Artigo Miniteste 2 Citoesqueleto

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Acta Scientiae Veterinariae, 2012. 40(3): 1046.
 REVIEW ARTICLE
 Pub. 1046
ISSN 1679-9216 (Online)
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Received: December 2011 www.ufrgs.br/actavet Accepted: March 2012
Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA). Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV). Univer-
sidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, CE, Brazil. CORRESPONDENCE: A.A. Carvalho [adelineandrade@gmail.com - Fax: +55 (85) 3101-9840]. 
LAMOFOPA, Faculdade de Veterinária - UECE. Av. Paranjana n. 1700, Campus do Itaperi. CEP 60.740-903 Fortaleza, CE, Brazil.
Caracterização dos danos celulares em gametas femininos e embriões após 
criopreservação
Characterization of Cellular Damage in Female Gametes and Embryos after Cryopreservation
Adeline de Andrade Carvalho, Luciana Rocha Faustino, Simone Vieira Castro, José Ricardo de Figueiredo & 
Ana Paula Ribeiro Rodrigues
ABSTRACT
Background: Cryopreservation is a biotech successfully employed in female gametes and embryos. This technique is of 
great importance for propagation of genetic material from animals with high-value livestock as well as to preserve the 
fertility of women undergoing cancer treatments. However, low temperatures can result in damage to different cellular 
compartments and organelles. This damage culminates in reduced viability, since they affect cell metabolism.
Review: Cryopreservation consists of maintenance of biological material at low temperatures, in which chemical reactions 
are ceased, however, allowing the cells to preserve their viability. However, the decrease of temperature and subsequent 
warming may result in cellular damage. These damages occur in the cell membrane, cytoplasmic organelles and the cell 
nucleus. It is believed that the fi rst cell structure undergoing cryoinjury is the plasma membrane, responsible for main-
taining homeostasis within the cell, and the loss of plasma membrane during the reduction temperature reported the main 
damage. The membrane damage due to cryopreservation appears to correlate with the reduction of thermal energy at low 
temperatures, thus limiting the movement of molecules through the phospholipids of lipid bilayer. Cryopreservation also 
alters the morphology, structure and cellular distribution of lipid droplets, reducing the survival of oocytes and embryos. 
The physical state changes, besides changing physicochemical properties of intracellular lipid may also result in damage 
to lipids associated with the cellular cytoskeleton. The interaction between cell lipid phase and components of cytoskeleton 
is complex and hardening of these lipids can cause deformation and disruption of cytoskeleton with consequent negative 
effect on cell survival and development. The disruption of cytoskeleton can also be intrinsic to change in dehydration 
and cellular form that follow the cryopreservation process. Among the cellular organelles, mitochondria are sensitive to 
cryopreservation procedures, since the formation of intracellular ice crystals considered one of the most relevant cryoin-
jury, leading to damage to the mitochondrial cristae and matrix. Another important organelle undergoes damage as result 
of cryopreservation is the endoplasmic reticulum, which change in morphology has been described after vitrifi cation of 
embryos. It is also known that cryopreservation may result in fragmentation of DNA even in the absence of deformation 
of the cellular morphology, and that these changes can lead to delay in the development or cell death. In addition to the 
direct damage to double-stranded DNA, cryopreservation may trigger chromosomal abnormalities, these the aneuploidy 
is the most frequent and seems to compromise the developmental competence of oocytes in addition to being indicated as 
the main factor for the low achieve of live births.
Conclusion: Cryopreservation is an important alternative for the preservation of gametes and embryos, however, the 
cells are subjected to unfavorable conditions that can compromise cell recovery after thawing/warming. The main cause 
of reduction in survival oocytes and embryos after cryopreservation appear to be related to damage in different cellular 
compartments and structures, which are essential for maintaining cell metabolism. Thus, it is observed the need to achieve 
cryopreservation protocols capable of maintaining the integrity of different cellular components.
Keywords: cryopreservation, cryoinjury cellular, oocytes, female gametes, embryos, ovarian tissue.
Descritores: criopreservação, crioinjúria celular, oócitos, gametas femininos, embriões, tecido ovariano.
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 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
I. INTRODUÇÃO
II. BASES GERAIS DA CRIOPRESERVAÇÃO CELULAR
III. CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS CÉLULAS EUCARI-
ÓTICAS
IV. PRINCIPAIS DANOS CELULARES CAUSADOS PELA 
CRIOPRESERVAÇÃO
1. Danos de membrana
2. Danos em gotículas lipídicas intracitoplasmáticas 
e citoesqueleto
3. Danos em organelas celulares
4. Danos nucleares
V. CONCLUSÃO
VI. REFERÊNCIAS
I. INTRODUÇÃO
A criopreservação é uma técnica que tem des-
pertado grande interesse para a reprodução assistida 
nos últimos 15 anos, principalmente desde os primeiros 
relatos de nascimentos em ovinos [39] e humanos [25] 
após o transplante de tecido ovariano previamente 
criopreservado. Portanto, é compreensível a aplicação 
cada vez mais frequente dessa técnica com a fi nalidade 
de preservação de gametas femininos com o objetivo 
fi nal de manutenção da função reprodutiva da fêmea 
ou mesmo a produção de crias após impossibilidade 
de reprodução natural ou radicalmente, após a morte 
do animal. 
Considerando a crescente incidência de do-
enças cancerígenas, aliada ao sucesso atual dos trata-
mentos oncológicos, a criopreservação tem ganhado 
ênfase na medicina reprodutiva humana por repre-
sentar uma alternativa para que mulheres, sobretudo 
as jovens, possam gerar fi lhos após o tratamento do 
câncer [78]. Além disso, a criopreservação tem sido 
bastante difundida no âmbito da veterinária por per-
mitir a disseminação de material genético de animais 
de alto valor genético e grande produtividade [117]. 
Adicionalmente, a criopreservação também tem sido 
considerada uma vantajosa ferramenta para preservar 
animais em vias de extinção [114].
Vários estudos têm sido realizados visando 
aperfeiçoar o processo de criopreservação de gametas 
femininos, seja na forma matura [72,78,102] ou ima-
tura [11,49,74], como meio de permitir um melhor 
aproveitamento do potencial reprodutivo mesmo após 
a morte ou impossibilidade da função reprodutiva da 
fêmea. Além da criopreservação de gametas femininos, 
a criopreservação de embriões também tem sido bas-
tante estudada e amplamente difundida e estabelecida 
para aplicação tanto em humanos [86,87] quanto em 
animais [27,83]. Contudo, ainda observa-se a inexis-
tência de um protocolo ideal [67], haja vista as baixas 
taxas de sobrevivência e desenvolvimento oocitário até 
embrião normal [60]. Além disso, também são baixas 
as taxas de sobrevivência e implantação embrionária 
após criopreservação, as quais ainda são consideradas 
muito inferiores àquelas obtidas quando se trata de 
embriões frescos [57].
A criopreservação de células germinativas 
pode ser realizada tanto por congelação lenta como 
por vitrifi cação. Ambos os métodos têm sido empre-
gados em tecidoovariano [66,71], oócitos [12,29,30] 
e embriões [60,85]. Contudo, esse procedimento ain-
da é apontado por alguns autores como uma técnica 
prejudicial às células, que pode resultar em danos em 
diferentes compartimentos celulares, como por exem-
plo, na membrana celular [55], nas organelas [63,94] e 
no núcleo [45,67]. O conhecimento e a caracterização 
desses danos são de grande relevância para a crio-
biologia, visto que a intensidade com que as lesões 
celulares ocorrem pode incapacitar as células de su-
perarem grandes danos, consequentemente, perdendo 
sua viabilidade. Desta forma, a presente revisão tem o 
objetivo de descrever os principais danos originados em 
consequência dos procedimentos de criopreservação 
em tecido ovariano, oócito maturo e embriões oriundos 
de seres humanos e animais. 
II. BASES GERAIS DA CRIOPRESERVAÇÃO CELULAR
A criopreservação consiste na manutenção 
de material biológico a temperaturas criogênicas, nas 
quais todas as reações químicas, processos biológicos 
e atividades físicas intra e extracelulares estão suspen-
sas, contudo, as células conseguem manter-se íntegras, 
preservando sua viabilidade [91]. Essas temperaturas 
são denominadas criogênicas, sendo frequentemente 
utilizado o nitrogênio líquido (-196ºC) para alcançá-
las [7]. Em temperaturas entre 0° e 25ºC a atividade 
celular torna-se lenta, mas ainda está presente. Con-
tudo, abaixo de -40ºC as trocas físico-químicas são 
cessadas e, para garantir a preservação celular por 
tempo indeterminado, as células devem ser mantidas 
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femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
a temperaturas inferiores a -130ºC na presença de 
agentes crioprotetores [7].
Em regiões frias, algumas plantas [9] e ani-
mais [22,84] desenvolveram uma resistência natural 
às baixas temperaturas. Essa resistência consiste na 
capacidade de possibilitar que a água mantenha-se su-
peresfriada em temperaturas próximas a -40ºC [9]. Esta 
adaptação é denominada de aclimatação e geralmente 
envolve a síntese de açúcares intra e extracelulares que 
aumentam a pressão osmótica das células e reduzem 
a injúria por plasmólise a baixas temperaturas [9,22]. 
Contudo, em 1949 foi realizada a descoberta de uma 
substância com a capacidade de atravessar a membrana 
celular e reduzir a formação de cristais de gelo [58,82]. 
Esta substância, isto é, o glicerol, bem como outras com 
propriedades similares, como o propanodiol, etileno-
glicol e dimetilsulfóxido, passaram desde então a ser 
utilizadas com sucesso na criopreservação de células 
e tecidos [17,111].
Apesar dos avanços na criobiologia, tanto a 
redução de temperatura quanto o posterior aquecimento 
celular podem resultar em danos na estrutura da célula 
[9,28]. Esses danos podem ocorrer na membrana celu-
lar [17], nas organelas citoplasmáticas [47,49,50] e até 
mesmo no núcleo da célula [23,67]. Em virtude disso, 
várias pesquisas têm sido realizadas com o intuito de 
conhecer as crioinjúrias ocasionadas e amenizar ou 
reverter os danos celulares decorrente dessas injúrias 
[29,30,107]. Devido à complexidade da estrutura ce-
lular eucariótica e as várias organelas essenciais para 
a sobrevivência da mesma, cada organela será descrita 
em maiores detalhes a seguir.
III. CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS CÉLULAS 
EUCARIÓTICAS
As células de organismos multicelulares 
apresentam forma e estrutura variáveis e se diferen-
ciam de acordo com sua função. No entanto, todas 
as células eucarióticas apresentam uma organização 
básica similar (Figura 1). Esta organização consiste 
em uma membrana celular externa, constituída por 
uma bicamada lipídica com proteínas dispostas nesta 
bicamada [37]. Esta membrana é responsável por de-
limitar o citoplasma, composto por citosol, organelas 
celulares, proteínas e íons; e o núcleo, que alberga o 
material genético da célula, o qual é um compartimento 
altamente organizado e separado do citoplasma por 
uma membrana porosa denominada carioteca [41].
Figura 1. Imagem ilustrativa de uma célula eucariótica evidenciando 
as organelas internas no citoplasma e no núcleo. Imagem concedida por 
Thibodeau e Patton [103].
O citoplasma celular, além de albergar fl uidos 
e enzimas, também contém estruturas físicas altamente 
organizadas, denominadas organelas intracelulares 
[33]. Toda esta estrutura é mantida com auxílio de uma 
complexa rede fi lamentosa chamada de citoesqueleto. 
O citoesqueleto é uma estrutura constituída por micro-
túbulos formados por tubulina α e β, microfi lamentos 
de actina e fi lamentos intermediários específi cos de 
certas células. Todos estes elementos assumem, além 
da função esquelética, outras funções de acordo com 
as proteínas as quais estão associados [49]. 
Nas células eucarióticas, o citoesqueleto tem 
como função principal coordenar a distribuição de 
organelas nas células e manter a forma celular. Sendo, 
portanto, o citoesqueleto responsável pela sustentação 
e resistência celular, bem como por alterações na 
forma e distribuição das organelas desencadeadas por 
interações entre a célula e seu meio e, entre células 
diferentes [41]. Os microtúbulos executam diversas 
funções, dentre elas, a manutenção da estrutura celular, 
o transporte de moléculas, bem como estão envolvidos 
na divisão celular, uma vez que participam da formação 
do fuso meiótico [30].
No citoplasma também estão presentes as or-
ganelas responsáveis pela respiração e energia celular, 
conhecidas como mitocôndrias [20]. A distribuição 
destas organelas parece estar associada com o nível de 
metabolismo celular, através da conversão de piruvato 
à adenosina trifosfato (ATP), substância que atua como 
fonte de energia para a célula [41]. 
As células eucarióticas também possuem or-
ganelas formadas por uma interconexão de túbulos e 
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femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
vesículas. Estas estruturas, conhecidas como retículo 
endoplasmático, são constituídas por membrana, 
matriz endoplasmática e um meio aquoso que ocupa 
o espaço entre os túbulos e vesículas. O retículo en-
doplasmático pode ou não ter sua superfície recoberta 
por ribossomos, sendo, então, denominado de retículo 
endoplasmático rugoso e liso, respectivamente [70]. 
O retículo endoplasmático rugoso ou granular possui 
a capacidade de sintetizar novas moléculas proteicas, 
enquanto o retículo endoplasmático liso, também 
chamado de agranular, tem como função a síntese de 
substâncias lipídicas, incluindo a produção de hormô-
nios esteróides [70]. As substâncias produzidas pelo 
retículo endoplasmático são liberadas no meio extra-
celular através de encapsulamento pelas vesículas do 
complexo de Golgi. Essa organela possui membranas 
semelhantes às membranas do retículo endoplasmático 
agranular e geralmente é composta por várias camadas 
de vesículas achatadas e empilhadas, sendo proemi-
nente em células secretoras [96].
O núcleo celular é um compartimento orga-
nizado no qual são encontrados os cromossomos, 
responsáveis por armazenar as informações genéti-
cas [54]. Durante a divisão celular os cromossomos 
encontram-se aderidos ao fuso meiótico,formado 
por microtúbulos e microfi lamentos de actina [78]. O 
núcleo é considerado o centro de controle da célula 
por conter os genes que determinam as características 
proteicas da célula [54], incluindo proteínas estruturais 
e enzimas que controlam as atividades nucleares e 
citoplasmáticas [41].
Cada compartimento celular citado desempe-
nha um importante papel para manutenção da home-
ostase celular. Entretanto, essa homeostase pode ser 
comprometida em virtude de alterações em diferentes 
estruturas celulares decorrentes da criopreservação, 
conforme detalhado no próximo tópico.
IV. PRINCIPAIS DANOS CELULARES CAUSADOS PELA 
CRIOPRESERVAÇÃO
1. Danos de membrana
De forma geral, todas as membranas celulares 
são sensíveis às crioinjúrias, porém, a sobrevivência 
da célula parece estar mais diretamente relacionada 
com a integridade da membrana plasmática do que 
com as membranas que delimitam as organelas. A 
membrana celular possui maior relevância por atuar no 
procedimento de criopreservação como uma barreira 
semipermeável entre o citoplasma e o meio extracelu-
lar, permitindo o movimento (efl uxo/infl uxo) de água e 
agentes crioprotetores, fundamental para a preservação 
da célula a temperaturas ultra-baixas [105]. Acredita-
se que a membrana seja o primeiro compartimento a 
sofrer injúrias decorrentes do frio e que estas injúrias 
estejam correlacionadas com a redução de temperatura 
a qual a célula é exposta [99]. Um dos graves danos 
decorrentes da criopreservação é a perda de parte da 
membrana plasmática durante a redução de temperatu-
ra [1]. Esta perda membranária é resultado da intensa 
desidratação celular que precisa ocorrer com o intuito 
de reduzir a formação intracelular de gelo de modo a 
garantir o sucesso da criopreservação, desde que esta 
não seja excessiva. Durante a desidratação excessiva 
e consequente estresse hídrico, as células se retraem e 
ocorre uma contração da membrana celular. Esta con-
tração resulta na aproximação de porções de membrana 
permitindo uma interação da bicamada lipídica com 
ocasional fusão da membrana [94], ocorrendo conse-
quentemente formação de vesículas e perda de parte do 
material da membrana. Essa alteração pode culminar 
com a perda de elasticidade da membrana e lise da 
célula ao retornar às condições isotônicas normais [1].
Os danos de membrana decorrentes da crio-
preservação também parecem estar relacionados com 
a redução da energia térmica a baixas temperaturas 
e consequente limitação do movimento de molécu-
las na bicamada lipídica da membrana [37]. Esses 
danos também são infl uenciados pela composição 
lipídica da membrana, que infl uencia diretamente 
suas propriedades, inclusive a resistência ao estresse 
térmico [5,119,121]. Esta composição parece variar 
de acordo com o desenvolvimento e tipo celular. Já 
foi demonstrado, na espécie ovina, que a membrana 
plasmática de zigotos e oócitos em diferentes estágios 
de desenvolvimento possuem diferentes temperaturas 
de solidifi cação, sugerindo ainda que essa variação 
está relacionada com a composição fosfolipídica e 
concentração de colesterol da membrana [120]. 
Ao avaliar ovários humanos criopreservados 
utilizando a congelação lenta na presença de dimetil-
sulfóxido (DMSO), Martinez-Madri [62] observaram 
que 96,7% dos folículos ovarianos apresentavam 
membranas celular e nuclear intactas. A congelação 
lenta de tecido ovariano de cutias (Dasyprocta aguti) 
com propanodiol também foi efi caz em preservar as 
membranas do oócito e das células da granulosa [114]. 
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femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
Contudo, em caprinos foram relatadas alterações na 
membrana nuclear (Figura 2A) após congelação em 
meio contendo DMSO e sacarose [17]. 
Figura 2. Fotomicrografi as demonstrativas da ultraestrutura de folículos 
ovarianos e oócitos submetidos a procedimentos de criopreservação. (A) 
Folículo primordial de mulher incluso em ovário inteiro congelado/descon-
gelado evidenciando um oócito (O) com ruptura de membrana nuclear e 
condensação da cromatina (seta preta) no núcleo do oócito (N). Entre as 
células foliculares (Fc) percebe-se célula folicular alterada com condensa-
ção da cromatina (seta branca). Imagem concedida por Martinez-Madrid 
[62] e autorizada pela Elsevier. (B) Oócito bovino imaturo congelado/
descongelado com gotícula lipídica intacta (1) e com lipólise parcial (2). 
Observam-se áreas de lipólise (seta branca) e mitocôndrias (m). Aumento 
de 8000x. Figura adaptada de Isachenko [48] e autorizada por Wiley 
Job Network. (C) Oócitos equinos maturos vitrifi cados/aquecidos com 
enturgecimento de mitocôndrias e redução de elétron-densidade da matriz 
mitocondrial (setas pretas). Figura concedida por Hochi [46] e autorizada 
pela Elsevier. (D) Folículo suíno incluso em tecido ovariano congelado/
descongelado com mitocôndrias túrgidas (m). (l): gotículas lipídicas, (Nu): 
núcleo, (CG): células da granulosa e (*): espaços vazios. Figura concedida 
por Borges [13] e autorizada pela Elsevier. (E) Folículo ovariano humano 
incluso em tecido vitrifi cado/aquecido com presença de poros na membrana 
nuclear (setas pretas) e retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias (M) 
bem preservados, semelhante ao tecido fresco. Figura concedida por Sheikhi 
[95] e autorizada pela Oxford Journals.
Especifi camente em oócitos, a camada glico-
protéica denominada zona pelúcida, exerce a impor-
tante função de impedir a polispermia e, também, se 
mostra sensível aos procedimentos de criopreservação 
[55,98,106]. A presença de vacúolos e debris na zona 
pelúcida, por exemplo, já foi relatada após criopre-
servação de ovários de camundongas, seja através da 
congelação lenta ou da vitrifi cação [55]. Em geral, 
sabe-se que a criopreservação de oócitos ocasiona 
uma redução na taxa de fecundação do oócito [98] 
provavelmente por mudanças estruturais da zona pe-
lúcida. Essas alterações parecem ser ocasionadas pela 
liberação precoce dos grânulos corticais [16,36,52,64] 
devido a um aumento de cálcio após procedimentos de 
criopreservação [56], resultando no enrijecimento da 
zona pelúcida [52]. Contudo, o exato mecanismo que 
conduz a esse aumento de cálcio no oócito ainda não 
é completamente conhecido. 
Em embriões criopreservados foi demonstra-
da uma sensibilidade relativamente alta da membrana 
plasmática, uma vez que o processo de congelação/
descongelação de embriões reduziu em cerca de 
cinco vezes a fl uidez da membrana de embriões de 
camundongos [2]. Contudo, ao avaliar a transição da 
fase cristalina líquida para a fase cristalina gel (Tm) 
de embriões e oócitos maturos (MII) e imaturos (VG) 
de mulheres, Ghetler et al. [37] observaram que a 
membrana celular de embriões possui uma Tm mais 
baixa que a de oócitos, tornando-os menos sensíveis 
às crioinjúrias. Esta variável está correlacionada 
com uma maior resistência ao frio, uma vez que a 
passagem dos lipídios da fase líquida para a fase 
gel ocorre a uma temperatura mais baixa, na qual os 
processos biológicos e a cinética de lesão são lentos. 
Desta forma, acredita-se que os danos na membrana 
possam ser reduzidos através da perfusão dos agen-
tes crioprotetores a uma temperatura acima da Tm 
da membrana celular, possibilitando o transporte de 
crioprotetor e água através da membrana quando a 
bicamada lipídica ainda encontra-se em fase líquida, 
facilitando o transporte transmembrana [19,51,118].
2. Danos nas gotículas lipídicas intracitoplasmáticas e 
citoesqueletoO sucesso dos protocolos de criopreservação 
de tecido ovariano, oócitos e embriões parece ser di-
fi cultado, em grande parte, pela presença de lipídios 
(Figura 2B), tanto na forma de gotículas lipídicas 
intracitoplasmáticas [35] quanto na composição da 
membrana celular [37], principalmente nas espécies 
suína [13] e canina [50]. Além disso, o procedimento 
de vitrifi cação altera a morfologia, estrutura e distri-
buição celular das gotículas de lipídios [34], reduzindo 
a sobrevivência de oócitos e embriões [37].
Na vitrifi cação de oócitos e embriões suínos, 
algumas pesquisas têm sido realizadas com o intuito 
de reduzir a quantidade de lipídio intracelular [67] e 
6
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
aumentar a sobrevivência oocitária [35] e embrionária 
[67]. Contudo, a centrifugação e a remoção química 
utilizadas nos tratamentos de delipação podem causar 
danos aos oócitos e embriões, tornando as células mais 
frágeis ao processo, especialmente a membrana celular, 
que se torna mais sensível [35].
As gotículas lipídicas parecem estar relacionadas 
aos fi lamentos intermediários do citoesqueleto [15,43]. 
Estes fi lamentos formam uma rede que se estende do 
núcleo à membrana plasmática envolvendo grande parte 
das organelas celulares [15] e já foram descritos em as-
sociação com o retículo endoplasmático [80], complexo 
de Golgi [65] e gotículas lipídicas intracitoplasmáticas 
[43]. A interação de fi lamentos intermediários com gotas 
lipídicas foi reforçada pela associação dessas estruturas 
com a vimentina (grupo de proteínas constituintes dos 
fi lamentos intermediários), observada por Traub [104], 
embora a fi nalidade dessa interação ainda seja desco-
nhecida. No entanto, acredita-se que a interação lipídio-
citoesqueleto possa estar relacionada à manutenção da 
morfologia celular [10], embora o mecanismo pelo qual 
este processo ocorra ainda também não esteja elucidado. 
As mudanças de estado físico, além de alterarem 
as propriedades físico-químicas dos lipídios intracelula-
res [49] podem resultar em danos também nos lipídios 
associados ao citoesqueleto celular [48] (Figura 3). A 
interação entre a fase lipídica das células e os elementos 
do citoesqueleto é complexa e o enrijecimento desses 
lipídios pode causar deformação e ruptura do citoesque-
leto [49], com consequente infl uência na sobrevivência 
e desenvolvimento celular [47,88,112]. 
Figura 3. Imagens representativas do padrão de citoesqueleto de oócitos 
felinos imaturos submetidos à criopreservação evidenciando microfi la-
mentos em vermelho e microtúbulos em verde. Microfi lamentos difusos 
no ooplasma com uma concentração ligeiramente maior na zona pelúcida 
(A), microtúbulos uniformemente distribuídos por todo ooplasma (A’). 
Microfi lamentos e microtúbulos distribuídos de forma irregular no cito-
plasma (B e B’). [Barras = 50 µm]. Figura concedida por Luciano [59] e 
autorizada pela Elsevier.
O rompimento do citoesqueleto pode ser 
uma alteração intrínseca às mudanças na forma e 
desidratação celular que acompanham o processo de 
criopreservação [113]. Em oócitos, as crioinjúrias 
parecem afetar principalmente os microtúbulos [3] e 
a organização do citoesqueleto [75]. Esses criodanos 
podem também ser decorrentes da exposição aos 
agentes crioprotetores, que podem ocasionar a des-
polimerização de microtúbulos e microfi lamentos e 
causar a destruição dos componentes do citoesqueleto 
[24]. A exposição ao crioprotetor, etapa fundamental 
da criopreservação, resultou em discreta redução no 
percentual de distribuição normal dos microfi lamentos 
em oócitos bovinos congelados [94] e oócitos suínos 
vitrifi cados [90]. Além disso, a congelação de oócitos 
bovinos demonstrou um efeito negativo sobre os micro-
fi lamentos, observado pela drástica redução de oócitos 
com distribuição normal dos microfi lamentos [94]. 
Contudo, alguns estudos têm mostrado a efi ci-
ência de protocolos de criopreservação com menores 
danos ao citoesqueleto celular. Em camundongas, a 
avaliação de oócitos imaturos criopreservados (conge-
lação lenta), posteriormente submetidos à maturação 
in vitro, não revelou qualquer alteração signifi cativa na 
organização de microtúbulos e microfi lamentos [29]. 
Em oócitos maturos de equinos vitrifi cados por OPS 
(Open Pulled Straws), Tharasanit et al. [102] observa-
ram um rompimento no citoesqueleto celular, porém, 
a frequência dessa alteração foi baixa. 
Alterações irreversíveis na estrutura dos mi-
crotúbulos podem ser ocasionadas em decorrência do 
estresse osmótico, do efeito solução e da formação de 
cristais de gelo intracelulares, que são efeitos intrínse-
cos ao processo de criopreservação [94]. A manutenção 
da morfologia dos microfi lamentos é tão importante 
quanto a manutenção da morfologia dos microtúbulos. 
A preservação do fuso meiótico de oócitos em MII 
é a principal difi culdade da criopreservação destas 
estruturas. Nesta fase, os cromossomos encontram-se 
dispostos na placa equatorial e os microtúbulos ligados 
aos cromossomos estão estendidos [26], tornando-se 
mais vulneráveis às crioinjúrias. Vários estudos têm 
sugerido que a criopreservação causa alterações na 
polimerização da tubulina de microtúbulos do fuso 
de oócitos em MII, ocasionando uma ruptura no fuso 
meiótico e consequente desorganização da cromatina 
[81,100]. Danos no fuso meiótico já foram relatados 
após a vitrifi cação de oócitos de camundongas [38], 
7
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
ovelhas [100] e mulheres [61]. Em oócitos de coelha 
ovulados e congelados não foi perceptível a presença 
de actina polimerizada (componente dos microfi lamen-
tos), sendo observada a presença de microfi lamentos 
apenas no corpúsculo polar [111]. Contudo, algumas 
equipes sugerem que o citoesqueleto de oócitos em 
estágio de vesícula germinativa seja mais rígido que 
microtúbulos e microfi lamentos de oócitos em estágio 
MII [4]. Uma hipótese é que em função da complexa 
interação entre a fase lipídica das células e os elementos 
do citoesqueleto, o enrijecimento dos lipídios pode 
ocasionar uma deformação e até mesmo ruptura do 
citoesqueleto. No citoesqueleto rígido de oócitos em 
vesícula germinativa o enrijecimento em decorrência 
dos procedimentos de criopreservação torna-se, apa-
rentemente, permanente, enquanto oócitos em MII pa-
recem reverter estes danos em virtude da característica 
fl exível de seu citoesqueleto [48]. 
3. Danos em organelas celulares
Durante o procedimento de criopreservação, as 
células podem sofrer severos danos em sua estrutura. 
Esses danos estão relacionados com a integridade das 
organelas celulares e podem resultar em retardo no 
crescimento folicular [92] e embrionário [67] ou até 
mesmo culminar com a morte da célula [62]. 
As mitocôndrias, organelas essenciais para o 
metabolismo celular, são sensíveis aos procedimentos 
de criopreservação [12,73], apresentando criodanos 
ocasionados tanto pela congelação lenta [62] quanto 
pela vitrifi cação [66]. Aparentemente, a causa mais 
relevante desses danos é a formação de cristaisde gelo 
intracelular, que induz a danos nas cristas e na matriz 
das mitocôndrias [69], acarretando em distanciamento 
das membranas mitocondriais e danos, principalmente, 
à membrana mitocondrial interna [79]. 
A manutenção da morfologia e atividade 
mitocondrial são características indispensáveis para 
diversos eventos que estão envolvidos com a maturação 
citoplasmática e retomada da meiose [108], fertilização 
[115] e desenvolvimento embrionário [8]. Desta forma, 
a preservação dessas organelas caracteriza-se como 
um dos grandes desafi os da criopreservação, uma vez 
que as mitocôndrias estão relacionadas com a produ-
ção de energia celular [8,41] e, consequentemente, a 
integridade mitocondrial está correlacionada com a 
viabilidade celular [88]. 
A vitrifi cação de tecido ovariano de camun-
dongas está relacionada com a redução na quantidade 
de cristas mitocondriais, alterações na morfologia 
mitocondrial [66] e aumento no número de mitocôn-
drias [55,66] tanto nas células da granulosa quanto nos 
oócitos. Após criopreservação rápida (redução de 1°C/
min) de ovário humano inteiro também foi observada 
redução nas cristas mitocondriais [62]. No entanto, 
em tecido ovariano humano submetido à congelação 
lenta observou-se um elevado número de mitocôn-
drias em oócitos de folículos primordiais e primários 
morfologicamente normais, além de matriz com baixa 
densidade e poucas cristas periféricas, características 
consideradas normais em oócitos em estado quiescente 
ou em desenvolvimento inicial [71]. 
Em oócitos humanos maturos vitrifi cados foi 
verifi cada a presença de mitocôndrias com matriz 
elétron-densa e cristas bem preservadas. Contudo, foi 
observada uma fragmentação da matriz mitocondrial e 
desintegração da membrana de algumas mitocôndrias 
[12]. Já após a congelação lenta de oócitos humanos 
maturos (MII) as mitocôndrias encontravam-se unifor-
memente distribuídas no citoplasma. No entanto, estas 
mitocôndrias possuíam aparentes danos nas cristas 
mitocondriais, caracterizadas por cristas que não atra-
vessavam a matriz elétron-densa. Além disso, em um 
alto percentual de oócitos criopreservados (72%) foi 
observada uma redução na densidade da matriz mito-
condrial [40]. Quando a congelação lenta foi utilizada 
em ovários de camundongas, foi observada presença 
de mitocôndrias túrgidas e com poucas cristas [66]. 
As mitocôndrias também têm sido bastante 
investigadas em embriões criopreservados em dife-
rentes espécies, como bovinos [107] e suínos [31], 
uma vez que o ATP produzido pelas mitocôndrias é 
essencial para diversos processos celulares em embri-
ões em desenvolvimento, incluindo a divisão celular 
e replicação do DNA genômico [8]. Em embriões de 
camundongos, após a congelação lenta, foi observado 
que a maioria das mitocôndrias apresentava-se agru-
pada, principalmente, ao longo da membrana celular. 
Dentre as mitocôndrias presentes no citoplasma, 
grande parte exibiu um baixo potencial de membrana, 
evidenciando que a criopreservação é capaz de induzir 
a despolarização da membrana mitocondrial [2]. Em 
bovinos, a congelação lenta de embriões de 7 dias 
não demonstrou alterações nas mitocôndrias. Contu-
do, ao se criopreservar embriões bovinos de 13 dias, 
observou-se danos na membrana das mitocôndrias e 
perda da homogeneidade de sua matriz [69]. 
8
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
Apesar da presença de danos nas mitocôndrias 
decorrentes do procedimento de criopreservação, um 
estudo com blastocistos bovinos vitrifi cados sugere 
que esse tipo de dano pode ser revertido após algumas 
horas de incubação, cultivando-se os embriões pós-
aquecimento [107]. Nesse estudo, embriões analisados 
logo depois de aquecidos demonstraram alterações 
mitocondriais e redução de elétron-densidade da 
matriz ou mitocôndrias túrgidas e com aumento da 
elétron-densidade da matriz. Curiosamente, após 4 h 
de incubação as mitocôndrias retomaram seu tamanho 
normal e apenas uma minoria apresentava áreas com 
redução de elétron-densidade. Após 24 h de incuba-
ção, as mitocôndrias apresentavam-se com formato 
normal e matriz elétron-densa. De forma contrária, em 
blastocistos suínos vitrifi cados observou-se o desaco-
plamento da membrana mitocondrial interna e matriz 
mitocondrial com redução de elétron-densidade [53]. 
Ainda após vitrifi cação de blastocistos suínos, Fabian 
et al. [31] observaram uma degeneração extensiva das 
mitocôndrias com desligamento parcial das membranas 
interna e externa quando os embriões foram cultivados 
por 24 h após aquecimento.
Outra importante organela que sofre danos em 
decorrência da criopreservação é o retículo endoplas-
mático, cuja modifi cação na morfologia foi observada 
após a vitrifi cação de embriões suínos, resultando em 
dilatação do retículo endoplasmático liso e presença 
de pequenas vesículas [31]. Alterações nessa organela 
também foram perceptíveis em oócitos suínos [13] e 
caprinos [17], com enturgecimento da mesma após a 
congelação do tecido ovariano (Figuras 2C e 2D). Acre-
dita-se que essa deformação ocorre como resultado de 
mudanças no balanço iônico causado por alterações 
na permeabilidade da membrana plasmática [21]. O 
entumecimento de retículo endoplasmático e cristas 
mitocondriais [23,45] também foi observado após a 
vitrifi cação de oócitos bovinos maturos e imaturos, 
com estreita proximidade entre as gotículas lipídicas, 
mitocôndrias e retículo endoplasmático [23]. Contudo, 
a congelação lenta de oócitos imaturos inclusos em te-
cido ovariano bovino mostrou-se efi ciente na preserva-
ção dos retículos endoplasmáticos (liso e rugoso), não 
sendo perceptíveis alterações nessas organelas [18].
Em tecido ovariano ovino, após a congelação 
lenta foi observado um número variável de vesículas, 
complexo de Golgi bem desenvolvido e retículos en-
doplasmáticos (liso e rugoso) agregados entre si ou 
formando um complexo com mitocôndrias ou vesículas 
[93]. Essas características evidenciam a preservação 
efi caz destas organelas, uma vez que também foram 
observadas em tecido ovariano fresco de ovinos 
[32], caprinos [97] e humanos [44]. A preservação 
de mitocôndrias e retículos endoplasmáticos (liso e 
rugoso) também foi observada nos oócitos e células 
da granulosa de ovários de camundongas submetidos 
ao procedimento de vitrifi cação [42].
As crioinjúrias resultantes da congelação lenta 
de tecido ovariano humano mostram-se sutis, uma vez 
que após aplicação da técnica observou-se numerosos 
complexos de Golgi e retículo endoplasmático liso e 
rugoso preservados no citoplasma das células folicu-
lares [71]. A vitrifi cação de tecido ovariano humano 
também não resultou em grandes alterações nas organe-
las celulares, confi rmado pela presença de complexos 
de Golgi e retículos endoplasmáticos bem defi nidos 
e abundantes (Figura 2E) [95]. Contudo, quando a 
vitrifi cação foi empregada em oócitos maturos huma-
nos, complexos de Golgi foram encontrados apenas 
ocasionalmente e o citoplasma oocitário mostrou-se 
ocupado de forma homogênea por vesículas dilatadas 
de retículo endoplasmático liso, em virtude da ruptu-
ra destas organelas. Em adição, complexos retículo 
endoplasmático - mitocôndrias foram encontrados 
esporadicamente [12]. 
4. Danos nucleares
A sobrevivência imediata de uma célula de-
pende da sua capacidade de evitar alterações no seu 
DNA. Apesar do grande esforço da célula para manter 
a integridade do seu material genético, diversos proces-sos desafi am essa capacidade intrínseca. Sabe-se que 
a criopreservação pode resultar em fragmentação do 
DNA, mesmo na ausência de deformação da morfolo-
gia celular. Porém, os mecanismos subjacentes a esses 
danos ainda não são conhecidos [68]. Além disso, já 
foi demonstrado que os cromossomos são muito sus-
ceptíveis a alterações decorrentes dos procedimentos 
de criopreservação [14]. Estas alterações podem ser 
divididas em estruturais e numéricas. As alterações 
numéricas podem ainda ser subdividas em alterações 
na qual todo o genoma é multiplicado (poliploidias) 
e alterações no qual apenas poucos cromossomos são 
duplicados ou perdidos (aneuploidias) [54].
Dentre as alterações cromossômicas, a aneu-
ploidia é a mais frequente e parece comprometer o 
desenvolvimento competente do oócito [116], além 
9
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
de ser indicada como o principal fator para a baixa 
obtenção de nascidos vivos [14,67]. Essas alterações 
cromossômicas também podem ser decorrentes da 
criopreservação de oócitos. Van der Elst et al. [109] 
observaram que ao criopreservarem oócitos de camun-
dongas, a formação parcial do fuso meiótico ocasiona 
o deslocamento cromossômico em alguns oócitos, 
podendo resultar em aneuploidia ou retenção do se-
gundo corpúsculo polar no momento da fecundação 
originando, consequentemente, embriões poliplóides.
Em oócitos, o estágio de maturação (oócito 
imaturo ou oócito maturo) tem sido implicado como 
um fator que afeta a qualidade e a competência no 
desenvolvimento após criopreservação [45,76]. Os 
principais danos da criopreservação parecem resultar 
principalmente da ruptura do fuso meiótico [89] (Figu-
ra 4) em decorrência da sensibilidade dos microtúbulos 
à redução de temperatura [23]. No entanto, esse dano 
pode ser minimizado pela capacidade dos microtú-
bulos do fuso meiótico de se reorganizar durante o 
resfriamento/aquecimento [110]. As espécies bovina 
e humana, no entanto, parecem possuir uma menor 
capacidade de recuperação do fuso meiótico devido 
à falta de material pericentriolar em alguns oócitos 
[110]. Essas alterações nos microtúbulos são de fun-
damental importância para o desenvolvimento de um 
oócito competente, pois os microtúbulos participam 
da formação do fuso meiótico e estão associados com 
a segregação cromossômica anormal [30]. 
Figura 4. Padrão de organização do fuso meiótico e de cromossomos em 
oócitos ovinos maturos submetidos à vitrifi cação. Fuso normal (A) com 
cromossomos alinhados na placa metafásica (A’). Fuso assimétrico (B e 
B’). Coluna da direita: marcação de β-tubulina, coluna da esquerda: mar-
cação do DNA com Hoechst. Figura concedida por Asgari [6] e autorizada 
pela Elsevier.
Em oócitos de coelhas naturalmente ovulados 
e congelados com DMSO foi observado um elevado 
número de microtúbulos em torno dos cromossomos, 
semelhante ao observado em oócitos não criopreserva-
dos. No entanto, quando os oócitos foram congelados 
na presença de propanodiol, o fuso meiótico não apre-
sentava conformação normal, além de apresentarem 
microtúbulos dispersos no citoplasma celular [111]. 
Analisando-se oócitos suínos imaturos submetidos 
à vitrifi cação, foi observada uma redução de oócitos 
com organização do fuso normal (79,5% no controle 
ou não vitrifi cado vs 10,1% vitrifi cado) e, consequen-
temente, um aumento de oócitos com fuso anormal 
(15,6% controle vs 46,5% vitrificado) e ausente 
(4,8% controle vs 43,2% vitrifi cado). Curiosamente, 
os oócitos vitrifi cados mantiveram o alinhamento cro-
mossômico regular, mesmo quando apresentavam fuso 
anormal. Quando avaliada a percentagem de F-actina 
(componente dos microfi lamentos que formam o fuso 
meiótico) foi observado que a vitrifi cação de oócitos 
imaturos (VG) parece ser mais deletéria aos microfi la-
mentos do que a vitrifi cação de oócitos maturos (16,9 
vs 37,2% respectivamente). Contudo, o procedimento 
de vitrifi cação, independente do estágio de maturação 
oocitária, mostrou uma redução no percentual de nor-
malidade do fuso quando comparado a oócitos frescos 
(72,3%) [117].
Após vitrifi cação de oócitos maturos de camun-
dongas observou-se uma redução de cromossomos nor-
mais de oócitos desnudos vitrifi cados (67,2%) quando 
comparados a oócitos frescos (80,4%). Além disso, a 
taxa de fuso meiótico normal reduziu de 79,8% para 
60,6%, quando os oócitos foram submetidos à vitrifi -
cação [77]. No entanto, a congelação lenta de oócitos 
maturos de camundongas parece ser mais danosa ao 
fuso meiótico, visto que o formato de barril caracterís-
tico do fuso meiótico foi reduzido de 97% em oócitos 
não criopreservados para 18% em oócitos congelados. 
Os demais oócitos congelados exibiram características 
anormais do fuso como por exemplo, fuso fusiforme ou 
retração nos pólos. A congelação lenta também resultou 
em menor percentual de cromossomos corretamente 
alinhados (78%) quando comparados a oócitos não 
congelados (97%) [30]. Em oócitos maturos ovinos 
vitrifi cados, também foi perceptível a redução do ali-
nhamento cromossômico normal (79,14% em oócitos 
frescos vs 11,11% em oócitos vitrifi cados) [6]. 
10
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
Em pesquisa realizada com embriões humanos 
foi observado que a sobrevivência embrionária pós-
congelação está relacionada com o número de células, 
cujo núcleo foi preservado, e a redução da sobrevivên-
cia embrionária foi relacionada com o maior número 
de células do embrião no momento da criopreserva-
ção [101], sugerindo que embriões em estágio mais 
avançado podem ser mais susceptíveis às crioinjúrias. 
A vitrifi cação de embriões suínos resultou em um 
acréscimo na perda de gestações [67] correlacionada 
principalmente com aneuplodia [14]. No entanto, 
ainda não é conhecido o mecanismo exato pelo qual 
essas alterações cromossômicas são ocasionadas nem 
o estágio ao qual o embrião está mais vulnerável aos 
danos nucleares.
V. CONCLUSÃO
A criopreservação é uma importante alternativa 
para a preservação de gametas e embriões, sendo, por 
isso, bastante aplicada para armazenar o material gené-
tico de animais com alto valor zootécnico, bem como 
restaurar a fertilidade de mulheres após tratamentos 
oncológicos. Contudo, este procedimento submete as 
células a condições desfavoráveis que podem com-
prometer a recuperação celular após descongelação/
aquecimento. Conforme apontado no decorrer desta 
revisão, diversos autores têm demonstrado que a cau-
sa na redução da sobrevivência de oócitos, folículos 
ovarianos (presentes ou isolados do tecido ovariano) 
e embriões após criopreservação está relacionada 
com danos em diferentes compartimentos e estruturas 
celulares. Essas estruturas são essenciais para o meta-
bolismo e viabilidade da célula e, portanto, a aplicação 
de um protocolo de criopreservação capaz de manter 
essas estruturas intactas deve levar em conta o grau de 
desenvolvimento, tipo e número de células.
Declaration of interest. The authors report no confl icts of 
interest. The authors alone are responsible for the content and 
writingof the paper.
REFERÊNCIAS
1 Acker J.P. & McGann L.E. 2003. Protective effect of intracellular ice during freezing? Cryobiology. 46(2): 197-202.
2 Ahn H.J., Sohn I.P., Kwon H.C., Jo D.H., Park Y.D. & Min C.K. 2002. Charateristics of the cell membrane fl uidity, 
actin fi bers, and mitochondrial disfunctions of frozen-thawed two-cell mouse embryos. Molecular Reproduction and 
Development. 61(4): 466-476.
3 Albertini D.F. & Eppig J.J. 1995. Unusual cytoskeletal and chromatin confi gurations in mouse oocytes that are atypi-
cal in meiotic progression. Developmental Genetics. 16(1): 13-19.
4 Allworth A.E. & Albertini D.F. 1993. Meiotic maturation in cultured bovine oocytes is accompanied by remodeling 
of the cumulus cell cytoskeleton. Developmental Biology. 158(1): 101-112.
5 Arav A., Pearl M. & Zeron Y. 2000. Does membrane lipid profi le explain chilling sensitivity and membrane lipid 
phase transition of spermatozoa and oocytes? Cryo Letters. 21(3): 179-186.
6 Asgari V., Hosseini S.M., Ostadhosseini S., Hajian M. & Nars-Esfahani M.H. 2011. Time dependent effect of 
post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrifi ed in vitro 
matured sheep oocytes. Theriogenology. 75(5): 904-910.
7 Bakhach J. 2009. The cryopreservation of composite tissues - Principles and recent advancement on cryopreservation 
of different type of tissues. Organogenesis. 5(3): 119-126.
8 Bavister B.D. 1995. Culture of pre-implantation embryo: facts and artifacts. Human Reproduction Update. 1(2): 91-148.
9 Benson E.E. 2008. Cryopreservation Theory. In: Reed B.M. (Ed). Plant Cryopreservation: A Practical Guide. Corval-
lis: Springer, pp.15-32.
10 Bodin S., Soulet C., Tronchère H., Sié P., Gachet C., Plantavid M. & Payrastre B. 2005. Integrin-dependent inter-
action of lipid rafts with the actin cytoskeleton in activated human platelets. Journal of Cell Science. 118(4): 759-769.
11 Bogliolo L., Ariu F., Fois S., Rosati I., Zedda M.T., Leoni G., Succu S., Pau S. & Ledda S. 2007. Morphological and 
biochemical analysis of immature ovine oocytes vitrifi ed with or without cumulus cells. Theriogenology. 68(8): 1138-1149.
12 Bonetti A., Cervi M., Tomei F., Marchini M., Ortolani F. & Manno M. 2011. Ultrastructural evaluation of human 
metaphase II oocytes after vitrifi cation: closed versus open devices. Fertility and Sterility. 95(3): 928-935.
13 Borges E.N., Silva R.C., Futino D.O., Rocha-Junior C.M.C., Amorim C.A., Báo S.N. & Lucci C.M. 2009. Cryop-
reservation of swine ovarian tissue: Effect of different cryoprotectants on the structural preservation of preantral follicle 
oocytes. Cryobiology. 59(2): 195-200.
11
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
14 Burgoyne P.S., Holland K. & Stephens R. 1991. Incidence of numerical chromosome anomalies in human pregnancy 
estimation from induced and spontaneous abortion data. Human Reproduction. 6(4): 555-565.
15 Carmo-Fonseca M. & David-Ferreira J.F. 1990. Interactions of intermediate fi laments with cell structures. Electron 
Microscopy Reviews. 3(1): 115-141.
16 Carroll J., Depypere H. & Matthews C.D. 1990. Freeze-thaw-induced changes of the zona pellucida explains de-
creased rates of fertilization in frozen-thawed mouse oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. 90(2): 547-553.
17 Castro S.V., Carvalho A.A., Silva C.M., Faustino L.R., Campello C.C., Lucci C.M., Báo S.N., Figueiredo J.R. & 
Rodrigues A.P.R. 2011. Freezing solution containing dimethylsulfoxide and fetal calf serum maintains survival and 
ultrastructure of goat preantral follicles after cryopreservation and in vitro culture of ovarian tissue. Cell and Tissue 
Research. 346(2): 283-92.
18 Celestino J.J.H., Santos R.R., Lopes C.A.P., Martins F.S., Matos M.H.T., Melo M.A.P., Báo S.N., Rodrigues 
A.P.R., Silva J.R.V. & Figueiredo J.R. 2008. Preservation of bovine preantral follicle viability and ultra-structure 
after cooling and freezing of ovarian tissue. Animal Reproduction Science. 108(3-4): 309-318.
19 Cha K.Y., Chung H.M., Lim J.M., Ko J.J., Han S.Y., Choi D.H. & Yoon T.K. 2000. Freezing immature oocytes. 
Molecular and Cellular Endocrinology. 169(1-2): 43-47.
20 Chan D.C. 2006. Mitochondria: Dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125(7): 1241-1252.
21 Coss R.A., Dewey W.C. & Bamburg J.R. 1979. Effects of hyperthermia (41,5°) on Chinese hamster ovary cells 
analyzed in mitosis. Cancer Research. 39: 1911-1918.
22 Crowe J.H., Hoekstra F.A. & Crowe L.M. 1992. Anhydrobiosis. Annual review of Physiology. 54: 579-599.
23 Diez C., Duque P., Gómez E. Hidalgo C.O., Tamargo C., Rodríguez A., Fernández L., De La Varga S., Frenández 
A., Facal N. & Carbajo M. 2005. Bovine oocyte vitrifi cation before or after meiotic arrest: effects on ultrastructure 
and developmental ability. Theriogenology. 64 (2): 317-333.
24 Dobrinsky J.R. 2002. Advancements in cryopreservation of domestic animal embryos. Theriogenology. 57(1)-285-302.
25 Donnez J., Dolmans M.M., Demylle D., Jadoul P., Pirard C., Squiffl et J., Martinez-Madrid B. & Van Langendonckt 
A. 2004. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364(9443): 1405-1410.
26 Ducibella T., Schultz R.M. &Ozil J.P. 2006. Role of calcium signals in early development. Seminars in Cell & De-
velopmental Biology. 17(2): 324-332.
27 Dulioust E., Toyama K., Busnel M.C., Moutier R., Carlier M., Marchaland C., Ducot B., Roubertoux P. & 
Auroux M. 1995. Long-term effects of embryo freezing in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of 
the United States of America. 92(2): 589-593.
28 Elliott J.A.W. 2010. Introduction to the special issue: Thermodynamic aspects of cryobiology. Cryobiology. 60(1): 
1-3.
29 Eroglu A., Toner M., Leykin L. & Toth T.L. 1998. Cytoskeleton and polyploidy after maturation and fertilization of 
cryopreserved germinal vesicle-stage mouse oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 15(7):447-454.
30 Eroglu A., Toth T.L. & Toner M. 1998. Alterations of the cytoskeleton and polyploidy induced by cryopreservation 
of metaphase II mouse oocytes. Fertility and Sterility. 69(5): 944-957.
31 Fabian D., Gjørret J.O., Berthelot F., Martinat-Botté F. & Maddox-Hyttel P. 2005. Ultrastructure and cell death 
of in vivo derived and vitrifi ed porcine blastocysts. Molecular Reproduction and Development. 70(2): 155-165.
32 Fair T., Hulshof S.C.J., Hyttel P., Greve T. & Boland M. 1997. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early 
tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195(4): 327-336.
33 Foster L.J., Hoog C.L., Zhang Y., Zhang Y., Xie X., Mootha V.K. & Mann M. 2006. A mammalian organelle map 
by protein correlation profi ling. Cell. 125(1): 187-199.
34 Fu X.W., Shi W.Q., Zhang Q.J., Zhao X.M., Yan C.L., Hou Y.P., Zhou G.B., Fan Z.Q., Suo L., Wusiman A., Wang 
Y.P & Zhu S.E. 2009. Positive effects of Taxol pretreatment on morphology, distribution and ultrastructure of mitochondria 
and lipid droplets in vitrifi cation of in vitro matured porcine oocytes. Animal Reproduction Science. 115(1-4): 158-168.
35 Fu X.W., Wu G.Q., Li J.J., Hou Y.P., Zhou G.B., Suo L., Wang Y.P. & Zhu S.E. 2011. Positive effects of Forskolin 
(stimulator of lipolysis) treatment on cryosurvival of matured porcine oocytes. Theriogenology. 75(2): 268-275.
36 Fuku E., Xia L. & Downey B.R. 1995. Ultrastructural changes in bovine oocytes cryopreserved by vitrifi cation. 
Cryobiology.32(2): 139-156.
12
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
37 Ghetler Y., Yavin S., Shalgi R. & Arav A. 2005. The effect of chilling on membrane lipid phase transition in human 
oocytes and zygotes. Human Reproduction. 20(12): 3385-3389.
38 Gomes C.M., Silva C.A.S., Acevedo N., Baracat E., Serafi ni P. & Smith G.D. 2008. Infl uence of vitrifi cation on 
mouse metaphase II oocyte spindle dynamics and chromatin alignment. Fertility and Sterility. 90(4): 1396-1404.
39 Gosden R.G., Baird D.T., Wade J.C. & Webb R. 1994. Restoration of fertility to oophorectomized sheep by ovarian 
autografts stored at -196°C. Human Reproduction. 9(4): 597-603.
40 Gualtieri R., Iaccarino M., Mollo V., Prisco M., Iaccarino S. & Talevi R. 2009. Slow cooling of human oocytes: 
ultrastructural injuries and apoptotic status. Fertility and Sterility. 91(4): 1023-1034.
41 Guyton A.C. & Hall J.E. 2006. The Cell and Its Functions. In: Textbook of Medical Physiology. Philadelphia: Elsevier 
Saunders, pp.11-26.
42 Haidari K. Salehnia M. & Valojerdi M.R. 2008. The effect of leukemia inhibitory factor and coculture on the in 
vitro maturation and ultrastructure of vitrifi ed and nonvitrifi ed isolated mouse preantral follicles. Fertility and Sterility. 
90(6): 2389-2397.
43 Hall P.F. 1997. The roles of calmodulin, actin, and vimentin in steroid synthesis by adrenal cells. Steroids. 62(1): 185-189. 
44 Hertig A.T. & Adams E.C. 1967. Studies on the human oocyte and its follicle. I. Ultrastructural and histochemical 
observation on the primordial follicle stage. The Journal of Cell Biology. 34(2): 647-675.
45 Hochi S., Ito K., Hirabayashi M., Ueda M., Kimura K. & Hanada A. 1998. Effect of nuclear stages during IVM 
on the survival of vitrifi ed-warmed bovine oocytes. Theriogenology. 49(4): 787-796.
46 Hochi S., Kozawa M., Fujimoto T., Hondo E., Yamada J. & Oguri N. 1996. In vitro maturation and transmission 
electron microscopic observation of horse oocytes after vitrifi cation. Cryobiology. 33(3): 300-310.
47 Hyttel P., Vajta G. & Callesen H. 2000. Vitrifi cation of bovine oocytes with the open pulled straw method: ultra-
structural consequence. Molecular Reproduction and Development. 56(1): 80-88.
48 Isachenko V., Isachenko E., Michelmann H.W., Alabart J.L., Vazquez I., Bezugly N. & Nawroth F. 2001. Lipolysis 
and ultrastructural changes of intracellular lipid vesicles after cooling of bovine and porcine GV-oocytes. Anatomia, 
Histologia, Embryologia. 30(6): 333-338.
49 Isachenko V., Soler C., Isachenko E., Perez-Sanchez F. & Grishchenko V. 1998. Vitrifi cation of immature porcine 
oocytes: effects of lipid droplets, temperature, cytoskeleton, and addition and removal of cryoprotectant. Cryobiology. 
36(3): 250-253.
50 Ishijima T., Kobayashi Y., Lee D.S., Ueta Y.Y., Matsui M., Lee J.Y., Suwa Y., Miyahara K. & Suzuki H. 2006. 
Cryopreservation of canine ovaries by vitrifi cation. Journal of Reproduction and Development. 52(2): 293-299.
51 Jelinkova L., Selman H.A., Arav A., Strehler E., Reeka N. & Sterzik K. 2002. Twin pregnancy after vitrifi cation 
of 2-pronuclei human embryos. Fertility and Sterility. 77(2): 412-414.
52 Johnson M.H., Pickering S.J. & George M.A. 1988. The infl uence of cooling on the properties of the zona pellucida 
of the mouse oocyte. Human Reproduction. 3(3): 383-387.
53 Kaidi S., Bernard S., Lambert P., Massip A., Dessy F. & Donnay I. 2001. Effect of conventional controlled-rate 
freezing and vitrifi cation on morphology and metabolism of bovine blastocysts produced in vitro. Biology of Reproduc-
tion. 65(4): 1127-1134.
54 Karp G. 2002. O núcleo da célula e o controle da expressão gênica. In: Biologia Celular e Molecular. 3.ed. Barueri: 
Manole, pp.494-550.
55 Kim G.A., Kim H.Y., Kim J.W., Lee G., Lee E. & Lim J.M. 2010. Ultrastructural deformity of ovarian follicles 
induced by different cryopreservation protocols. Fertility and Sterility. 94(4): 1548-1550.
56 Larman M.G., Sheehan C.B. & Gardner D.K. 2006. Calcium-free vitrifi cation reduces cryoprotectant-induced zona 
pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131(1): 53-61.
57 Lin T.A., Chen C.H., Sung L.Y., Carter M.G., Chen Y.E., Du F., Ju J.C. & Xu J. 2011. Open-pulled straw vitrifi cation 
differentiates cryotolerance of in vitro cultured rabbit embryos at the eight-cell stage. Theriogenology. 75(4): 760-768.
58 Lovelock J.E. 1953. The haemolysis of human red blood cells by freezing and thawing. Biochimica et Biophysica 
Acta. 10(3): 414-426.
59 Luciano A.M., Chigioni S., Lodde V., Franciosi F., Luvoni G.C. & Modina S.C. 2009. Effect of different cryop-
reservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle 
stage oocytes. Cryobiology. 59(1): 90-95.
13
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
60 Magli M.C., Lappi M., Ferraretti A., Capoti A., Ruberti A. & Gianaroli L. 2010. Impact of oocyte cryopreserva-
tion on embryo development. Fertility and Sterility. 93(2): 510-516.
61 Martinéz-Burgos M., Herrero L., Magías D., Salvanes R., Mantoya M.C., Cobo A.C. & Garcia-Velasco J. 2011. 
Vitrifi cation versus slow freezing of oocytes: effects on morphologic appearance, meiotic spindle confi guration, and 
DNA damage. Fertility and Sterility. 95(1): 374-377.
62 Martinez-Madrid B., Camboni A., Dolmans M.M., Nottola S., Van Langendonckt A. & Donnez J. 2007. Apoptosis 
and ultrastructural assessment after cryopreservation of whole human ovaries with their vascular pedicle. Fertility and 
Sterility. 87(5): 1153-1165.
63 Massip A., Mermillod P. & Dinnyes A. 1995. Morphology and biochemistry of in vitro produced bovine embryos: 
implications for their cryopreservation. Human Reproduction. 10(11): 3004-3011.
64 Matson P.L., Graefl ing J., Junk S.M., Yovich J.L. & Edirisinghe W.R. 1997. Cryopreservation of oocytes and 
embryos: use of a mouse model to investigate effects upon zona hardness and formulate treatment strategies in an in 
vitro fertilization programme. Human Reproduction. 12(7): 1550-1553.
65 Mayerson P.L. & Brumbaugh J.A. 1981. Lavender, chick melanocyte mutant with defective melanosome transloca-
tion: a possible role for 10 nm fi laments and microfi laments but not microtubules. Journal of Cell Science. 51: 25-51.
66 Mazoochi T., Salehnia M., Valojerdi M.R. & Mowla J. 2008. Morphologic, ultrastructural, and biochemical iden-
tifi cation of apoptosis in vitrifi ed-warmed mouse ovarian tissue. Fertility and Sterility. 90(4): 1480-1486.
67 Men H., Agca Y., Riley L. & Crister J.K. 2006. Improved survival of vitrifi ed porcine embryos after partial delipa-
tion through chemically stimulated lipolysis and inhibition of apoptosis. Theriogenology. 66(8): 2008-2016.
68 Men H., Monson R.L. & Rutledge. 2002. Effect of meiotic stages and maturation protocols on bovine oocyte’s 
resistance to cryopreservation. Theriogenology. 57(3): 1095-1103.
69 Mohr L.R. & Trounson A.O. 1981. Structural changes associated with freezing of bovine embryos. Biology of Re-
production. 25(5): 1009-1025.
70 MothesW., Heinrich S.U., Graf R., Nilsson I., Von Heijne G., Brunner J. & Rapoport T.A. 1997. Molecular 
mechanism of membrane protein integration into the endoplasmic reticulum. Cell. 89(4): 523-533.
71 Nottola S.A., Camboni A., Van Langendonkt A., Demylle D., Macchiarelli G., Dolmans M.M., Martinez-Madrid 
B., Correr S. & Donnez J. 2008. Cryopreservation and xenotransplantation of human ovarian tissue: an ultrastructural 
study. Fertility and Sterility. 90(1): 23-32.
72 Nottola S.A., Cotticchio G., Sciajno R., Gambardella A., Maione M., Scaravelli., Bianchi S., Macchiarelli G. 
& Borini A. 2009. Ultrastructural markers of quality in human mature oocytes vitrifi ed using cryoleaf and cryoloop. 
Reproductive BioMedicine Online. 19(Suppl 3): 17-27.
73 Nottola S.A., Macchiarelli G., Coticchio G., Bianchi S., Cecconi S, De Santis L. Scaravelli G., Flamigni C. & 
Borini A. 2007. Ultrastructure of human mature oocytes after slow cooling cryopreservation using different sucrose 
concentrations. Human Reproduction. 22(4):1123-1133.
74 Oktay K., Newton H., Aubard Y., Salha O. & Gosden R.G. 1998. Cryopreservation of immature human oocytes 
and ovarian tissue: an emerging technology? Fertility and Sterility. 69(1): 1-7.
75 Overstrom E.W., Paqui-Platls D., Toner M. & Cravacho E.G. 1990. Cryoprotectant and thermal effect on cytoskel-
etal organization and IVF rate of mouse oocytes. Biology of Reproduction. 42(Suppl 1):175.
76 Palasz A.T. & Mapletoft R.J. 1996. Cryopreservation of mammalian embryos and oocytes: Recent advances. Bio-
technology Advances. 14(2): 127-149.
77 Park S.E., Chung H.M., Cha K.Y., Hwang W.S., Lee E.S. & Lim J.M. 2001. Cryopreservation of ICR mouse 
oocytes: improved post-thawed preimplantation development after vitrifi cation using Taxol™, a cytoskeleton stabilizer. 
Fertility and Sterility. 75(6): 1177-1184.
78 Park S.E., Son W.Y., Lee SH., Lee K.A., Ko J.J. & Cha K.Y. 1997. Chromosome and spindle confi gurations of 
human oocytes matured in vitro after cryopreservation at the germinal vesicle stage. Fertility and Sterility. 68(5): 920-
926.
79 Partridge R.J., Wrathall A.E. & Leese H.J. 1995. Glucose uptake and lactate production by single frozen-thawed 
bovine embryos produced in vivo or by in vitro fertilization. Journal of Reproduction and Fertility. 13:41.
80 Pelliniemi L.J., Dym M. & Paranko J. 1982. Cytoplasmic fi laments in fetal Leydig cells. Annals of the New York 
Academy of Sciences. 383(1): 486-487.
14
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterização dos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
81 Pickering S.J. & Johnson M.H. 1987. The infl uence of cooling on the organization of themeiotic spindle of the mouse 
oocyte. Human Reproduction. 2(3): 207-216.
82 Polge C., Smith A.U., & Parkes A.S. 1949. Revival of spermatozoa after vitrifi cation and dehydration at low tem-
peratures. Nature. 164(4172): 666.
83 Popelková M., Chrenek P., Pivko J., Makarevich A.V., Kubovičová E. & Kačmárik J. 2005. Survival and ul-
trastructure of gene-microinjected rabbit embryos after vitrifi cation. Zygote. 13(4): 283-293.
84 Potts M. 1994. Desiccation tolerance of prokaryotes. Microbiological Reviews. 58(4): 755-805.
85 Ptak G., Dattena M., Loi P., Tischner M. & Cappai P. 1999. Ovum pick-up in sheep: effi ciency of in vitro embryo 
production, vitrifi cation and birth of offspring. Theriogenology. 52(6): 1105-1114.
86 Quintans C.J., Donaldson M.J., Bertolino M.V. & Pasqualini R.S. 2002. Birth of two babies using oocytes that 
were cryopreserved in a choline-based freezing médium. Human Reproduction. 17(12): 3149-3152.
87 Reed M.L., Lane M., Gardner D.K., Jensen N.L. & Thompson J. 2002. Vitrifi cation of human blastocysts using the 
cryoloop method: successful clinical application and birth of offspring. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 
19(6): 304-306.
88 Rho G.J., Kim S.N, Yoo J.G., Balasubramanian S., Lee H.J & Choe S.Y. 2002. Microtubulin confi guration and 
mitochondrial distribution after ultra-rapid cooling of bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 63(4): 
464-470.
89 Rienzi L., Martinez F., Ubaldi F., Minasi M.G., Iacobelli M., Tesarik J. & Greco E. 2004. Polscop analysis of 
meiotic spindle changes in living metaphase II human oocytes during the freezing and thawing procedures. Human 
Reproduction. 19: 655-659.
90 Rojas C., Palomo M.J., Albarracín J.L. & Mogas T. 2004. Vitrifi cation of immature and in vitro matured pig oocytes: 
study of distribution of chromosomes, microtubules, and actin microfi laments. Cryobiology. 49(3): 211-220.
91 Rubinsky B. 1989. The energy equation for freezing of biological tissue. Journal of Heat Transfer. 111(4): 988-997.
92 Santos R.R., Knijn H.M., Vos P.L.A.M., Oei C.H.Y., Van Loon T., Colenbrander B., Gadella B.M., Van den 
Hurk R. & Roelen B.A.J. 2009. Complete follicular development and recovery of ovarian function of frozen-thawed, 
autotransplanted caprine ovarian cortex. Fertility and Sterility. 91(Suppl 4): 1455-1458. 
93 Santos R.R., Rodrigues A.P.R., Costa S.H.F., Silva J.R.V., Matos M.H.T., Lucci C.M., Báo S.N., Van Den Hurk 
R. & Figueiredo J.R. 2006. Histological and ultrastructural analysis of cryopreserved sheep preantral follicles. Animal 
Reproduction Science. 91(3-4): 249-263.
94 Saunders K.M. & Parks J.E. 1999. Effects of cryopreservation procedures on the cytology and fertilization rate of 
in vitro-matured bovine oocytes. Biology of Reproduction. 61(1): 178-187.
95 Sheikhi M., Hultenby., Niklasson B., Lundqvist. & Hovatta O. 2011. Clinical grade vitrifi cation of human ovarian 
tissue: an ultrastructural analysis of follicles and stroma in vitrifi ed tissue. Human Reproduction. 26(3): 594-603.
96 Shorter J. & Warren G. 2002. Golgi architecture and inheritance. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 
18:379-420.
97 Silva J.R.V., Báo S.N., Lucci C.M., Carvalho F.C.A., Andrade E.R., Ferreira M.A.L. & Figueiredo J.R. 2001. 
Morphological and ultrastructural changes occurring during degeneration of goat preantral follicles preserved in vitro. 
Animal Reproduction Science. 66(3-4): 209-223.
98 Somfai T., Ozawa M., Noguchi J., Kaneko H., Karja N.W.K., Farhudin M., Dinnyés A., Nagai T. & Kikuchi K. 2007. 
Developmental competence of in vitro-fertilized porcine oocytes after in vitro maturation and solid surface vitrifi cation: 
Effect of cryopreservation on oocyte antioxidative system and cell cycle stage. Cryobiology. 55(2): 115-126.
99 Steponkus P.L. 1984. Role of the plasma membrane in freezing injury and cold acclimation. Annual Review of Plant 
Physiology. 35(1): 543-584.
100 Succu S., Leoni G.G., Bebbere D., Berlinguer F., Mossa F., Bogliolo L., Madeddu M., Ledda S. & Naitana S. 
2007. Vitrifi cation devices affect structural and molecular status of in vitro matured ovine oocytes. Molecular Repro-
duction and Development. 74(10): 1337-1344.
101 Testart J., Lassalle B., Belaisch-Allart J., Hazout A., Forman R., Rainhorn J.D. & Frydman R. 1986. High 
pregnancy rate after early human embryo freezing. Fertility and Sterility. 46(2): 268-272.
102 Tharasanit T., Colenbrander B. & Stout T.A.E. 2006. Effect of maturation stage at cryopreservation on post-thaw 
cytoskeleton quality and fertilizability of equine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 73(5): 627-637. 
15
 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V . Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues. 2012. Caracterizaçãodos danos celulares em gametas 
femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): 1046.
www.ufrgs.br/actavet
Pub. 1046
103 Thibodeau G.A. & Patton K.T. 2006. Células e Tecidos. In: Estrutura e Funções do Corpo Humano. 11.ed. Barueri: 
Manole, pp.20-27.
104 Traub P., Perides G., Kuhn S. & Scherberth A. 1987. Effi cient interaction of nonpolar lipids with intermediate 
fi laments of the vimentin type. European Journal of Cell Biology. 43(1): 55-64.
105 Uemura M. & Steponkus P.L.1994. A contrast of the plasma membrane lipid composition of oat and rye leaves in 
relation to freezing tolerance. Plant Physiology. 104(2): 479-496.
106 Vajta G., Holm P., Kuwayama M., Booth P.J., Jacobsen H., Greve T. & Callesen H. 1998. Open pulled straw 
(OPS) vitrifi cation: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Molecular Reproduction and De-
velopment. 51(1): 53-58.
107 Vajta G., Hyttel P. & Callesen H. 1997. Morphological changes of in-vitro-produced bovine blastocysts after vitri-
fi cation, in-straw direct rehydration, and culture. Molecular Reproduction and Development. 48(1): 9-17.
108 Van Blerkom J. 1991. Microtubule mediation of cytoplasmic and nuclear maturation during the early stages of 
resumed meiosis in cultured mouse oocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of 
America. 88(11): 5031-5035.
109 Van der Elst J., Nerinckx S. & Van Steirteghem A. 1993. Association of ultrarapid freezing of mouse oocytes with 
increased polyploid at the pronucleate stage, reduced cell numbers in blastocysts, and impaired fetal development. 
Journal of Reproduction and Fertility. 99(1): 25-32.
110 Vincent C. & Johnson M.H. 1992. Cooling, cryoprotectants, and the cytoskeleton of the mammalian oocytes. Oxford 
Reviews of Reproductive Biology. 14:73-100.
111 Vincent C., Garnier V., Heyman H. & Renard J.P. 1989. Solvent effects on cytoskeletal organization and in-vivo 
survival after freezing of rabbit oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. 87(2): 809-820.
112 Vincent C., Pickering S.J. & Johnson M.H. 1990. The hardening effect of dimethylsulfoxide on the mouse zona 
pellucida requires the presence of an oocyte and is associated with a reduction in the number of cortical granules present. 
Journal of Reproduction and Fertility. 89(1): 253-259.
113 Vincent C., Pickering S.J., Johnson M.H. & Quick S.J. 1990. Dimethylsulphoxide affects the organization of 
microfi laments in the mouse oocyte. Molecular Reproduction and Development. 26(3): 227-235.
114 Wanderley L.S., Luz H.K.M., Faustino L.R., Lima I.M.T., Lopes C.A.P., Silva A.R., Báo S.N., Campello C.C., 
Rodrigues A.P.R. & Figueiredo J.R. 2012. Ultrastructural features of agouti (Dasyprocta aguti) preantral follicles 
cryopreserved using dimethyl sulfoxide, ethylene glycol and propanediol. Theriogenology. 77(2): 260-267.
115 Whitaker M. 2006. Calcium at fertilization and in early development. Physiological Reviews. 86(1): 25-88.
116 Wu B., Tong J. & Leibo S.P. 1999. Effects of cooling germinal vesicle-stage bovine oocytes on meiotic spindle 
formation following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54(4): 388-395.
117 Wu C., Rui R., Dai J., Zhang C., Ju S., Xie B., Lu X. & Zheng X. 2006. Effects of cryopreservation on the de-
velopmental competence, ultrastructure and cytoskeletal structure of porcine oocytes. Molecular Reproduction and 
Development. 73(11): 1454-1462.
118 Yoon T.K., Chung H.M., Lim J.M., Han S.Y., Ko J.J. & Cha K.Y. 2000. Pregnancy and delivery of healthy infants 
developed from vitrifi ed oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertility and Sterility. 
74(1): 180-181.
119 Zeron Y., Ocheretny A., Kedar O., Borochov A., Sklan D. & Arav A. 2001. Seasonal changes in bovine fertility: 
relation to developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles. Repro-
duction. 121(3): 447-454.
120 Zeron Y., Sklan D. & Arav A. 2002. Effect of polyunsaturated fatty acid supplementation on biophysical parameters 
and chilling sensitivity of ewe oocytes. Molecular Reproduction and Development. 61(2): 271-278. 
121 Zeron Y., Tomczak M., Crowe J. & Arav A. 2002. The effect of liposomes on thermotropic membrane phase transi-
tions of bovine spermatozoa and oocytes: implications for reducing chilling sensitivity. Cryobiology. 45(2): 143-152.