Seminário FMADC - HIV

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Vírus da Imunodeficiência Humana - HIV
Grupo: Igor Henrique
              Paloma Alves
              Sávio Silas
                
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CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Retrovírus
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida – AIDS
A infecção tem origem na transferência de: sémen, lubrificação vaginal, fluido pré-ejaculatório ou leite materno.
Vias de transmissão: relações sexuais desprotegidas, a partilha de seringas contaminadas, e a transmissão entre mãe e filho durante a gravidez ou amamentação.
HIV-1 x HIV-2
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CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Possui a capacidade de infectar células vitais do sistema imune, como: Linfícitos T CD4+, macrófagos e células dendríticas.
Colapso progressivo do sistema imunitário.
Sem tratamento, cerca de 9 em cada 10 pessoas infectadas com HIV, desenvolve AIDS após 10-15 anos.
O tratamento com antirretrovirais aumenta a esperança de vida de portadores do HIV, mesmo que a infeção já tenha evoluído AIDS.
ESTRUTURA
A estrutura do VIH é diferente da de outros retrovírus. É composto por duas cópias de ARN positivo (já está pronto pra ser traduzido) de cadeia única com aproximadamente 9749 nucleotídeos que codifica os nove genes do vírus, envolto por um capsídeo cónico composto de 2000 cópias da proteína viral p24. O ARN de cadeia único está intimamente ligado às proteínas da nucleocapsideB (p7) e às enzimas necessárias ao desenvolvimento do virion como a transcriptase reversa, a aspartato protease, ribonuclease e integrase. O capsídeo é envolto por uma matriz composta pela proteína viral p17, assegurando a integridade da partícula do virion. 
Este conjunto é por sua vez envolto pelo envelope viral, que é composto por duas camadas de fosfolípideos, obtidas a partir da membrana da célula humana quando uma partícula viral recém-formada brota da célula. 
No envelope viral estão incorporadas proteínas da célula hospedeira e cerca de 70 cópias de uma proteína, conhecida por Env, que consiste num conjunto de três moléculas denominadas glicoproteína (gp)120, e uma haste que consiste em três moléculas gp41 que ligam a estrutura ao envelope viral. Este complexo glicoproteico permite ao vírus ligar-se e fundir-se com as células-alvo pra a dar início ao ciclo de infeção. Estas duas proteínas de superfície, sobretudo a gp120, vêm sendo identificadas como o alvo de futuros tratamentos ou vacinas contra o VIH. 
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GENOMA
O genoma de RNA consiste em: 
7 marcos estruturais: LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS e INS;
9 genes: gag, pol, env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu ou vpx (no caso de HIV-2), e por vezes um décimo tev, que consiste numa fusão de tat, env e rev;
19 proteínas
O GENOMA de ARN consiste em pelo menos sete marcos estruturais (LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS e INS) e nove genes ('gag, pol, and env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu, e por vezes um décimo tev, que consiste numa fusão de tat, env e rev), codificando 19 proteínas. Três destes genes, gag, pol e env, contêm a informação necessária para produzir as proteínas estruturais de novas partículas virais.[23] por exemplo, o env codifica uma proteína denominada gp160 que é quebrada por uma protease celular de modo a formar gp120 e gp41. Os outros seis genes, 'tat, rev, nef, vif, vpr, e vpu (ou vpx no caso do VIH-2), são genes reguladores para proteínas que controlam a capacidade do VIH em infectar céulas, produzir novas cópias de si mesmo (replicar-se) ou provocar a doença. 
As duas proteínas Tat (p16 e p14) são trans-ativadorestranscricionais do LTR, atuando ao ligar o elemento ARN do TAR. 
O TAR pode também ser processado em micro-ARNs que regulam os genes da apoptose ERCC1 e IER3. 
A proteína Rev (p19) está envolvida no encerramento dos ARN do núcleo e do citoplasma, ao ligar-se ao elemento de ARN RRE. 
A proteína Vif (p23) previne a ação da APOBEC3G (uma proteína celular que devide os híbridos de ADN:ARN e/ou interfere com a proteína Pol). 
A proteína Vpr (p14) pára a divisão celular e G2/M. 
A proteína Nef (p27) infra-regula o CD4 (o maior receptor viral), assim como as moléculas MHC classe I e II.
A proteína Vpu (p16) influencia a libertação de novas partículas virais a partir de células infectadas. 
As extremidades de cada cadeia de ARN do HIV contêm uma sequência de ARN denominada long terminal repeat (LTR). As regiões no LTR atuam como interruptores que controlam a produção de novos vírus e podem ser ativadas pelas proteínas quer do VIH quer da célula anfitriã. 
O elemento Psi está envolvido no envelope do genoma viral e é reconhecido pelas proteínas Gag e Rev. 
O elemento SLIP está envolvido no deslocamento do quadro de leitura Gag-Pol, necessário para a produção de Polfuncional.
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TROPISMO
O HIV pode infectar diversas células imunitárias, como os linfócitos T CD4+ e macrófagos;
M-trópicas: preferência pelos macrófagos, usam co-receptor de quimiocina CCR5;
T-trópicas: preferência pelos linfócitos T CD4+ usam co-receptor de quimiocina CXCR4;
Tropismo duplo: usam ambos co-receptores de quimiocina.
O VIH pode infectar diversas células imunitárias, como os linfócitos T CD4+, macrófagos. A entrada do VIH-1 nos macrófagos e nos linfócitos CD4+ é mediada através da interação das glicoproteínas do envelope do virião (gp120) com a molécula CD4 nas células-alvo, e ainda através de co-recetores de quimiocina. 
As cadeias do VIH-1 que infectam os macrófagos (M-trópicas) usam os co-recetores de quimiocina CCR5 para entrar, sendo assim capazes de se replicarem em macrófagos e linfócitos T CD4+. Este co-receptor CCR5 é usado por praticamente todos os tipos primários de VIH-1.
As cadeias T-trópicas replicam-se tanto em linfócitos T CD4+ como em macrófagos e usam para entrar o co-recetor de quimiocina CXCR4. Pensa-se que as cadeias VIH-1 de tropismo duplo sejam cadeias de VIH-1 em transição, e portanto capazes de usar como co-recetores de entrada tanto o CCR5 como o CXCR4.
O VIH que usa apenas o co-recetor CCR5 é denominado R5; o que usa apenas o CXCR4 é denominado X4; e o que usa ambos é denominado X4R5.
Algumas pessoas são resistentes a determinadas estirpes de VIH. Por exemplo, pessoas com a mutação CCR5-Δ32 são resistentes a infeções com o vírus R5, uma vez que a mutação impede o VIH de se ligar ao seu co-receptor, reduzindo a sua capacidade de infetar células-alvo. 
Em pessoas infetadas com o subtipo HIV-1, muitas vezes verifica-se a troca de co-recetor durante a fase avançada da doença, e as variantes T-trópicas aparentam poder infectar diferentes linfócitos T através do CXCR4. Estas variantes replicam-se então de forma mais agressiva e com maior virulência, o que provoca a diminuição acentuada dos linfócitos T, o colapso do sistema imunitário e o aparecimento de infecções oportunistas, características da AIDS. 
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TROPISMO
O VIH pode infectar diversas células imunitárias, como os linfócitos T CD4+, macrófagos. A entrada do VIH-1 nos macrófagos e nos linfócitos CD4+ é mediada através da interação das glicoproteínas do envelope do virião (gp120) com a molécula CD4 nas células-alvo, e ainda através de co-recetores de quimiocina. 
As cadeias do VIH-1 que infectam os macrófagos (M-trópicas) usam os co-recetores de quimiocina CCR5 para entrar, sendo assim capazes de se replicarem em macrófagos e linfócitos T CD4+. Este co-receptor CCR5 é usado por praticamente todos os tipos primários de VIH-1.
As cadeias T-trópicas replicam-se tanto em linfócitos T CD4+ como em macrófagos e usam para entrar o co-recetor de quimiocina CXCR4. Pensa-se que as cadeias VIH-1 de tropismo duplo sejam cadeias de VIH-1 em transição, e portanto capazes de usar como co-recetores de entrada tanto o CCR5 como o CXCR4.
O VIH que usa apenas o co-recetor CCR5 é denominado R5; o que usa apenas o CXCR4 é denominado X4; e o que usa ambos é denominado X4R5.
Algumas pessoas são resistentes a determinadas estirpes de VIH. Por exemplo, pessoas com a mutação CCR5-Δ32 são resistentes a infeções com o vírus R5, uma vez que a mutação impede o VIH de se ligar ao seu co-receptor, reduzindo a sua capacidade de infetar células-alvo. 
Em pessoas infetadas
com o subtipo HIV-1, muitas vezes verifica-se a troca de co-recetor durante a fase avançada da doença, e as variantes T-trópicas aparentam poder infectar diferentes linfócitos T através do CXCR4. Estas variantes replicam-se então de forma mais agressiva e com maior virulência, o que provoca a diminuição acentuada dos linfócitos T, o colapso do sistema imunitário e o aparecimento de infecções oportunistas, características da AIDS. 
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CICLO VIRAL
Penetração celular
CICLO VIRAL
Replicação, Transcrição, Montagem e Lançamento
LATÊNCIA E RESERVATÓRIOS DE HIV
O HIV se replica em linfócitos T CD4+ ativos, porque estes expressam fatores necessários para transcrição reversa, integração e expressão do DNA viral. 
Latência pré-integração
Latência pós-integração
DIAGNÓSTICO CONVENCIONAL
Os testes para detecção da infecção pelo HIV podem ser divididos basicamente em quatro grupos: a) detecção de anticorpos; b) detecção de antígenos; c) cultura viral; e d) amplificação do genoma do vírus.
Os testes são empregados em três situações: 
1) triagem sorológica do sangue doado 
2) hemoderivados e órgãos para transplante 
3) estudos de vigilância epidemiológica 
4) diagnóstico da infecção pelo HIV
DIAGNÓSTICO CONVENCIONAL
IMUNOENSAIO
IMUNOENSAIO
IMUNOENSAIO
TESTES RÁPIDOS (TR) 
Tendo em vista que os TR são desenvolvidos para detectar anticorpos anti-HIV em até 30 minutos, os dispositivos são otimizados para acelerar a interação antígeno/anticorpo.
Testes rápidos são primariamente recomendados para testagens presenciais.
TESTES RÁPIDOS (TR)
TESTES COMPLEMENTARES
Embora os testes rápidos e os IE sejam sensíveis e específicos, resultados falso-positivos podem ocorrer.
Estão incluídos nessa categoria: Western blot (WB), Imunoblot (IB) ou imunoensaios em linha (LIA, Line Immuno Assay), incluindo o Imunoblot Rápido (IBR) e imunofluorescência indireta (IFI)
WESTERN BLOT
WESTERN BLOT
TESTES COMPLEMENTARES
O WB e o Imunoblot são de custo elevado e requerem interpretação subjetiva para estabelecer um diagnóstico.
A maioria desses ensaios detectam apenas IgG e por isso não são recomendados para confirmar a presença de anticorpos IgM HIV específicos ou a presença do antígeno p24.
FLUXOGRAMA
FLUXOGRAMA
FLUXOGRAMA
ESTÁGIOS DE INFECÇÃO RECENTE PELO HIV
FALHAS NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV
Existem outras causas de falhas que podem excepcionalmente ocorrer quando se realiza o diagnóstico da infecção pelo HIV:
 1) Ocorrência de infecções causadas por cepas virais com variações genéticas que não são detectadas pelos testes em uso corrente;
 2) Indivíduos “imunosilenciosos” (immunosilents) que possuem níveis baixos ou mesmo ausência de anticorpos específico.
FALHAS NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV
Existem outras causas de falhas que podem excepcionalmente ocorrer quando se realiza o diagnóstico da infecção pelo HIV;
 Controladores de Elite são os indivíduos que cursam a infecção sem viremia, ou com viremia muito baixa.
TESTE MOLECULAR OU IMUNOLÓGICO?!
HIV-1 possui grande potencial de transmissão para o feto/recém nascido;
Crianças de 2 a 24 meses possuem anticorpos de transferência passiva circulando no sangue;
A Coordenação Nacional de DST e AIDS regulamentou o uso da carga viral para o HIV (método quantitativo), para o diagnóstico da infecção em crianças entre 2 e 24 meses de idade.
TESTES MOLECULARES
Teste de Resistência Genotípica aos Antivirais (Genotipagem) 
PCR Qualitativa Para HIV
 HIV PCR Quantitativo em Tempo Real
NASBAR
bDNA (Ensaio de DNA Ramificado)
TESTES MOLECULARES
MÉTODO QUALITATIVO OU QUANTITATIVO?
Testes moleculares qualitativos comercializados, via de regra, detectam DNA viral e não o RNA;
Empregam "primers" de primeira geração que já se revelaram insensíveis para detectar subtipos do HIV-1 diferentes do B clássico;
Testes moleculares quantitativos empregam "primers" de segunda geração, que detectam satisfatoriamente outros subtipos distintos do B clássico.
GENOTIPAGEM
O genoma do HIV (subtipo do vírus) e a presença de mutações de resistencia são úteis na determinação do esquema antirretroviral;
Comumente utilizado em crianças devido a velocidade de progressão da infecção viral;
5-14% dos casos analizados por genotipagem apresentam virus de resistência aos medicamentos utilizados, sendo necessário a troca do esquema antirretroviral;
Para a determinação dos subtipos e mutações de resistência é necessário o sequenciamento de primers específicos para utilização em PCR.
SEQUENCIAMENTO
O HIV possui subtipos de A-H, no Brasil os mais presentes são B, C e F;
Os Genes utilizados para determinação do diagnóstico molecular são: o gag (capsídeo) 1.5 KB, pol 3 KB (enzimas virais, principalmente RT a transcriptase reversa) e env (envelope) 2.5 KB;
2 genes são exclusivos do HIV: 
Tat: aumenta a transcrição do virus no hospedeiro
Rev: exporta o mRNA do virus do núcleo ao citoplasma, impedindo que o RNA seja clivado no núcleo do hospedeiro
O desenvolvimento de primers específicos para esses genes aumenta o espectro de cura do paciente e são associados ao diagnóstico.
SEQUENCIAMENTO DE PRIMERS
TRATAMENTO
O tratamento deva ser iniciado quando os linfócitos T CD4 estiverem abaixo de 350 (Galai N et al. 2004);
Terapêutica antirretrovírica de alta eficácia (em inglês, HAART) permite a estabilização dos sintomas e da viremia;
Nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa(NITR), associados a um não nucleosídeos inibidor da transcriptase reversa (NNITR) inibidor da protease (IP).
REFERÊNCIAS
Wood E, HoggRS, Harrigan PR, Montaner JS. (2005). When to initial antiretroviral therapy in HIV-1-infected adults: a review for clinicians and patients. Lancet Infect. Dis. 5: 407-414.
Wang C, Vlahov D, Galai N; et al. (2004). Mortality in HIV-seropositive versus seronegative persons in the era of highly active antiretroviral therapy. J. Infect. Dis. 190: 1046–54.
Recomendações para Terapia Anti-retroviral em Adultos Infectados pelo HIV – 2008. Ministério da Saúde / Secretaria de Vigilância em Saúde / Programa Nacional de DST e AIDS.Brasília – DF.
BRASIL. Ministério da Saúde. Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais. Manual Técnico para o Diagnóstico da Infecção pelo HIV, 2013. 50 p.