Relatório 2 - Proteínas

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REAÇÕES EM PROTEÍNAS
Eduardo Santos
Matheus Spagiari
Ricardo Cavalheiro
Departamento de Ciências dos Alimentos, Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av Bento Gonçalves nº 9500, CEP 91540-000,
Porto Alegre-RS, Brasil.
Porto Alegre, 18 de Agosto de 2013.
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Objetivo
 Esse trabalho tem como objetivo caracterizar a presença de proteínas em alimentos e separar diferentes proteínas, além de demonstrar as reações de coloração para proteínas e verificar a precipitação de proteínas.
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 Introdução
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 As proteínas são polímeros de aminoácidos unidos por ligações, denominadas ligações peptídicas, uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH2) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma amida. Além disso, os diferentes grupamentos "R" encontrados nos aminoácidos influenciam na estrutura, na funcionalidade e nas propriedades das proteínas individuais.
A maioria das proteínas encontradas nos seres vivos é formada por L-aminoácidos. Os D-aminoácidos aparecem somente em certos antibióticos peptídicos e em peptídeos componentes da parede de algumas bactérias. Apesar de muitas proteínas conterem outras substâncias, além dos aminoácidos, a estrutura tridimensional e muitas das propriedades biológicas das proteínas são determinadas, em grande parte, pelos tipos de aminoácidos presentes em sua molécula, a ordem em que eles estão unidos entre si, na formação da cadeia polipeptídica e, ainda, pela inter-relação espacial de um aminoácido com o outro. Em soluções aquosas de pH neutro, os aminoácido	
os podem existir em duas formas. Uma pequena fração pode encontrar numa forma el
ectricamente neutra, ou seja, com o grupo amina desprotonado
(-NH2) e o grupo carboxila protonado (-COOH). A maioria estará, no entanto, numa forma ionizada, em que o grupo amina se encontra protonado (-NH3+) e o ácido carboxílico desprotonado a carboxilato (- COO-), denominando-se esta forma de zwitteriônica (do alemão zwitter, que significa "híbrido"). Um zwitteríon é uma molécula globalmente neutra em termos de carga elétrica, mas possui cargas locais devido à presença de grupos ionizados.
O ponto isoelétrico (pI) de uma molécula é o pH ao qual essa molécula é eletricamente neutra. Este conceito é aplicado particularmente a aminoácidos e proteínas. O ponto isoelétrico não é o pH em que todas os grupos básicos estão desprotonados e os ácidos protonados, mas o pH em que a carga líquida da molécula é igual a zero. Em um pH abaixo do valor de pI, os aminoácidos e proteínas apresentam carga líquida positiva. Em um
valor de pH acima do pI, os aminoácidos e proteínas encontram-se com carga líquida negativa.
As proteínas exercerem uma grande variedade de funções na célula, estas podem ser divididas em dois grandes grupos:
Dinâmicas - Transporte, defesa, catálise de reações, controle do metabolismo e contração, por exemplo; Estruturais - Proteínas como o colágeno e elastina, por exemplo, que promovem a sustentação estrutural da célula e dos tecidos.
Podem ser estruturalmente classificadas em fibrosas ou globulares. As proteínas que apresentam uma ou mais cadeias polipeptídicas formando estruturas compactas, mais ou menos esféricas e que geralmente são solúveis denominam-se proteínas globulares. As proteínas globulares possuem estrutura espacial mais complexa, são mais ou menos esféricas. São geralmente solúveis nos solventes aquosos e os seus pesos moleculares situam-se entre 10.0 e vários milhões. Nesta categoria situam-se as proteínas ativas como as enzimas, transportadores como a hemoglobina, etc. As proteínas fibrosas possuem forma alongada, geralmente insolúveis em meio aquoso e desempenham um papel basicamente estrutural nos sistemas biológicos. Ao contrário das globulares, são formadas pela repetição de módulos, o que possibilita a construção de grandes estruturas, com organização que origina fibras. Ao descrever a estrutura de uma proteína é conveniente considerar a sua complexidade através de suas estruturas:
Estrutura primária - É a seqüência de aminoácidos ao longo da cadeia polipeptídica, específica para cada proteína.
Estrutura secundária - Descreve a formação de estruturas regulares pela cadeia polipeptídica. Pode ser α-hélice ou folha β.
Estrutura terciária - É a forma tridimensional como a proteína se "enrola". Descreve o dobramento final da cadeia polipeptídica por interação de regiões com estrutura regular.
Estrutura quaternária - Descreve a associação de duas ou mais cadeias polipeptídicas de estrutura terciária. 
Procedimento Experimental
Materiais e Reagentes:
Amostra de leite desengordurado
Ácido acético 10%
NaOH 1M (caso precise corrigir o pH abaixo de 4,5) 
Biureto
Procedimentos:
Inicialmente prepara-se a precipitação da caseína. Transfere-se 50 mL do leite desengordurado para um Becker de 250 mL e dilui-se com 50 mL de água morna. 
Logo depois, homogeneíza-se e adiciona-se com a pipeta ácido acético 10%, gota a gota, agitando continuamente até a coagulação do leite (pH 4,5 a 5,0). Deve-se anotar o volume gasto de ácido acético. Verificar o pH do leite coalhado e, caso o valor de pH esteja abaixo de 4,5, corrigir com NaOH 1mol/L. Depois de deixar em repouso, para que ocorra a sedimentação da caseína, deve-se filtrar o sobrenadante para eliminar pequenas partículas que tenham ficado suspensas (guardar o material retido no filtro). Mede-se o volume do filtrado em proveta e coleta-se uma alíquota deste sobrenadante filtrado para a reação de coloração. 
Para a recuperação da caseína, filtra-se a massa sedimentada e enxuga-se a mesma entre papéis filtro. Transfere-se para um Becker de peso conhecido para que posa a pesar. Esse valor será do extrato bruto da caseína.
Para a reação de coloração, no tubo 1, adiciona-se 0,2 mL de solução padrão de proteína e 0,8 mL de água destilada. No tubo 2, 0,5 mL de solução padrão de proteína e 0,5 mL de água destilada. E no tubo 3, 0,8 mL de solução padrão de proteína e 0,2 mL de água destilada. Já no tubo 4, adiciona-se 1mL de solução padrão de proteína. E nos tubos 5 e 6, coloca-se 1mL do sobrenadante, sendo no tubo 5 numa diluição na proporção 1:20 e no tubo 6 numa diluição 1:10. No tubo 7 (branco), adiciona-se 1mL de água destilada. Logo depois, adiciona-se, em cada um dos 7 tubos de ensaio, 4mL de Biureto. 
Deve-se agitar os tubos e depois deixar descansar por 15 minutos. Fazer a leitura em espectrofotômetro a 520 nm, usando o tubo “Branco” para acertar o zero do aparelho.
Resultados
Os resultados obtidos da leitura em espectrofotômetro a 520 nm e a massa calculada pelo valor da concentração da solução padrão de proteína (5mg/mL):
	TUBO
	Massa (mg)
	Abs (540 nm)
	1
	1
	0,055
	2
	2,5
	0,152
	3
	4
	0,222
	4
	5
	0,258
	5
	-
	0,192
	6
	-
	0,039
	7
	-
	-
	
	
	
 
A partir dos dados coletados, determina-se a equação para a curva padrão. 
Gráfico: Absorbância X massa.
Conclusões
As reações de coloração e precipitação (com ou sem desnaturação) de proteínas permitem a caracterização dessas pela analise de suas propriedades químicas e físicas, entre elas, a presença de ligações peptídicas, estrutura molecular, solubilidade, forca iônica e concentração molar. A detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações especificas com determinados reativos, os quais originam substancias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação.
As reações de coloração não alteram a estrutura tridimensional da proteína, ao contrario das reações de precipitação que podem alterar as estruturas quaternárias, terciarias e secundarias das proteínas como as reações por ação térmica, presençade alcalóides, sais de metais pesados e solventes orgânicos.
	
	
Referências
http://www.scribd.com/doc/29031871/PROTEINAS-Reacoes-de-coloracao-e-precipitacao
http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/proteinas.htm
http://www.scribd.com/doc/29031871/PROTEINAS-Reacoes-de-coloracao-e-precipitacao
LEHNINGER, A. Lester. Fundamentos de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo: Sarvier, 2006.
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