença.
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Complexidade da microbiota	 Dificuldades na coleta:
1. Atividade de doença no sítio selecionado
2. Representatividade do material coletado
3. Diâmetro do sulco gengival 
Dificuldades no cultivo e caracterização bacteriana.
 
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Diluições
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Semeadura em Meio Seletivo
10-2
pura
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Incubação
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Biofilmes
O’ TOOLE, G. et alli. Biofilms formation as microbial development. Annu. Ver. Microbiol., 54:49-79 2000
KOLENBRANDER, P. Oral Microbial Communities: Biofims, interactions, and Genetic Systems Annu. Rev. Microbiol., 54:413-37 2000
STOODLEY, P. et alli. Biofilms as complex differentiaied communities Ann. Rev. Microbiol., 56:1877-209 2002 
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