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O USO DA TECNOLOGIA DO DNA EM ODONTOLOGIA LEGAL
Ricardo Henrique Alves SILVA, Arsenio SALES-PERES, Rogério Nogueira de Oliveira, Fernando Toledo de Oliveira, Sílvia Helena de Carvalho SALES-PERES
 RESUMOA importância estabelecida pela Odontologia Legal para identificações humanas, principalmente quando há pouco material restante para realizar tal identificação (ex.: em incêndios, explosões, corpos em decomposição ou esqueletos), tem levado os dentistas a trabalhar com a investigação forense, a fim de se familiarizar com as novas técnicas da Biologia Molecular. A atual avaliação pelos testes de DNA tem sido de alta confiança e sido aceitos como provas legais nos tribunais. Esse artigo apresenta uma revisão de literatura referindo aos estudos mais importantes da Odontologia Legal que envolvem o uso do DNA para identificações humanas, e traz uma visão global da evolução dessa tecnologia nos últimos anos, destacando a importância da biologia molecular nas ciências forenses.
Palavras-chave: Forensic dentistry; Human identification; DNA
INTRODUÇÃOpor Watson e Crick, os quais descobriram a estrutura de dupla-hélice do DNA, cuja é responsável pela herança genética dos seres humanos, levou a importantes mudanças em quase todos os campos da ciência. Essa descoberta foi a base para o desenvolvimento das técnicas que permitem caracterizar individualidades de cada pessoa baseado na sequência do DNA. Três décadas depois, Jeffreys, et al (1985) criou sondas moleculares radioativas que poderiam reconhecer regiões altamente variáveis do DNA e, assim, determinar padrões específicos de cada indivíduo, as quais foram denominadas impressões digitais do DNA. Os testes de perfis de DNA desempenhados atualmente são totalmente confiáveis, sendo aceitos como provas legais nos tribunais, tal como para investigação de paternidade e identificação humana. Vários materiais biológicos podem ser usados para isolamento de DNA para execução de testes laboratoriais para identificação humana, incluindo tecido ósseo, bulbo capilar, amostras de biópsia, saliva, sangue e outros tecidos corporais. É possível obter DNA a partir de praticamente todos os tecidos do corpo humano, apenas com variações na quantidade e na qualidade do DNA extraído de cada tecido.
 A disciplina de Odontologia Legal apenas foi introduzida no currículo das escolas brasileiras de Odontologia após a emissão do decreto nº 19852, alterado em 1931. Desde então, essa especialidade continuou a se desenvolver, mostrando uma notável maturidade profissional e científica nos últimos tempos. A Antropologia Forense, a qual é uma das competências da Odontologia Legal, é um dos melhores exemplos desse desenvolvimento, tendo passado por vários estágios desde a simples observação aos mais recentes e sofisticados testes laboratoriais, incluindo examinações genéticas.
 Dessa forma, a Odontologia Legal é a especialidade que tem como objetivo a investigação dos fenômenos psicológicos, físicos, químicos e biológicos que podem atingir os seres humanos (vivos, mortos ou fragmentos de corpos), compreendendo aspectos da identificação humana; criminal; cível; trabalhista e investigação administrativa legal; tanatologia forense; documentos legais; traumatologia forense; exames de imagem (Raio-X, tomografia); análise salivar; e outros aspectos envolvendo uma equipe multidisciplinar.
 A identificação humana é um dos maiores campos de estudo e pesquisa na ciência forense porque a mesma lida com o corpo humano e visa estabelecer a identidade humana. A revolução causada em 1953
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de crimes e para identificação humana. 
 Esse primeiro locus altamente polimórfico foi descoberto por Wyman e White (1980), usando uma sonda de DNA. Dessa forma, mais de 15 diferentes tamanhos podem ser observados dentro de pequenas amostras de indivíduos. Essas sequências repetidas estão espalhadas por todo o genoma humano e apresentam uma variedade suficiente para ser usada em testes de identificação humana. Esses loci hipervariáveis foram constituídos por repetições em série de sequências de oligonucleotídeos (de 2 a 80 pares de bases (pb)). Dependendo do tamanho deles, esses loci foram denominados como VNTR (repetição em tandem de número variável) ou minissatélites, 9 a 80 pb, e STR (sequências curtas repetidas em tandem) ou microssatélites, 2 a 5 pb.
 Inicialmente, a comunidade forense usou teste de VNTR para identificação de corpos e testes de paternidade. Entretanto, como esse método requer uma grande quantidade de material e tem resultados de baixa qualidade, vários casos não puderam ser resolvidos, especialmente quando apenas pouca amostra de material biológico foi coletada na investigação da cena do crime. A introdução da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), a qual torna possível a amplificação de pequenas amostras de DNA, alargou os escopos na Genética Forense. Teste de STR’ começou a ser usado para tratamento de casos forenses, fazendo uma revolução na identificação humana e testes de paternidade.
 Além, as mais novas ferramentas do DNA, incluindo DNA mitocondrial e SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) – substituições, inserções e deleções que ocorrem em posições únicas podem ser usadas quando a tipagem do STR não produzir um resultado ou quando apenas um perfil parcial é obtido devido ao tamanho e às condições da amostra. DNA de baixa qualidade pode ser encontrado, por exemplo, em desastres em massa, tal qual o ataque ao World Trade Center, acidentes de avião, tsunamis e corpos em decomposição.
 Testes de DNA foram aceitos pela legislação brasileira apenas após os anos 90 e ainda são questionados por alguns indivíduos. Além disso, testes com DNA envolvem um alto custo devido à escassez de instituições públicas preparadas para a rotina de realização dos exames de DNA. Entretanto, já existem evidências de que o Estado reconhece a eficácia da informação provida pelos testes de DNA e a necessidade de torná-los disponíveis ao público em geral. Por exemplo, o 
 
A importância estabelecida pela Odontologia Legal para a identificação humana, principalmente quando há pouco material restante para executar tal identificação (ex.: em incêndios, explosões, corpos em decomposição ou esqueletos), tem levado os dentistas a trabalhar com investigação forense, a fim de se familiarizar com as novas técnicas da Biologia Molecular. Portanto, esse artigo apresenta uma revisão da literatura que se refere a trabalhos brasileiros e alguns estudos internacionais em Odontologia Legal que usaram análise do DNA para identificação humana, além de uma visão global sobre a evolução dessa tecnologia nos últimos anos, destacando a importância da biologia molecular em casos de investigação forense.
REVISÃO DA LITERATURAAcontecimentos
 Até os anos 80, a ciência de identificação em casos criminais foram baseados em análises sorológicas de proteínas polimórficas, grupos sanguíneos e marcadores genéticos. Exames forenses de amostras biológicas começaram no início do século 20 pela aplicação do sistema de grupo sanguíneo ABO em evidências relacionadas a crimes ou identificação humana. As provas de identificação individual pelo uso de testes baseados em grupo sanguíneo ganharam valor legal na corte alemã em 1920, sendo legalmente aceitas nos Estados Unidos apenas em 1935. No Brasil, esses exames foram dados como legais com a primeira investigação de paternidade em 1948. Esses sistemas tem sido substituídos na maioria dos centros e raramente tem sido empregados nos dias atuais.
 Outra importante fase do desenvolvimento das ciências forenses voltadas para a identificação humana começou com a publicação de um estudo por Jeffreys et al (1985), quem investigou provas radioativas moleculares que poderiam reconhecer regiões do DNA altamente sensíveis (minissatélites no genoma humano) que produziram um tipo de “impressão digital” do DNA. Tipagem molecular do materialgenético foi empregado oficialmente pela primeira vez na Inglaterra por Jeffreys et al (1985) para resolução de um problema de imigração. Ano após ano, esses autores empregaram essa técnica para identificar o estuprador e assassino de duas vítimas. Desde então, Criminalística e Medicina Legal tem evoluído e aplicado impressão digital do DNA e técnicas de tipagem molecular como uma poderosa ferramenta para a resolução de centenas 
foram feitas pelo perfil de DNA.
 Os principais fatores exógenos que podem limitar a recuperação da informação de remanescentes corporais são os elementos presentes ou associados ao fogo, como chamas, calor e explosões. Neste sentido, os dentes desempenham um papel importante na identificação e na criminologia, devido à singularidade das características dentais além do alto grau de resistência física e química da estrutura dentária. Devido a sua capacidade resistir a mudanças ambientais, os dentes representam uma excelente fonte de DNA porque esse material biológico fornece a relação necessária para a identificação de um indivíduo em caso de falha dos métodos convencionais por identificação dental.
DNA Genômico e Mitocondrial em Odontologia Forense
 O DNA Genômico é encontrado no núcleo de cada célula do corpo humano e representa a fonte de DNA para a maioria das aplicações forenses. Os dentes são uma excelente fonte de DNA Genômico porque análise em PCR aceita amostras coletadas post-mortem para conhecer amostras ante-mortem ou do DNA parental.
 O DNA Mitocondrial é um outro tipo de material que pode ser usado para identificação corporal. Sua principal vantagem é o alto número de cópias por célula (de centenas a milhares de organelas). Quando as amostras de DNA são muito pequenas ou estão degradadas, tais quais as obtidas de tecidos esqueletizados, a probabilidade de obter um perfil de DNA a partir do DNA mitocondrial é mais alta do que com qualquer marcador encontrado no DNA Genômico. Além disso, Silvia e Passos (2002) estabeleceram que a análise do DNA mitocondrial para propósitos forenses está restrito a tecidos antigos, como ossos, cabelo e dentes, nos quais o DNA Genômico não pode ser analisado. Entretanto, essa exame é realizado através do sequenciamento direto das bases nitrogenadas, cuja técnica é bastante dispendiosa porque a mesma emprega uma tecnologia altamente especializada. Além disso, DNA mitocondrial é exclusivamente matrilinear e, portanto, menos informativo. Assim, essa análise não é comum em todos os laboratórios forenses direcionados à resolução de crimes e identificação de pessoas.
 Em um estudo conduzido por Pötsch et al (1992), a produção total de DNA Genômico obtido
Distrito Federal brasileiro já segue a lei nº 1097/96, a qual assegura a realização de testes de DNA gratuitamente para pessoas cuja necessidade for provada. No estado de São Paulo, existe um projeto intitulado “Caminho de Volta” (Way Back) que usa a tecnologia da biologia molecular para a procura de crianças desaparecidas. Além dessas iniciativas, novas leis sobre este tema estão sendo desenvolvidas, tal qual o projeto de lei nº 6610/02, proposto pelo congressista Ricardo Izar, cujo prevê a criação de um banco estatal de DNA, cujo único propósito de realizar um registro de identificação inicial de recém-nascidos, e o projeto de lei nº 188/99 proposto pelo congressista Alberto Fraga, cujo estabelece a identificação genética criminal, entre outros.
O DNA e a Odontologia Legal
 A Odontologia Legal tem contribuído notavelmente para os processos de identificação humana. Protegidos pela Lei nº 5081/66, profissionais brasileiros da Odontologia podem executar investigações envolvendo materiais biológicos derivados do corpo humano em várias condições (esquartejados, dilacerados, carbonizados, macerados, putrificados, em esqueletização esqueletizados) com o objetivo de estabilizar a identidade humana.
 Impressões digitais, historicamente, tem sido utilizadas para identificação. Entretanto, em algumas situações, como incêndios e esqueletização, elas são facilmente destruídas. Além disso, experts frequentemente precisam usar elementos comparativos produzidos na prévia da morte dele(a), tais como registros dentais, para prosseguir na identificação. Apesar disso, essa documentação talvez esteja indisponível ou incompleta. No momento, com a aplicação dos recursos biomoleculares para identificação humana, é possível identificar a pessoa usando pequenas quantidades ou material biológico deteriorado, condições que são relativamente frequentes em análise forense. Esse fato poderia ser demonstrado após o desastre do tsunami que ocorreu no Sul da Ásia em 26 de dezembro de 2004, quando as mais variadas técnicas foram aplicadas para identificação de centenas de vítimas, assim como: patologia forense, odontologia legal, perfil de DNA e “fingerprinting”. Apesar disso, 99% dos corpos foram identificados usando registros dentais ou impressões digitais e apenas 1% das identificações
tras (5 da polpa dentária, 20 da dentina e 20 do cemento). A polpa produziu os mais fortes sinais pela amplificação por PCR, enquanto os sinais produzidos pelo cemento e pela dentina foram muito similares uns aos outros. Hanaoka et al (1995) avaliaram a extração do DNA de 50 dentes (tecidos pulpar e duro). O DNA obtido da polpa dentária variou de 3 a 40 µg, e nenhuma correlação foi encontrada entre período de armazenamento e a quantidade de DNA. Os autores investigaram a eficiência da extração do DNA dos tecidos duros em diferentes concentrações de solução descalcificante. O DNA obtido da polpa dentária possuiu maior peso molecular, o qual permitiu análise por sondas multilocus ou pela técnica de PCR. Em contramão, o material obtido através dos tecidos dentais duros demonstraram análise satisfatória apenas pela técnica de PCR. Remualdo (2004) avaliou a amplificação do DNA recuperado de dentes sujeitos ao calor (200ºC, 400ºC, 500ºC e 600ºC) durante 60 minutos, testando três métodos de extração diferentes (orgânico; acetato de amônia/isopropanol e sílica). Usando o método orgânico para a extração de DNA Genômico, 50% das amostras sujeitas ao calor foram amplificadas, mas apenas as que foram submetidas às temperaturas mais baixas (200 e 400ºC). Às mais altas temperaturas (500ºC e 600ºC), o método que utilizou isopropanol/acetato de amônia rendeu melhores resultados, principalmente para extração de DNA mitocondrial.
 Entre os vários casos descritos na literatura sobre isolamento do DNA de dentes, um relatório muito importante foi publicado por Sweet e Sweet (1995). Este artigo apresenta um caso de identificação de remanescentes humanos no qual a vítima de um assassinato foi incinerada e teve seu corpo quase que completamente carbonizado, reduzido a aproximadamente 25% do seu tamanho original, o que impediu a análise do DNA pelos métodos convencionais. Entetanto, um irrompido terceiro molar foi preservado e possibilitou a extração de DNA da polpa dentária (1,35 µg), a qual funcionou como uma excelente fonte de DNA de alto peso molecular.
 Além de identificação humana, outro sujeito de estudo da Odontologia Legal relacionada à biologia molecular é a análise de marca de mordida em evidência. Em casos de agressão física, tais como abuso sexual, assassinato e abuso infantil, marcas de mordidas são frequentemente encontradas na pele. A saliva do agressor é comumente depositada na pele da vítima durante a mordida, beijo ou sucção. De acordo com Sweet (2000), é possível identificar o grupo sanguíneo do 
De uma amostra dental variaram de 6 µg a 50 µg de DNA. Esses resultados foram obtidos do DNA extraído da polpa dental e não mostrou diferença quando comparado a padrões obtidos do DNA isolado de amostras de sangue ou tecidos pulmonares disponíveis.
 Em amostras forenses, o estudo do DNA (Genômico e mitocondrial) é usualmente realizado pela análise do STR (sequências curtas repetidas em tandem), o qual pode ser definido como regiões hipervariáveisdo DNA que apresentam consecutivas repetições de fragmentos que tem de 2 a 7 pares de bases (pb). O teste de VNTR (repetição em tandem de número variável), o qual apresenta sequências curtas repetidas de número intermediário (15 a 65 pares de bases), é raramente usado em análise forense devido à pobre qualidade do DNA obtido com esse método. Os mais valiosos STRs para identificação são aqueles que apresentam o maior polimorfismo (grande número de alelos), o menor tamanho (em pares de bases), alta frequência de heterozigotos (maior que 90%) e baixa frequência de mutações.
Possíveis aplicações do DNA em Odontologia Legal
 A influência ambiental na concentração, integridade e recuperação do DNA extraído de polpas dentárias tem sido previamente medida por Schwartz et al (1991). Os autores variaram o pH (3,7 e 10), temperatura (4ºC, 25ºC, 37ºC e incineração dentária) umidade (20, 66 e 98%), tipo de solo no qual o dente foi enterrado (areia, solo de jardim, solo de envasamento, submersão em água, enterrado ao ar livre) e períodos de inumação (uma semana a seis meses). Foi determinado que as condições ambientais examinadas não afetaram a habilidade de obter DNA humano de alto peso molecular a partir da polpa dentária.
 Tsuchimochi et al (2002) testou a resina quelante Chelex 100 para extrair DNA da polpa dentária para subsequente aplicação em análise por PCR. Para tal propósito, os dentes extraídos foram incinerados por 2 minutos sob temperaturas de 100ºC, 200ºC, 300ºC, 400ºC e 500ºC. Todas as amostras incineradas acima de 300ºC puderam ser amplificadas e tipadas, enquanto que as incineradas sob temperatura acima de 400ºC não produziram nenhumproduto do PCR. Os autores concluíram que a extração do DNA de polpa dentária usando essa resina é apropriada para obter DNA de alta qualidade para amplificação por PCR.
 A fim de avaliar os diferentes tecidos como fontes de DNA em análise forense, Malaver e Yunis conduziram um estudo em 2003 no qual 20 dentes foram obtidos de corpos não identificados sepultados em 1995 e exumados em 2000, fornecendo 45 amos- 
dado durante o manuseio da amostra tão bem quanto seguir as políticas rígidas para prevenir contaminação.
 Na prática, medidas para que resultados confiáveis possam contribuir para elucidar são a adequação dos procedimentos de coleta, verificação das condições do material coletado, escolha da metodologia de análise e extração do DNA, e, finalmente, a análise dos resultados. Deveria ser mencionado que o processo de extração do DNA possui três etapas: ruptura ou lise da célula (a qual permite uso de várias técnicas para ruptura efetiva das membranas celulares), desnaturação e inativação protéica (por agentes quelantes e proteinases a fim de inativar elementos, tais como as proteínas) e , finalmente, a extração do DNA em si. As técnicas de extração do DNA mais frequentemente empregadas em Odontologia Legal são o método orgânico (composto de fenol-clorofórmio e usado para DNA de alto peso molecular, com uma altaprobabilidade de erros, dada pelo uso de múltiplos tubos). Chelex 100 (o mais rápido e de menor risco de contaminação, ainda o mais caro); Papel FTA (composto de papel de celulose absorvente com substâncias químicas, o que acelera a velocidade do uso); AND álcool isopropílico (contendo amônia e isopropanol, o qual é menos caro e também uma alternativa ao método orgânico).
 Uma importante observação é quando a amostra degradada no DNA antigo são os únicos artefatos, sendo necessário o uso de técnicas para superar os problemas de contaminação de degradação da amostra de DNA. Rudin e Inman (2001) tem relatado que os fatores de levam à degradação doDNA incluem tempo, temperatura, umidade (facilitando o crescimento de microrganismos), luz (tanto a luz solar quanto a luz UV) e a exposição às várias substâncias químicas. Combinações dessas condições são frequentemente encontradas no ambiente e tendem a degradar as amostras em fragmentos menores. Entretanto, uma vez coletada a amostra, a mesma tem que ser seca (ou permanecer seca), dependendo do tipo de material biológico. Ela também pode ser armazenada em congelamento (se necessário), embora para o DNA isso seja menos importante que para as proteínas e sistemas enzimáticos. A amostra não deve ser sujeita a oscilações de temperatura e umidade.
CONCLUSÃO
 Violência e crimes contra a vida, tais como explosões de bombas, guerras ou acidentes de avião, tanto quanto casos de corpos carbonizados ou em avançado estágio de decomposição, entre outras circunstâncias, destacam a necessidade de empregar
agressor pelo sistema ABO em 90% dos casos, mas esse método não é muito informativo, e não poderia ser usado se técnicas de amplificação de DNA, tais como perfil de STR estivessem disponíveis. A partir dessas células, também é possível isolar DNA para identificação do agressor.
 Vários estudos estão sendo conduzidos atualmente no sentido de otimizar a metodologia de extração do DNA a partir da saliva depositada na pele para ser usada como evidência em casos forenses, assim como o teste do “double swab”. De acordo com Anzai et al (2005), esse exame permite o estabelecimento do perfil do DNA em 4 de 5 amostras testadas compostas por 250 µL de saliva depositada na pele. Além da coleta de células do próprio corpo humano, é possível coletar amostras de células de objetos que tiveram contato com o corpo, os quais são chamados de artefatos. DNA pode ser isolado em quantidade suficiente para identificação humana pelo exame de gomas mascadas, cigarros, marcas de mordida em comida, entre outros.
 
Cuidados no manuseio das amostras, extração do DNA e amplificação por PCR
 Como observado, vários protocolos são usados para análise e extração do DNA e não existe uma metodologia padrão. Portanto, os pesquisadores devem avaliar cuidadosamente o material a ser examinado, especialmente, quando estiverem lidando com casos forenses, nos quais há um grande risco de contaminação da amostra e influência de fatores ambientais, além de uma quantidade pequena de material disponível em muitas situações.
 A técnica do PCR tem sido a escolha mais comum para investigação das frequências de STRs. Essa técnica permite amplificação de regiões restritas do genoma humano, associado à hibridização genômica. Avanços recentes da técnica da amplificação do comprimento de fragmentos polimórficos tem amplificado o potencial de análise de amostras forenses. Sweet (2001) estabeleceu que o método do PCR permite diferenciação de um indivíduo do outro, com um alto grau de confiança e com 1 ng (um bilionésimo de grama) do DNA alvo.
 De acordo com Brown (1991), aqueles que pretendem trabalhar com análise laboratorial forense adotando a examinação do DNA como metodologia de escolha, e especialmente aqueles que pretendem usar a técnica do PCR como ferramenta de trabalho, deveriam ter atenção e cui-
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Empregar métodos cada vez mais rápidos e acurados durante o processo de identificação de vítimas. Nesses casos, os resultados de vários estudos revisados nesse artigo demonstram que os dentes são uma excelente fonte de DNA, o qual é protegido pelos tecidos epitelial, conjuntivo, muscular e ósseo em caso de incinerações. Adicionalmente, as células da polpa dentária são protegidas pelos tecidos dentais duros (esmalte, dentina e cemento). Entretanto, profissionais da área odontológica que trabalham com a Odontologia Legal deveriam incorporar essas novas tecnologias em seu trabalho, como vários métodos estão disponíveis para extração do DNA a partir de materiais biológicos, ainda a padronização dos protocolos aprovados para tal efeito não foi atingida até agora. Por esse motivo, estudos em biologia molecular aplicados à identificação humana irão, provavelmente, aumentar ainda mais a extração do DNA com cada vez menos material disponível e sob o aumento das condições adversas.
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 TRADUZIDO POR: Mayara Simões Bispo
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