Biofilme e QS odonto UFSC alunos 2013 Grad 2013

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

Bactérias são microrganismos procariotos unicelulares minúsculos.
E. coli
~ 1,5 x 5mm 
O QUE SABEMOS SOBRE BACTÉRIAS 
Bactérias causam problemas.
Doenças			Epidemias
Infecções			Contaminação alimentar
 
	
O QUE (pensamos que) SABEMOS SOBRE BACTÉRIAS 
Convivemos diariamente com inúmeros desses procariotos.
Human skin microflora
Homem:
100.000.000.000.000 células
2.000.000.000.000.000 bactérias
SOMOS 95% BACTÉRIA E SOMENTE 5% HUMANOS!
APESAR DISSO ...
Fossil records show that stromatolites, created by cyanobacteria, dominated life on Earth for almost 3 billion years.
They colonized the earth 3.498 billion years before the first humans appeared, and they are still here.
E ALÉM DISSO, BACTÉRIAS SÃO UM SUCESSO EVOLUTIVO!
Bactérias são seres unicelulares minúsculos e antisociais, que vivem uma exstência entediante cujo objetivo único é comer, crescer e se reproduzir. 
E no entanto são um sucesso evolutivo!
Bactérias são sinônimo de doenças.
No entanto, o organismo humano é composto de 20 vezes mais bactérias que células eucariotas. E SOBREVIVEMOS!
RECAPTULANDO ...
A QUESTÃO ENTÃO É: 
COMO ESSAS CRIATURAS INSIGNIFICANTES PODEM TER ALGUM IMPACTO, BENÉFICO OU NÃO, EM NOSSO ORGANISMO OU PARA O MEIO-AMBIENTE?
E 	COMO SOBREVIVERAM À 3 BILHÕES DE ANOS DE EVOLUÇÃO?
ESTARÍAMOS ENGANADOS SOBRE O QUE CONHECEMOS A RESPEITO DO MODO DE VIDA DAS BACTÉRIAS?
A QUESTÃO É...
Sincroniar o crescimento à divisão celular
Verificar os níveis de ATP
Duplicar o cromossomo
Segregar as cópias
Localizar o meio da célula
Iniciar a divisão celular
Polimerizar o anel FtsZ
Dividir e recomeçar
Bactérias tem um modo de vida simples: comem e se reproduzem
7
Apenas 1% de todas as bactérias causam doenças em humanos
Apenas 4% de todas as bactérias causam doenças em plantas
95% das bactérias conhecidas são não-patogênicas
A péssima reputação das bactérias vem de uma minoria (< 1%) que efetivamente causa doenças, compromete o meio-ambiente ou contamina nossa comida.
Muitas delas são benéficas e/ou indispensáveis:
		Digerem nossa comida
		“Educam” nosso sistema imune
		Produzem nossas vitaminas
		Protegem nosso organismo (dentes, intestinos, etc)
Bactérias Causam Doenças
8
As bactérias são capazes de sentir o meio ambiente 
Temperatura, disponibilidade em nutrientes, osmolaridade, viscosidade, densidade celular (“quorum sensing”).
No caso mais simples, a mudança da concentração intracelular em íons regula a expressão gênica.
Diminuição da concentração intracelular de ferro desreprime a expressão da toxina da cólera.
Nos casos mais complexos, mecanismos sofisticados de transdução do sinal permitem a regulação da expressão gênica em resposta à sinais do meio-ambiente.
O patógeno se comporta como um sistema processador de informações.
Bactérias são seres COMUNITÁRIOS que SENTEM o Meio Ambiente e Ajustam seu Comportamento
9
« Nas diferentes etapas da infecção bacteriana, diferentes tipos de fatores de virulência são expressos pelas bactérias ».
Bactérias são capazes de sentir o meio ambiente e de modular sua reposta de acordo com a necessidade. 
Exemplos de comportamentos sociais ou respostas coordenadas aos estímulos são muitos:
 Swarming – movimento coordenado
Variação antigênica – escape da resposta imune
Controle da expressão do flagelo durante a infecção
Formação de biofilmes
Regulação da produção de toxinas em presença/ausência do hospedeiro
Coordenação temporal da produção de toxinas durante a infecção
Comportamentos Comunitários: Regulação da Virulência e Resposta Bacteriana Coordenada
10
BIOFILMES
MICROBIANOS
The properties of these communities are often very different from those of the individual organisms. Indeed, only recently, it has been proposed that the seasonal waves of cholera epidemics are due to temperature-dependent formation of Vibrio cholerae biofilms in which the members persist in a viable but non-culturable state.”
BIOFILMES: COMUNIDADES BACTERIANAS
“Some of the oldest known traces of life on earth, the stromatolites, are bacterial mats.. 
Bacterial communities and, in particular biofilms, are a major factor in our environments. They are important both in artificial situations, contamination of prostheses and corrosion, and in more natural environments, water surfaces, teeth etc. (…)
12
http://www.erc.montana.edu
Agrupamento de microorganismos aderidos à uma superfície inerte ou viva, envolvidos por uma matriz de exopolissacarídios secretada por eles.
Presentes em praticamente todos os ambientes: na placa dentária, nas pedras escorregadias dos rios, nos filmes gelatinosos de vasos de plantas, sobre lentes de contato, no interior de canos, na superfície de águas estagnantes, no interior de esponjas de limpeza...
Biofilmes podem se formar cada vez que uma superfície entra em contato com água.
O Que é um Biofilme?
13
You may not be familiar with the term "biofilm," but you have certainly encountered biofilm on a regular basis. The plaque that forms on your teeth and causes tooth decay is a type of bacterial biofilm. The "gunk" that clogs your drains is also biofilm. If you have ever walked in a stream or river, you may have slipped on the biofilm-coated rocks.
 
Biofilm forms when bacteria adhere to surfaces in aqueous environments and begin to excrete a slimy, glue-like substance that can anchor them to all kinds of material – such as metals, plastics, soil particles, medical implant materials, and tissue. A biofilm can be formed by a single bacterial species, but more often biofilms consist of many species of bacteria, as well as fungi, algae, protozoa, debris and corrosion products. Essentially, biofilm may form on any surface exposed to bacteria and some amount of water. Once anchored to a surface, biofilm microorganisms carry out a variety of detrimental or beneficial reactions (by human standards), depending on the surrounding environmental conditions.
ONDE?
Ambientes aquáticos
Corpo humano
Ambientes terrestres
Qualquer interface sólido/líquido
QUEM?
Na natureza ≈ 90% das bactérias encontram-se sob a forma de BIOFILMES
O QUE?
Comunidades microbianas complexas, e dinâmicas, envoltas por uma matriz, geralmente polissacarídica, que se formam seqüencialmente e sofrem alterações ao longo do tempo.
Biofilmes Microbianos
BIOFILMES MICROBIANOS
14
Melhores condições de sobrevivência nos ambientes naturais 
Proteção contra
Radiações UV
Fagocitose
Desidratação
Predadores
Antimicrobianos
Aproveitamento de nutrientes
Sintrofia
Troca de material genético
Porque os Microrganismos Associam-se em Biofilmes?
15
 Efeitos benéficos: utilização de biofilmes na descontaminação de águas nas estações de tratamento. 
Fonte de problemas: 80% das infecções bacterianas humanas são causadas por biofilmes. Corrosão de dutos, entupimento de filtros, rejeição de implantes médicos, contaminação de água potável.
Os biofilmes microbianos impõem anualmente enormes despesas às sociedades, em equipamentos danificados, contaminação de produtos perda de energia, infecções, etc.
Biofilmes: Impacto Ambiental, Industrial e de Saúde Pública
16
"Microbiologists have traditionally focused on free-floating bacteria growing in laboratory cultures; yet they have recently come to realize that in the natural world most bacteria aggregate as biofilms, a form in which they behave very differently. As a result, biofilms are now one of the hottest topics in microbiology." (Potera 1996)
The Center for Biofilm Engineering
A Friendly Guide to Biofilm Basics & the CBE
------------------------------------------------------------------------
 
2.  What is the industrial significance of biofilm?
Microbial biofilms on surfaces cost the nation billions of dollars yearly in equipment damage, product contamination, energy losses and medical infections. Conventional methods of killing bacteria (such as antibiotics, and disinfection) are often ineffective with biofilm bacteria. The huge doses of antimicrobials
required to rid systems of biofilm bacteria are environmentally undesirable  (and perhaps not allowed by environmental regulations) and medically impractical (since what it would take to kill the biofilm bacteria would also kill the patient!). So new strategies based on a better understanding of how bacteria attach, grow and detach are urgently needed by many industries. Conversely, microbial processes at surfaces also offer opportunities for positive industrial and environmental effects, such as bioremediating hazardous waste sites, biofiltering industrial water, and forming biobarriers to protect soil and groundwater from contamination. 
 
As in any water system, 99 percent of the bacteria in an automated watering system is likely to be in biofilms attached to internal surfaces. Biofilms are the source of much of the free-floating bacteria in drinking water, some of which can cause infection and disease in laboratory animals. One common biofilm bacteria, Pseudomonas aeruginosa, is a secondary pathogen which can infect animals with suppressed immune systems. Besides being a reservoir of bacteria which can affect animal health, biofilms can also cause corrosion in stainless steel piping systems. In order to design and operate automated watering systems that deliver the bacterial quality required by our customers, we should understand how biofilms develop, some of the problems they can cause, and how they can be controlled.
Understanding bacteria in biofilms is one step in preparing for the future. We are currently meeting the most demanding microbiological water quality requirements of many of our customers by supplying chlorinated reverse osmosis water and by maintaining water quality through flushing and sanitization. (Refer to Microbiological Survey of Automated Watering Systems, D209, Dreeszen 1996.) But, what if chlorine use in animal drinking water is prohibited? Or, what if water quality requirements become even more stringent with the use of new specialized animals?
Of course, you might just want to learn about biofilms to marvel at the ability of bacteria to adapt to their environment and to evade our attempts to eliminate them.
Exemplos de biofilmes de interesse humano
Doenças associadas a biofilmes: 65 a 80% das infecções tratadas, em países desenvolvidos.
Processos crônicos
 Infecções de dispositivos implantáveis
Infecções de dispositivos implantáveis
S. aureus, S. epidermidis P. aeruginosa
Catéteres, Marca-passos, Válvulas cardíacas, Próteses
Endocardites: espécies de Streptococcus
Pneumonias em pacientes com fibrose cística: P. aeruginosa
Biofilmes, porque estudá-los?
17
(MUSK e HERGENROTHER, 2006). Chemical countermeasures for the control of bacterial biofilms: effective compounds and promising targets 80% das infecções tratadas, em países desenvolvidos.(NIH)
Epitélio vaginal
Biofilmes bacterianos representam um grave problema de saúde pública: estimativas do NIH mostram que 80% de todas as infecções estão relacionadas com o desenvolvimento de biofilmes. 
Biofilmes x Saúde Pública
18
Rickard, A.H. et al (2003) Trends Microbiol., 11:94-100.
Na Natureza : Biofilmes Mistos
19
Rickard, A.H.; Gilbert, P., High, N.J., Kolenbrander, P.E.; Handley, P.S. (2003) Bacterial coaggregation: an integral process in the development of multi-species biofilms. Trends Microbiol., 11:94-100.
Swarming, descolamento de agregados celulares ou semeadura de bacérias individuais.
Produção de exopolissacarídeos
Aderidas (pili, twitching)
Planctônicas - swimming (flagelo)
Biofilme maduro
Biofilmes: Ciclo de Vida
20
The biofilm life cycle in three steps: attachment, growth of colonies, swarming phenomenon and detachment in clumps or "seeding dispersal."
1) Iniciação: Associação transiente  Associação estável
2) Maturação: Formação e estruturação de microcolônias
Síntese de Exopolissacarídeos
Interações metabólicas e genéticas
3) Dispersão: Liberação de células para formação de um novo biofilme
Mecanismos de comunicação intercelular
Expressão diferencial de genes
Etapas no desenvolvimento de um biofilme
21
Celulose (Gluconoacetobacter, E. coli)
Poli-N-Acetilglicosamina (S. aureus e S. epidermidis)
Adesina intercelular polissacarídica (PIA) (S. aureus e S. epidermidis)
PIA-like (Yersinia, E. coli)
Ácido colânico (E. coli)
Alginato, PEL, PSL (Pseudomonas)
Aumento da síntese da Matriz Extracelular
Enzimas que degradem esses substratos são agentes potencialmente eficazes contra os biofilmes.
Biofilmes: Estrutura do Biofilme Maduro
G. xylinus biofilm (celulose)
22
Biofilme: Heterogeneidade Estrutural
A existência de microclimas diferentes induz a diferenciação das bactérias.
A estrutura do biofilme não é aleatória. Ela é fruto da organização otimizada de células afim de facilitar ao máximo a difusão de nutrientes e permitir o estabelecimento de uma comunidade microbiana. 
A proximidade dos membros dessa comunidade facilita as trocas metabólicas, a reciclagem de nutrientes, as trocas de plasmídios portando genes de resistência aos antibióticos e aos metais pesados.
Biofilmes: Organização Estrutural
23
Conceptual illustration of the heterogeneity of biofilm structure, with labeled bacterial clusters, streamers, and water channels. 
Biofilmes x Motilidade
Retração e deslize ou tumbling
 Motilidade baacteriana aderida à uma superfície de poliestireno 
1. Fixação pelas extremidades dos pili.
2. A retração dos pili aproxima a bactéria da superfície.
3. A bactéria se deita sobre a superfície e estende os pili a partir da outra extremidade. 
Esses novos pili fixam-se e se retraem gerando movimentos « sacodidos » (twitching).
Biofilmes x Motilidade: Twiching
Motilidade Piliar (ligada à adesão)
25
Sun et al [4] interpret the behavior of M. xanthus cells that have attached to a polystyrene surface in terms of pilus retraction. Cells are shown attaching by the tips of their pili (tethering). The cells descend to the surface by retracting their pili into end A. Finally the cell lies down on the surface, extending pili from the other end, B. These pili make a new attachment to the surface, then retract so that the cell glides toward the site of their attachment. 
B. subtilis é capaz de colonizar uma superfície sólida usando o « swarming ». 
Movimento ORGANIZADO sobre uma superfície, dependente de uma hiperflagelação e do contato célula-célula. 
Biofilmes x Motilidade: Swarming
Motilidade Flagelar (superfícies sólidas)
Movimento ORGANIZADO sobre uma superfície, dependente de uma hiperflagelação e do contato célula-célula. 
P. mirabilis swarmig
Swarming
Comportamento Coordenado
« Clusters »: Microclima anaeróbico
Canal aquático: Microclima aeróbico
Biofilmes: Heterogeneidade Estrutural
No interior dos biofilmes diferentes tipos de microorganismos encontram múltiplos nichos que permitem seu desenvolvimento. 
Variações nas Condições de Vida no Biofilme Induzem a Heterogeneidade Populacional
Os biofilmes foram comparados aos tecidos eucariotos primitivos com mecanismos de controle homeostático e um enorme grau de cooperatividade fisiológica. 
28
Cross-sectional illustration of placement of O2 sensitive probes, in void area and biofilm cluster, revealing that water channel is aerobic; center of cluster is anaerobic. 
Epifluorescensce: biofilm mixte (K.pneumoniae et P. aeruginosa) développé sur de l’acier inoxydable avant et après traitement désinfectant (monochloramine). Huang,C.-T., F.P. Yu, G.A. McFeters, and P.S. Stewart
Antes do tratamento: biofilme espesso, marcado em vermelho, indicando a presença de células metabolicamente ativas.
2h após o tratamento; a maioria das células se marca em verde, indicando a morte das bactérias; porém, bactérias metabolicamente ativas persistem na parte inferior do biofilme.
Bactérias planctônicas são mais sensíveis ao tratamento com desinfetantes que bactérias organizadas em biofilmes
 A taxa de mortalidade das bactérias no biofilme <<< planctônicas.
Aumento da concentração do desinfetante induz aumento na taxa de mortalidade no biofilme >> planctônicas.
Biofilmes: Resistência Aumentada aos Antimicrobianos
29
The graph at right, shows how planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa respond differently to exposure to chlorine. One difference that is immediately obvious from this graph is that killing rates of cells in the biofilm are always lower than those for planktonic bacteria. A second difference is that increasing the concentration of chlorine does more to improve the killing rate against biofilm bacteria than it does for planktonic cells. 
A utilização de produtos antimicrobianos em alta concentração é mais eficaz no tratamento de biofilmes industriais.
Um tratamento de curta duração com uma dose concentrada do produto é mais eficaz que um tratamento prolongado com um produto diluído.
Implicações Práticas

!
BIOFILMES  MÉDICOS : A dose necessária para eliminar o patógeno organizado em biofilme pode ser letal ao paciente!
Biofilmes: Resistência aos Tratamentos Antimicrobianos
30
Practical Implications
 CBE antimicrobial research has been motivated by the nearly universal observation that microorganisms growing in biofilms are less susceptible to all types of antimicrobial agents than the same microorganisms when grown in conventional suspension cultures. 
The practical suggestion that follows from this work is that biofilms in industrial settings are most effectively treated with a relatively high concentration of antimicrobial. A concentrated dose, even if brief, will tend to be more effective than a prolonged treatment of lower concentration.
 The solution in medical biofilms is not so simple, however, since the dose of antibiotic required to kill biofilm bacteria may be high enough to kill the patient!
A utilização de produtos antimicrobianos em alta concentração é mais eficaz no tratamento de biofilmes industriais.
Um tratamento de curta duração com uma dose concentrada do produto é mais eficaz que um tratamento prolongado com um produto diluído.
Implicações Práticas

!
BIOFILMES  MÉDICOS : A dose necessária para eliminar o patógeno organizado em biofilme pode ser letal ao paciente!
Biofilmes: Resistência Aumentada aos Antimicrobianos
31
Practical Implications
 CBE antimicrobial research has been motivated by the nearly universal observation that microorganisms growing in biofilms are less susceptible to all types of antimicrobial agents than the same microorganisms when grown in conventional suspension cultures. 
The practical suggestion that follows from this work is that biofilms in industrial settings are most effectively treated with a relatively high concentration of antimicrobial. A concentrated dose, even if brief, will tend to be more effective than a prolonged treatment of lower concentration.
 The solution in medical biofilms is not so simple, however, since the dose of antibiotic required to kill biofilm bacteria may be high enough to kill the patient!
Super-expressão de Bombas de Efluxo
Mecanismos de Indução do Aumento da Resistência aos Antimicrobianos
32
Current Opinion in Microbiology
Volume 12, Issue 5, October 2009, Pages 512–519
Structure, function and inhibition of RND effluxpumps in Gram-negative bacteria: an update
Jessica MA Blair, 
Laura JV Piddock 
Modulação da Permeabilidade Membranar
Mecanismos de Indução do Aumento da Resistência aos Antimicrobianos
33
http://www.zeitnews.org/chemistry-physics-and-material-sciences-research/new-research-may-improve-the-efficiency-of-the-biofuel-production-cycle.html
1 - Expansiva: liberação de células do interior das microcolônias
Morte celular - limitação nutricional, espécies reativas de oxigênio, apoptose, lise por fagos
Degradação da matriz por liases
Restauração da motilidade
2 - Fragmentação: forças mecânicas
3 - Superficial: migração do biofilme
Mecanismos de Dispersão do Biofilme
34
Indivíduos imunocompetentes estão em geral protegidos de infecções por bactérias inaladas porque bactérias individuais são rapidamente fagocitadas nos alvéolos pulmonares.
Quando fragmentos de biofilme são inalados, eles não são fagocitados e as bactérias exprimem a resistência aumentada aos antibióticos.
Ex: Legionellose.
Biofilmes: o Perigo da Migração em Grupo
35
Health Implications of Aspirating Biofilm Fragments
(Above) People with strong immune systems in normal circumstances are protected from infection by inhaled bacteria because single bacteria are readily phagocytized by activated white cells in alveoli of the lung.
(Below) If biofilm fragments are inhaled or aspirated in environments like hospital wards, "sick" buildings or space vehicles, these slimy aggregates are not cleared by phagocytosis. Mild or severe infection can ensue. Such biofilm aggregates were implicated in the sometimes fatal cases of Legionnaire's disease, emanating from hotel air conditioning and ventilation systems.
Practical Implication
Bacterial cells may detach from biofilms individually or in clumps. When they detach in clumps, they retain the reduced susceptibility to antimicrobials characteristic of biofilms. In the right conditions, biofilms can also migrate across surfaces over a period of time.
 
Movies
Detachment
Rippling
Rolling
All materials have certain properties of elastic solids and viscous fluids. Biofilms appear to show aspects of both solids and liquids—much like slug slime—and fall into a category called "viscoelastic." However, as biofilms collect sediment, or become scaled with rust or calcium deposits, they become less fluid and more like a brittle solid.
 
We are currently using a non-destructive in situ technique, developed in the lab, to study the fundamental aspects of biofilm rheology (deformation and flow). This may help us understand how the interaction between a flowing liquid and the viscoelastic biofilms may result in detachment and the potential dissemination of infection and transmission of pathogens.
Nature Review Microbiology VOLUME 2 | JULY 2004 | 581
REGULATORY CIRCUITS AND COMMUNICATION IN GRAM-NEGATIVE BACTERIA
André M. Lazdunski, Isabelle Ventre and James N. Sturgis
It is increasingly apparent that, in nature, bacteria function less as individuals and more as coherent groups that are able to inhabit multiple ecological niches. The increased awareness of the role of cell–cell communication in the ecology of Gram-negative bacteria is matched by an understanding of both the physiology and the molecular biology that underlie this process. 
Como as bactérias coordenam comportamentos coletivos? Circuitos Regulatórios e Comunicação Bacteriana 
36
Precisaria haver um mecanismo geral que determinasse os comportamentos coletivos observados em bactérias.
A resposta veio dos oceanos: bactérias marinhas V. fishery e V. harvey 
COMO AS BACTÉRIAS COORDENAM COMPORTAMENTOS COLETIVOS?
Quorum Sensing
« As populações bacterianas deixam de ser consideradas como um amontoado transitório de células individuais  ».
1970: Evidências de um comportamento comunitário nas bactérias: a bioluminescência em Vibrio fischeri.
Comunicação Intercelular
Quorum Sensing: As Bactérias Falam
38
Les cellules bactériennes ont longtemps été considerées comme des individues incapables d’un comportment communautaire: elles ne se reposent donc jamais sur d’autres membres de la communauté ni pour interferé dans l’expression genetique, ni pour l’execution des activités biologiques. 
Sessile cells in a biofilm "talk" to each other to build microcolonies and to keep water channels open. 
Microcolonies of cells in biofilms are held by their EPS structure in close proximity so that molecular signals are effective, not only within colonies, but, in many cases, across species boundaries.
http://www.lifesci.ucsb.edu/
Euprymna sp (squid)
Quorum sensing e Bioluminescência em Vibrio fischeri
39
A key component of quorum sensing, first discovered in the early 1970s in the marine
luminous bacterium Vibrio fischeri, a facultative-symbiont of marine animals, is the production and sensing of dedicated signal molecules. 
The phenomenon of quorum sensing was first characterized in the bioluminescent bacterium, Vibrio fisheri. Vibrio fisheri is a marine bacterium that inhabits the light organ of certain fish and squid, thus forming a symbiotic relationship. V. fisheri can also be found free-living in seawater. Light production by V. fisheri does not occur until the cells reach a certain density (see graph). Since this density of cells of V. fisheri is only reached in the light organs of the host, planktonic (free-living) V. fisheri are not bioluminescent. 
Nature Review Microbiology VOLUME 2 | JULY 2004 | 581
REGULATORY CIRCUITS AND COMMUNICATION IN GRAM-NEGATIVE BACTERIA
Andr馥 M. Lazdunski, Isabelle Ventre and James N. Sturgis
The concept of quorum sensing (QS) originated with studies in Vibrio fischeri (formerly
known as Photobacterium fischeri),which has two lifestyle modes: first, it grows in the sea
to a low population density and does not luminesce; second, it forms symbiotic
associations with fish and squid species such as Euprymna scolopes94 and luminesces. In
the figure, an adult Hawaiian bobtail squid is shown,which is ~2 cm long. There is a light
organ close to the ink sac in the mantle cavity of the animal. The light organ contains
~1011 V. fischeri cells per ml. The squid is nocturnal and light is emitted downwards
through the mantle cavity.By matching the light intensity to the moon and starlight
above, the squid becomes invisible to predators below. In symbiotic associations, newly
hatched juvenile squids acquire their symbionts from the surrounding seawater.
Colonization is a specific process and V. fischeri is the sole organism that colonizes the
squid light organ.After entering the crypts — histological structures inside the light
organ that are delimited by epithelial cells — of a nascent light organ in a juvenile squid,
the bacteria undergo morphological and physiological changes in response to
colonization of the host tissue. Bacteria proliferate and synthesize autoinducer,which can
activate expression of the bacterial genes that produce luminescence. The autoinducer
has to reach a threshold concentration before the luminescence genes are activated. Inside
the crypts, densely packed bacteria are surrounded by a matrix fluid that contains
millimolar concentrations of amino acids in the form of peptides. Each morning more
than 95% of the bacterial culture is expelled from the crypts, and by the evening the
remaining symbionts repopulate the organ through division95. So, there is a daily cycle of
symbiont proliferation, expulsion and regrowth that is supported by nutrients that are
supplied by the surrounding host tissues. First discovered in the 1980s, this phenomenon
soon became a model for studies of the regulatory molecular mechanisms that are
involved and also for studies of the symbiotic processes of V. fischeri61,96,97. Image kindly
provided by Edward G.Ruby (University ofWisconsin,Madison, USA).
A produção de luz só ocorre quando a cultura bacteriana atinge uma certa densidade (DO~0,4).
A luciferase é praticamente indetectável no início do crescimento, e chega a representar quase 10% das proteínas totais da bactéria algumas horas mais tarde.
Relative Growth and Luminescence
Expressão da Luminescência em Vibrio fischeri
Bactérias bioluminescem quando em comunidade, mas não quando estão sozinhas.
40
Light production only occurs when cells reach a certain density and is mediated by a small sensory molecule, called an autoinducer. Dilution of cells that are luminescent to a lower density results in loss of bioluminescence. The addition of the supernatant from a bioluminescent culture to a non-luminescent culture at lower cell density results in the premature induction of bioluminescence. A compound was isolated from the culture supernatant and identified as N-(3-oxohexanoyl)-homoserine lactone (or N-acyl homoserine lactone or AHL). The addition of AHL could induce luminescence in a bacterial culture that were below the normally required cell density for bioluminescence to occur. 
Se a cultura luminescente é diluída, a produção de luz pára.
A adição do sobrenadante de uma cultura bioluminescente à uma cultura não-luminescente induz a expressão precoce da bioluminescência mesmo em uma densidade celular baixa.
Para que todas brilhem ao mesmo tempo é necessário um sinal
41
A indução da expressão precoce da bioluminescência pelo sobrenadante de uma cultura bioluminescente (A) é inibida pela adição de inibidores da síntese proteica (Rif) ou de ARNm (CAP).
+ Cap ou Rif
À T=15min
+ Cap ou Rif
À T=0 min
A atividade do autoindutor depende da síntese « de novo » de proteínas.
A Produção do Sinal (AI) Envolve Síntese de Proteínas
42
O Indutor da luminescência é uma moléula difusível produzida por V. fischeri: uma acil-homoserine lactone (AHL)
A bactéria utiliza o sinal AHL para monitorar a densidade celular da população e sincronizar a expressão dos genes-alvo.
Quando as bactérias atingem uma densidae populacional suficiente em um espaço confinado (biofilme, agregados, flocos, hospedeiro), a concentraçnao do sinal de QS aumenta.
Este mecanismo de comunicação intercelular é o « Quorum Sensing »
Resumindo: Quorum Sensing emVibrio fischeri
43
The better studied of the bacterial signals involved in quorum sensing are the acyl-homoserine lactones (AHLs). AHLs are typically produced during the entire life cycle of quorum sensing bacteria, and have been shown to be diffusible across cell membranes via either active or passive events, depending on acyl side chain length. When quorum sensing bacteria grow to high population densities in a spatially confined location (as in a biofilm, aggregate, floc, mat or host), the local concentration of the signal increases. Upon reaching a critical concentration (that tends to vary with the quorum-sensing regulated system in question, but typically is in the 0.1 to 10 micromolar range) the acyl-HSL signal interacts with specific DNA-binding proteins. In turn, this complex activates the transcription of certain genes or sets of genes. This modular signaling system, which contains components for signal production, degradation, and reception via specific gene expression, is ideal for engineering new intercellular signaling systems with desirable, controllable features.
Comportamento comunitário controlado através de um sistema de indutores (AI) que ligam e desligam genes simultaneamente em todas as bactérias da colônia. 
Quorum Sensing: controle da Expressão Gênica Dependente da Densidade Populacional
Ativador trnascricional (família hélice-turn-hélice)
LuxR+AI= mudança conformacional de LuxR e ativação de sua atividade de fixação ao ADN.
AI
AI = Autoinducteur
LuxR ativa a transcrição do operon lux: produção de luciferase e de LuxR
O Operon lux de Vibrio fischeri
45
luxR mutants could not be complemented by addition of autoinducer, nor did they produce detectable levels of autoinducer. What does this result tell you about the function of LuxR? 
LuxR is a transcriptional activator in the helix-turn-helix family. Binding between LuxR and the autoinducer is required to activate DNA binding activity of LuxR. Binding of AHL to LuxR results in a conformational change that alters the DNA binding affinity of LuxR. LuxR activates transcription of the lux operon, which includes both the genes for luciferase production (luxABCDE) and luxI. 
LuxR possesses a membrane bound N-terminal domain that binds AHL. Mutants have been identified in the N-terminal region that require larger amounts of AHL for induction. Mutants that are missing the N-terminal domain are constituitively active. 
The carboxy terminal portion of LuxR is required for DNA binding. Interaction with AHL is required for LuxR dimerization. LuxR binds DNA as a dimer
at promoter sites designated lux boxes. Binding of the AHL by LuxR is thought to release LuxR from the membrane to the cytoplasm, where activation then occurs. Mutants missing the C-terminal domain abolish DNA binding and transcriptional activation. Loss of only 40 aa from the carboxy terminus results in DNA binding (as shown by repression), but failure to activate transcription. 
It is believed that LuxR interacts with the sigma 70 subunit of RNA polymerase to activate transcription at the lux box.
Mecanismo de sinalização que permite a modulação de um grande número de de funções (genes) na célula bacteriana:
	Formação de biofilme
	Esporulação
	Produção de bateriocinas
	Virulência
Mecanismo de comunicação intercelular via sinais químicos extracelulares.
A resposta a estes sinais é desencadeada simultaneamente no conjunto da população bacteriana, quando esta atinge um patamar de densidade populacional = COMPORTAMENTO COMUNITÁRIO
QS aumenta a capacidade das bactérias de acessar os nutrientes, colonizar nichos ecológicos mais favoráveis, responder às defesas do hospedeiro eucarioto, competir com outras espécies de microorganismos e enfrentar as diferentes situações de estresse impostas pelo meio.
« Quorum Sensing »: O que é?
46
As moléculas sinalizadoras produzidos pelas células individuais não têm nenhum efeito em baixas concentrações. 
Quando a população bacteriana atinge uma densidade que permite a produção de moléculas em concentração suficiente, ocorre a ativação dos genes-alvo.
Não se pode intervir numa conversa quando não se conhece a linguagem!
Luminescência
Produção de antibióticos
Transferência de plasmídeos
Motilidade
Virulência
Formação de biofilme
Quorum Sensing : Genes Alvo
47
Signal molecules produced by individual cells do not have an effect until the bacterial population density 
is sufficient to provide a concentration of molecules, which then cross cell membranes and activate the manufacture of such cellular products as toxins, enzymes or surfactants.
I. Conversas privadas = Sinais (AI) Inter-específicos:
 Gram negativas : Homoserina-lactonas aciladas
 Gram positivas: Peptídeos modificados
II. Conversas Públicas = Sinais Inter-específicos:
 Gram positivas e Gram negativas: Autoindutor 2 
A Linguagem Química das Bactérias
48
Gram - : Homoserina-lactonas aciladas:
A Linguagem Química das Bactérias
49
Gram -
Gram +: Peptídeos modificados
Mecanismo de comunicação difundido entre as Proteobactérias (mais de 50 espécies).
A Linguagem Química das Bactérias
Figure 2 Structures of different bacterial autoinducers. (a) Examples of AHL autoinducers of some Gram-negative bacteria. (b) A selection of Gram-positive AIP autoinducers. The asterisk above the tryptophan (W) of ComX indicates a posttranslational isoprenylation of the peptide. The AIP molecules of Staphylococcus aureus are shown with the thioester bridge linking the indicated amino acid residues. The numbering I–IV refers to the S. aureus group classification. (c) AI-2 of Vibrio harveyi is a furanosyl borate diester, as determined by co-crystallization with the V. harveyi AI-2 receptor LuxP.
50
Bactérias Poliglotas
Mediador químico: Auto-indutor 2 
Em discussões públicas, fale uma língua que TODOS entendam!
O Esperanto Bacteriano
Quantos somos ? X Quantos eles são?
= DECISÃO SOBRE O QUE FAZER
Comunicação Bacteriana: 
A Diferença entre « Nós » e « Eles »
Autoinducer-2 (AI-2), a furanosyl borate diester, is a member of a family of signaling molecules used in quorum sensing. AI-2 is unique in that it is one of only a few known biomolecules incorporating boron. First identified in the marine bacterium Vibrio harveyi, AI-2 is produced and recognized by many Gram-negative and Gram-positive bacteria. AI-2 is sythesized by the reaction of 1-deoxy-3-dehydro-D-ribulose with boric acid.
AI-2 is sensed by the Lsr transport cassette and is actively transported into the cell, where it is phosphorylated by. Then, Phospho-AI-2 binds the transcriptional repressor protein, LsrR, which subsequently is released from the promoter/operator region of the lsr operon – and transcription of the lsr genes is initiated. AI-2 signalling is also regulated by glucose and cAMP/CRP via the lsr operon. In the presence of glucose, low levels of cAMP/CRP result in almost no lsr operon (lsrABCDFG) expression. Without glucose, cAMP-CRP is needed to stimulate the lsr expression, while LsrR represses its expression in the absence of the inducer, phospho-AI-2. As AI-2 accumulates, more AI-2 is taken in via LsrABCD, phosphorylated via LsrK, and the lsr transcription is de-repressed, enabling even more AI-2 uptake.
Doubts have been expressed regarding AI-2's status as a universal signal. The gene responsible for its production is the widespread luxS; this gene has an important role in the recycling of S-adenosyl-L-methionine, with AI-2 being a metabolic by-product of that process. While it is certainly true that some bacteria respond to AI-2, it is not yet clear that it is always being produced for purposes of signalling.
53
 A produção da mesma família de moléculas-sinal QS por diferentes bactérias que dividem o mesmo nicho ecológico permite o diálogo inter-específico.
EVIDÊNCIAS EXPERIMENTAIS
1. A adição de sobrenadantes de cultura de P.aeruginosa aumenta a produção de fatores de virulência regulados por QS em B.cepacia.
2. Em biofilmes mistos, B.cepacia responde aos sinais de QS de P.aeruginosa, mas não o conrário.
3. A adição de HSL produzidas por P.aeruginosa às culturas de de S.aureus reduz a produção de hemolisinas, TTST-1, proteína A e da FBP.
4. Em S.aureus, a produção de ARNIII, efetor da resposta agr, é inibida por 3O-C12-HSL.
MODELO DE INFECÇÃO PULMONAR EM PACIENTES COM CF
P.aeruginosa
S.aureus
B.cepacia
Comunicação Interespecífica via Quorum Sensing
54