Fixação Biológica de Nitrogênio Estado da arte

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Capítulo 6
Fixação Biológica
de Nitrogênio – Estado da Arte
Veronica Massena Reis
Kátia Regina dos Santos Teixeira
Introdução
O nitrogênio é um elemento químico presente abundantemente,
em sua forma mais estável, na atmosfera. A estabilidade do gás N2 é
devido à presença de uma forte ligação tríplice, entre as duas moléculas
de N. Infelizmente, a maioria dos organismos, animais e vegetais,
não consegue incorporar essa forma de nitrogênio a esqueletos de
carbono. É necessário que essa ligação tríplice seja rompida e o
nitrogênio esteja na forma de íons amônio. Algumas espécies de
bactérias, um grupo de organismos unicelulares e procarióticos, são
capazes de realizar essa reação de redução do N2 a NH4
+. Esse processo
biológico é conhecido como Fixação Biológica de Nitrogênio – FBN.
Isso é possível porque esses microrganismos possuem a enzima
nitrogenase, caracterizada como um complexo enzimático, responsável
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152 Capítulo 6
pela quebra da ligação tríplice usando energia celular na forma de
adenosina trifosfato (ATP).
A incorporação de nitrogênio, via FBN, nos diferentes ecossistemas
de nosso planeta, faz parte dos ciclos biogeoquímicos naturais.
O entendimento desse processo biológico passa pelos conhecimentos
das espécies capazes de fixar o nitrogênio e sua classificação
filogenética. Passa também pelo entendimento do sistema fisiológico
de equilíbrio entre a enzima nitrogenase e o seu maior inimigo, o
oxigênio, e pela compreensão dos processos enzimáticos ligados à
assimilação do nitrogênio fixado nas células microbianas e sua interação
com a nitrogenase.
Organismos capazes de fixar o nitrogênio atmosférico
O estudo de bactérias fixadoras de N2 ou diazotróficas associadas
às plantas tem mostrado a ocorrência de uma grande variedade de
microrganismos isolados a partir das mais diversas famílias do reino
vegetal, além do solo e dos sistemas aquáticos. Tal diversidade levou
os cientistas a formularem teorias evolucionárias nas quais a capacidade
de fixar nitrogênio foi adaptada a partir de um ancestral comum ao
longo do processo evolucionário. Estudo comparativo entre as seqüências
de aminoácidos deduzidas a partir dos pares de genes nifDK e nifNE de
diversos organismos fixadores de nitrogênio do grupo de Archaea e
Bacteriaceae reforça a teoria divergente do processo evolucionário
associado à FBN. A hipótese da origem desses genes parálogos, ou seja,
que apresentam uma extensa semelhança entre suas seqüências
primárias, propõe que no processo evolutivo houve um evento de
duplicação em série de um gene ancestral comum seguido por diver-
gência, constituindo esses operons parálogos (FANI et al., 2000). Ainda
segundo esses autores, uma duplicação desses operons, seguida pelo
processo de divergência evolucionária, teria sido a responsável pela
origem dessa família de genes parálogos conhecidos como operons nifDK
e nifNE. A origem do gene ancestral é discutível, porém acredita-se
que ele tenha tido participação em processos de destoxificação celular
em um cenário onde a atmosfera ancestral apresentava um caráter
altamente redutor. Os eventos desse processo, segundo a hipótese dos
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autores, podem ser representados esquematicamente como apresentado
na Fig. 1.
As primeiras bactérias a alcançar renome internacional foram as
do gênero Rhizobium, sendo estas posicionadas na subdivisão alfa-
proteobacteria, e até hoje representam o grupo mais estudado. Nesse
grupo, dentro da ordem Rhodospirillales, temos a família I, onde estão
incluídos gêneros conhecidos como Rhodospirillum e Azospirillum. Já
na família II, temos a recente reformulação de gêneros, como foi o caso
da mudança de algumas bactérias do gênero Acetobacter para o recém-
criado Gluconacetobacter. Dentro desse grupo, na ordem VI, estão
também posicionadas as bactérias simbióticas pertencentes à família
Rhizobiales, que inclui gêneros importantes como Rhizobium,
Allorhizobium e Sinorhizobium junto com outro membro famoso, o gênero
Agrobacterium. Já Mesorhizobium foi posicionado na família IV,
Phyllobacteriaceae, e a família VII, chamada de Bradyrhizobiaceae,
inclui Bradyrhizobium, e a família Hyphomicrobiaceae inclui o gênero
Mesorhizobium. Beijerinckia e Derxia estão posicionadas na família
VI, Beijerinchiaceae. Já na subdivisão beta-proteobacteria temos a ordem I
chamada de Burkholderiales, que inclui algumas espécies fixadoras
Fig. 1. Ilustração da hipótese evolutiva da origem da nitrogenase.
Fonte: Fani et al. (2000).
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154 Capítulo 6
na família I Burkholderiaceae pertencentes ao gênero Burkholderia, e
na família III, chamada de Oxalobacteraceae, que inclui o gênero
Herbaspirillum, e na família IV Alcaligenaceae, temos o gênero
Alcaligenes. Mais distante temos a ordem VI chamada de Rhodocyclales,
onde encontramos o gênero Azoarcus. Na subdivisão gamma-
proteobacteria está classificada uma minoria de bactérias diazotróficas,
até então descritas ou recentemente renomeadas, incluindo na classe
VIII Pseudomonadales os gêneros Pseudomonas e Azotobacter e na
ordem XII Enterobacteriales a família I, Enterobacteriaceae, onde
encontramos os gêneros Erwinia, Klebsiella, Pantoeae e Serratia.
A subdivisão delta possui, em sua maioria, bactérias anaeróbicas
obrigatórias redutoras de enxofre, incluindo espécies de Desulfovibrio
e Desulfobacter. Entretanto, nenhum relato de associação entre bactérias
diazotróficas pertencentes a essa subdivisão de espécies vegetais foi
feito até o momento. No filo Firmicutes encontramos posicionados na
classe I Clostridia, ordem I Clostriaiales, família I Clostridiaceae, o gênero
Clotridium, e na classe III, Bacilli, ordem I Bacillales, família I
Bacillaceae o gênero Bacillus, e na família VII Paenibacillaceae, o
gênero Paenibacillus. Todo esse quadro de complexidade das relações
filogenéticas pode ser resumido como apresentado na Tabela 1.
Tabela 1. Organismos fixadores de nitrogênio associados a gramíneas
e outras espécies não leguminosas.
Gênero Espécie Planta hospedeira Referência
Classe I: Proteobacteria – subdivisão alfa
Azospirillum A. brasilense Gramíneas Tarrand et al. (1978)
A. lipoferum Gramíneas Tarrand et al. (1978)
A. amazonense Gramíneas Magalhães et al. (1983)
A. halopraeferens Kallar grass Reinhold et al. (1987)
A. irakense Arroz Khammas et al. (1989)
A. doebereinerae Miscanthus Eckert et al. (2001)
Gluconacetobacter G. diazotrophicus Cana-de-açúcar, Cavalcante e
Dobereiner,
Pennisetum, café, 1988, reclassificação feita
abacaxi, batata-doce por Yamada et al. (1997)
e Eleusine coracana
G. johannae Rizosfera de café (a) Fuentes-Ramírez et al.
(2001)
Continua...
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155Fixação Biológica de Nitrogênio – Estado da Arte
Tabela 1. Continuação.
Gênero Espécie Planta hospedeira Referência
Classe I: Proteobacteria – subdivisão alfa
G. azotocaptans Rizosfera de café (a) Fuentes-Ramírez et al.
(2001)
Beijerinkia B. fluminensis Cana-de-açúcar Krieg e Holt (1984) (b)
Derxia D. gummosa Cana-de-açúcar Krieg e Holt (1984)
Classe II - Proteobacteria – subdivisão beta
Burkholderia B. vietnamiensis Arroz Gillis et al. (1995)
B. kururiensis Aqüífero poluído com Zhang et al. (2000)
trichloroethylene (TCE) (c)
B. “brasilensis” * Arroz, mandioca, Baldani et al. (1997)
batata-doce, cana-de- primeira citação
açúcar e milho
B. tropica Cana-de-açúcar Reis et al. (2004),
Herbaspirillum H. seropedicae Gramíneas Baldani et al. (1986)
H. rubrisubalbicans Cana-de-açúcar Baldani et al. (1996)
H. frisingense Pennisetum, Miscanthus Kirchhof et al. (2001)
e Spartina
Alcaligenes A. faecalis Arroz You et al. (1991)
A. latus Arroz Malik et al. (1997)
A. paradoxus Arroz Malik et al. (1997)
Azoarcus A. indigens Kallar grass Reinholdet al. (1993)
A. communis Kallar grass Reinhold et al. (1993)
“Azovibrio” ** A. restrictus Kallar grass Reinhold-Hurek e Hurek
(2000)
“Azospira” ** A. oryzae Kallar grass Reinhold-Hurek e Hurek
(2000)
“Azonexus” ** A. fungiphilus Kallar grass Reinhold-Hurek e Hurek
(2000)
Classe III - Proteobacteria – subdivisão gamma
Azotobacter A. paspali Paspalum notatum Krieg e Holt (1984)
Klebsiella K. pneunoniae Milho, cana-de-açúcar, Krieg e Holt (1984)
batata-doce, trigo
K. oxytoca Arroz, trigo Kovttunovych et al. (1999)
K. planticola Arroz, trigo Ladha et al. (1983)
K. terrigena Gramíneas Haahtela et al. (1988)
Pantoea P. agglomerans Trigo Ruppel et al. (1992)
4. Filo BXIII – Firmicutes phy. nov. Classe III – “Bacilli”
Paenobacillus P. azotofixans Gramíneas Seldin et al. (1984)
a. Descrição recente: descrição baseada nas estirpes isoladas de um único hospedeiro; b. Primeira
versão do Bergey´s Manual; c. Descrito recentemente e posteriormente verificado que a estirpe-
padrão era diazotrófica. Não há maiores relatos de ocorrência. “ “ Indica que o organismo foi
proposto. * Baldani et al., em preparação. ** Não foi incluído na atualização do Manual Bergey’s
disponível on line (2002).
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156 Capítulo 6
Nitrogenase
A enzima que catalisa o processo de redução do nitrogênio
atmosférico a NH4
+ é denominada nitrogenase e esta reação é acoplada
à produção de H2. Atualmente, são conhecidos três tipos de nitrogenase:
um que possui molibdênio (Mo, nitrogenase-1) e ferro (Fe); outro em
que o vanádio (V) substitui o Mo (nitrogenase-2); e um terceiro, que só
tem ferro (nitrogenase-3). Azotobacter chroococcum e A. paspali, além
da nitrogenase tradicional, possuem a nitrogenase de vanádio. Já
Azotobacter vinelandii possui os três tipos de nitrogenase (PAU et al., 1989).
A fisiologia dos microrganismos diazotróficos é marcada pelas
propriedades inerentes desta enzima. São elas: alta sensibilidade ao
oxigênio; necessidade dos metais Fe, Mo ou V, seus componentes
estruturais; suprimento adequado de poder redutor; MgATP para a sua
atividade; ambiente onde o nitrogênio combinado não esteja disponível.
A nitrogenase é uma enzima relativamente lenta e para produzir níveis
adequados de nitrogênio fixado o conteúdo enzimático em bactérias
diazotróficas é de aproximadamente 10% da proteína celular total
(KLUGKIST et al., 1985). Também é uma enzima dispendiosa em termos
energéticos, consumindo duas moléculas de ATP para cada elétron
transferido pelo sítio catalítico (HOWARD; REES, 1996). Além da
regulação da expressão gênica, a nitrogenase também é regulada no
âmbito enzimático em muitos organismos.
A enzima, ou o complexo enzimático, é composta de duas
unidades: a dinitrogenase redutase (também chamada de componente
II ou Fe-proteína) e a dinitrogenase (ou componente I ou MoFe-proteína).
Nesse complexo enzimático, essas unidades interagem
cooperativamente durante o processo de FBN. A dinitrogenase redutase,
ou Ferro proteína, é responsável pela transferência de elétrons para
que ocorra a redução do N2, e, em virtude de sua atividade redox,
geralmente é mais sensível ao oxigênio que a dinitrogenase
propriamente dita, ou MoFe proteína. A dinitrogenase, por sua vez, é a
enzima que apresenta o sítio ativo da reação, onde são encontradas
condições adequadas para a redução do N2. Em resumo, a estequiometria
da reação pode ser representada como:
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157Fixação Biológica de Nitrogênio – Estado da Arte
A dinitrogenase redutase serve de doador de elétrons para a
dinitrogenase, sendo um dímero composto de duas subunidades idênticas.
Já a dinitrogenase consiste de um tetrâmero de dois pares de subunidades
não idênticas (α e β). A nitrogenase-1 só se expressa em meio contendo
Mo, mas se este elemento falta e houver V, então temos a síntese da
nitrogenase-2 (HALES et al., 1986; ROBSON et al., 1986). Nesse caso,
o que modifica é a dinitrogenase-2, que se pensa ser composta de dois
pares diferentes, formando um hexâmero com as duas subunidades α e β,
além de um par de uma unidade menor (δ) contendo 2 átomos de V, 23 de
Fe e 20 grupos sulfito por molécula. A dinitrogenase redutase-2 contém 4
átomos de Fe e 4 grupos sulfito por dímero (EADY et al., 1988). Na falta
de Mo e V e na presença de Fe temos a nitrogenase-3 (CHISNELL et al.,
1988). Dinitrogenase redutase-3 é um dímero com duas subunidades
idênticas, enquanto a dinitrogenase-3 é um tetrâmero composto de dois
pares não idênticos das subunidades α e β, podendo ser um hexâmero
desde que o operon dos genes estruturais para essa enzima possua a
região de leitura open reading frame – ORF – que potencialmente
codifica para uma proteína similar α unidade δ. Dinitrogenase redutase-
3 contém aproximadamente 24 átomos de Fe e 18 grupos sulfito por
molécula. A dinitrogenase-3 também pode ser isolada em pelo menos
duas configurações ativas: α2β2 e α1β2.
Os genes que codificam as proteínas da nitrogenase-1 são
chamados de nif; os genes para a nitrogenase-2 são chamados de vnf;
e, no caso da nitrogenase-3, de anf. Rhodospirillum capsulatus e
R. rubrum contem apenas os genes anf, além dos nif (MASEPOHL;
KLIPP, 1996). A expressão de cada nitrogenase é controlada pela
disponibilidade dos metais. Quando o molibdênio está presente, somente
a nitrogenase-1 ou MoFe-nitrogenase é sintetizada. Na falta deste e na
presença de vanádio, temos a nitrogenase-2 ou VFe-nitrogenase. Quando
ambos estão ausentes, temos apenas a nitrogenase-3 ou Fe-nitrogenase.
As nitrogenases alternativas são detectadas pela formação de etano
(C2H6) em adição ao etileno (C2H4) no teste-padrão de redução
de acetileno (PAU et al., 1989). Infelizmente, a importância desses
sistemas alternativos em ambientes naturais é muito pouco estudada.
Vnitrogenase
N2 + 8 H
+ + 8 e- + 16 ATP 2 NH3 + 16 ADP + 16 PO4
-3 + H2
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158 Capítulo 6
Mais detalhes sobre a caracterização da estrutura do sistema nitrogenase
podem ser consultados em Marin et al. (1998).
Estudos sobre a eficiência da FBN em Azotobacter chroococcum
mostraram que a nitrogenase de vanádio é menos eficiente que a
nitrogenase de molibdênio. A estequiometria da reação mostra que ocorre
uma perda de no mínimo 25% dos elétrons e energia para a produção
de H2 para a nitrogenase de Mo, enquanto a nitrogenase de vanádio
perde aproximadamente 50% (BISHOP; EADY, 1985). É possível que,
entretanto, a reciclagem de hidrogênio beneficie mais a nitrogenase de
V que a de Mo (YATES et al., 1997).
O quadro atual da caracterização da genética de diversas bactérias
diazotróficas revela que a complexidade da FBN não se restringe
simplesmente à bioquímica do processo e sugere que a existência de
outros genes, ainda não identificados, pode ser essencial para a
elucidação do processo em diversos grupos de bactérias diazotróficas.
A organização dos genes nif em uma única região do genoma de
K. pneumoniae permitiu que a estrutura dos operons, a presença de
promotores específicos e a função de vários desses genes fossem
definidas por meio de estudos de mutação sítio-dirigida e seqüencia-
mento da região de 24 kb que contém esses genes. Entretanto, esse tipo
de organização não é universal e estudos de caracterização em bactérias
diazotróficas, de vida livre ou encontradas em associação, têm resultado
em um quadro bastante completo da organização estrutural de seus genes
nif (revisado por MERRICK,1993). No caso de Enterobacter agglomerans,
bactéria diazotrófica de vida livre encontrada associada à rizosfera de
diversos cereais, apesar de a organização estrutural ser semelhante à
observada para K. pneumoniae, a presença de genes nif no plasmídeo
pEA3 indica que a presença de genes nif na porção extracromossomal
não é uma característica única das bactérias diazotróficas simbióticas
(KREUTZER et al., 1991).
Interação do oxigêniocom a FBN
A nitrogenase é uma enzima altamente sensível ao oxigênio e
necessita de condições anaeróbias para a purificação de seus dois
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159Fixação Biológica de Nitrogênio – Estado da Arte
componentes em sua forma ativa (EADY, 1980). Apesar disso, as bactérias
diazotróficas precisam regular o suprimento de oxigênio para prover
ATP e ao mesmo tempo proteger a nitrogenase contra seu efeito deletério.
Dessa forma, esses microrganismos desenvolveram várias estratégias
para limitar o acesso do oxigênio à nitrogenase, desde o crescimento
microaerofílico até modificações morfológicas tais como os nódulos nas
leguminosas, os heterocistos nas cianobactérias, vesículas em não
leguminosas e a barreira de difusão ao oxigênio nos nódulos (YATES
et al., 1997). Também pode ocorrer dimorfismo de colônias, como em Derxia
gummosa (HILL, 1971) e Klebsiella pneumoniae (HILL, 1975).
A inibição da atividade da nitrogenase in vivo pelo O2 vai desde
uma leve alteração reversível até a sua completa perda, dependendo
da severidade do estresse. As proteínas Fe da nitrogenase-1 (tempo de
½ vida no ar de 30 segundos) são geralmente mais sensíveis ao oxigênio
que as proteínas MoFe (t ½ vida no ar de 8 minutos). Já a proteína VFe
não mostra essa tolerância (t ½ vida no ar de 40 segundos) (HILL;
PATRIQUIN, 1988). A sensibilidade ao O2 no processo de transferência
de elétrons pode diferir de acordo com o microrganismo. Em Klebsiella
pneumoniae, bactéria aeróbica facultativa, a sensibilidade ao O2 está
relacionada com a piruvato flavodoxina oxidoredutase. Nos aeróbios
obrigatórios, esse caminho é menos conhecido, mas, provavelmente,
envolve componentes da cadeia respiratória (HAAKER; KLUGKIST,
1987). Os mais bem estudados mecanismos de proteção são os propostos
por Dalton e Postgate (1969b) que são a respiratória e a conformacional
em Azotobacter.
O oxigênio inibe a atividade de nitrogenase em três níveis diversos:
• Nível genético, agindo na repressão da síntese.
• Causa dano irreversível à proteína-Fe existente.
• Causa dano reversível (switch off) da enzima. Nesse caso, a
atividade retorna ao nível inicial quando a pressão parcial de
O2 em equilíbrio com a fase gasosa (pO2) volta aos níveis
adequados (switch on) sem que haja síntese de novo da enzima
(GOLDBERG et al., 1987).
A magnitude do gradiente de pO2 entre o meio ambiente e o sítio
de atividade da nitrogenase é afetado pela taxa de uso do O2 e pela
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160 Capítulo 6
resistência a sua difusão. Em adição, podemos ter uma separação
espacial ou temporal do metabolismo de O2 e da FBN, que pode ser
alcançada por diferenças morfológicas ou bioquímicas (HILL, 1987).
Azotobacter possui o mecanismo mais tolerante ao O2. Sua eficiência
de fixação é máxima perto de 10 µM de O2 (DALTON; POSTGATE,
1969ab), porém em cultura contínua pode crescer sob ar (225 mM de
O
2
) (POST et al., 1983). Para A. brasilense, os níveis são bem mais baixos,
ficando entre 6 e 9 µM (NELSON; KNOWLES, 1978). Já para Klebsiella
pneumoniae a pO2 ótima da FBN se situa em torno de 0,3 µM (HILL
et al., 1984). Dentre as espécies de Azospirillum, a mais tolerante ao
O
2
 é o A. amazonense (HARTMANN et al., 1983). Essa tolerância pode
estar ligada à presença de uma hidrogenase tolerante ao oxigênio nessa
espécie (FU; KNOWLES, 1989) que, além de diminuir as perdas de
hidrogênio pela nitrogenase, pode agir capturando o oxigênio do meio
(BURRIS, 1991).
A chamada proteção respiratória é um mecanismo de proteção
da atividade da nitrogenase e foi formulado por Dalton & Postgate
(1969a) para explicar o comportamento de Azotobacter sob condições
de FBN. Azotobacter tem a capacidade de ajustar, por adaptação, a
sua taxa respiratória numa larga faixa de pO2 sem que a enzima nitroge-
nase seja afetada, exibindo uma das maiores taxas respiratórias dentre
as bactérias associativas testadas. Isso significa que, em uma cultura de
Azotobacter, se o pO2 for aumentado, as células passam a respirar mais
rapidamente, procurando consumir todo o O2 através de um processo
respiratório desacoplado da geração de ATP e, portanto, gastando
excessivamente as fontes de carbono.
Apenas em Azotobacter spp. o switch off enzimático está
correlacionado com a formação de um complexo enzimático inativo e
insensível ao O2 que contém uma terceira proteína denominada de
Skethna, FeS II ou proteína protetora (ROBSON, 1979), o que lhe confere
uma proteção conformacional. A formação desse complexo requer Mg2+
além da proteína FeS II, mas a proporção de cada componente ainda
permanece desconhecida (ROBSON; POSTGATE, 1980). A proteção
contra o oxigênio in vivo ocorre rapidamente e a eficiência é indepen-
dente da magnitude e da duração do estresse de O2, mas diminui durante
o crescimento em altas taxas de respiração (DINGLER; OELZE, 1985).
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161Fixação Biológica de Nitrogênio – Estado da Arte
A FeS II pode ter outras funções in vivo já que a sua síntese é regulada
tanto por NH4
+ como por O2 (ROBSON, 1980). Em Azotobacter
chroococcum, a nitrogenase de V não forma esse complexo estável
com a proteína FeS II e é mais sensível ao O2 (SCHERINGS et al., 1977).
Por sua vez, Dingler & Oelze (1985), estudando o switch off da
nitrogenase à exposição a repetidos pO2 excessivamente altos,
observaram que as células de A. vinelandii ficavam cada vez mais
sensíveis. A ativação do mecanismo de switch off – switch on depende
inteiramente do suprimento de energia e fonte de carbono para que
aumente a taxa de consumo de O2 pela célula, isto é, quanto maior o
fluxo de elétrons para a nitrogenase, maior a estabilidade da enzima
contra o O2 (KUHLA; OELZE, 1988). Porém o mecanismo regulatório
desse fluxo de elétrons é desconhecido.
Em outros diazotrofos aeróbios, a inativação da nitrogenase pelo
O2 está relacionada com a modificação irreversível no componente da
proteína Fe da dinitrogenase, causando uma permanente inativação
enzimática. Estudos relacionados com A. lipoferum e A. brasilense
demonstraram que não ocorria modificação da Fe-proteína após a
exposição ao pO2 excessivo e que essa proteína modificada só estava
presente quando as células foram submetidas à anaerobiose (HARTMANN;
Burris, 1987). Essa modificação enzimática não ocorre em A. amazonense
(SONG et al., 1985). Okon et al. (1983) observaram mudanças na membrana
de A. brasilense crescido sob alto pO2. Nessas condições ocorreu um
aumento do teor protéico e no conteúdo de carotenóides, além de uma
maior atividade específica da succinato oxidase e superóxido dismutase.
A adição de altas concentrações de açúcar ao meio de cultivo
(10%) oferecia uma maior proteção à atividade da nitrogenase de
Gluconacetobacter diazotrophicus na presença de concentrações
crescentes de oxigênio (REIS; DOBEREINER, 1998). A atividade da
nitrogenase (medida pela redução do acetileno) só foi completamente
inibida com 6 kPa de O2, e, usando-se qualquer um dos outros compostos,
a atividade não se manteve em 2 kPa. Neste caso, o alto açúcar oferece
uma barreira osmótica à difusão do O2, e, no caso dessa bactéria, isso
pode ser uma vantagem, já que esta concentração de açúcar é
encontrada em seu hábitat natural, a cana-de-açúcar.
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162 Capítulo 6
Regulação da atividade da nitrogenase por NH4
+
A atividade da nitrogenase em vários microrganismos diazotróficos
é inibida pela adição de NH4
+ de forma rápida e reversível (ZUMFT, 1985).
A expressão da atividade da FBN está sob o controle genético e, em
adição, é regulada por fatores ambientais. Esse controle se faz necessário
em virtude do alto custo energético da redução de N2. Em espécies do
gênero Azospirillum, Rhodospirillum, Rhodobacter e uma das espécies
de Azotobacter, A. chroococcum, a adição de amônia em concentrações
variando de 1-10 mM às culturasque fixam nitrogênio promove um
decréscimo da atividade quase que imediatamente para 10% ou menos
que a atividade inicial. Também nesses organismos nenhuma nitrogenase
é sintetizada. Em outros gêneros, a adição de amônio geralmente resulta
em um declínio gradual na atividade da enzima em torno da metade
para cada nova geração, mas não ocorre inativação irreversível das
nitrogenases presentes no momento da adição. Concluindo, em qualquer
diazotrofo, amônio pode inibir tanto a atividade como a síntese ou apenas
prevenir a síntese da enzima (RUDNICK et al., 1997).
Na maioria dos diazotrofos, a adição única de uma pequena
quantidade de NH4
+ inibe a atividade da nitrogenase, sendo conhecido
como “NH4
+ switch off ”. Após o esgotamento do amônio extracelular,
ocorre a recuperação da atividade enzimática, o que resulta no switch
on. Os mecanismos relacionados com esse processo diferem entre os
vários microrganismos fixadores de N2. Não se tem conhecimento de
todos eles, porém o mais bem estudado é o do Rhodospirillum rubrum
(POPE et al., 1985), que compreende a formação de um complexo inativo
entre a ADP-ribose e um resíduo arginil conservado da proteína-Fe de
nitrogenase. Isso ocorre pela ação recíproca dos produtos dos genes
draT e draG, que resulta numa inibição total e irreversível após o intervalo
de tempo em que ocorre a inativação enzimática. A inativação da
nitrogenase em Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum e
Azospirillum lipoferum e A. brasilense ocorre pela transferência do
grupamento ADP-ribose do NAD ao resíduo de arginina 101 (Arg101)
da proteína Fe (dinitrogenase redutase) pela ação da enzima dinitrogenase
redutase ADP-ribosiltransferase - DRAT (codificada pelo gene draT ).
Essa inativação é reversível pela ação da dinitrogenase redutase-
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163Fixação Biológica de Nitrogênio – Estado da Arte
ativadora glicohidrolase – DRAG (codificada pelo gene draG) que
hidrolisa a ADP-ribose da proteína-Fe quando o suprimento de N torna-
se limitante (HARTMANN; BURRIS, 1987; ROBERTS; LUDDEN, 1992).
Esse sistema regulatório está relacionado à adição de nitrogênio ou a
condições de anaerobiose em A. brasilense (HARTMANN et al., 1986;
HARTMANN; BURRIS, 1987; ZHANG et al., 1996) e pela falta de energia
que ocorre na escuridão no caso de Rhodospirillum rubrum (KANEMOTO;
LUDDEN, 1984) e Rhodobacter capsulatus (PIERRARD et al., 1993).
Estudos de hibridização indicam que esse mecanismo também ocorre
em A. brasilense, A. lipoferum (HARTMANN et al., 1986; FU et al., 1989)
e aparentemente não está presente em Azotobacter (CEJUDO;
PANEQUE, 1988; KLUGKIST; HAAKER, 1984), Azospirillum amazonense
(SONG et al., 1985; HARTMANN et al., 1986), Herbaspirillum
seropedicae (FU; BURRIS, 1989) e Azorhizobium caulinodans (KUSH
et al., 1985). Recentemente, foi observado que íons amônio inibiam a
atividade da nitrogenase em estirpes de Azospirillum brasilense que
não possuíam DRAT ou eram nitrogenases mutantes que tinham perdido
o sítio provável da ADP-ribosilação, sugerindo a existência de um
segundo mecanismo de regulação postranslacional (ZANG et al., 1996).
Entretanto, esse segundo sistema regulatório tem um efeito menos
dramático na atividade da nitrogenase em resposta ao amônio. Em
contraste, em R. rubrum, a alteração no resíduo responsável pela
ribosilação elimina essa resposta postranslacional ao escuro e à adição
de amônio, sugerindo que o mecanismo de regulação DRAT/DARG é o
único nesta espécie (ZANG et al., 1996). A rápida inativação da
nitrogenase em Azotobacter chroococcum também sugere a existência
de um mecanismo secundário à inibição da nitrogenase, que é mais
rápido que a ADP-ribosilação (MUNOZCENTENO et al., 1996).
Em Azotobacter vinelandii e Rhizobium leguminosarum, a
regulação da atividade da nitrogenase pela adição de NH4
+ envolve
um componente elétrico (∆ϒ) que desreprime o potencial de membrana,
que pode contribuir para a inibição da atividade da nitrogenase (LAANE
et al., 1980). Íons amônio absorvidos por células de A. vinelandii causam
um decréscimo no fluxo de elétrons para a nitrogenase (KLUGKIST;
HAAKER, 1984). Em Rhodobacter sphaeroides, um metabólico gerado
pela glutamina sintetase, pela adição de amônio, tem sido proposto como
Miolo_Biota.pmd 1/12/2006, 12:32163
164 Capítulo 6
um inibidor específico do transporte de elétrons para a nitrogenase
(HAAKER et al., 1982). Também em A. amazonense tem sido proposto
que o mecanismo inibidor é o decréscimo do potencial de membrana
(HARTMANN et al., 1986). A eficácia do “NH4
+ switch off” em
Azotobacter depende da taxa de respiração, do pH, da idade da cultura,
da natureza da fonte de carbono (KLUGKIST; HAAKER, 1984) e da razão
C/N dentro da célula (CEJUDO; PANEQUE, 1988).
A sensibilidade ao “NH4
+ switch off” e a extensão da inativação
da proteína-Fe depende das condições culturais (GOTTO; YOCH, 1985)
e da estirpe utilizada, como por exemplo em Azotobacter vinelandii
(GORDON et al., 1981). Aparentemente, a modificação covalente da
proteína-Fe não atua em Azotobacter spp., A. amazonense e H. seropedicae
(HARTMANN et al., 1986; FU; BURRIS, 1989). Nesses organismos ocorre
uma inibição parcial, isto é, parte da atividade inicial permanece após
a adição do NH4
+. Em H. seropedicae, a adição de cloreto de amônio
causa uma inibição parcial imediata da atividade da nitrogenase, isto
é, não ocorre uma fase lag (FU; BURRIS, 1989).
Assimilação de amônio e aminoácidos
Em Azospirillum, a assimilação de amônio é mediada pela via
GS-GOGAT. A enzima glutamina sintase (GS) catalisa a reação abaixo
e possui uma alta afinidade pelo amônio extracelular, isto é, em
concentrações limitantes.
A GS NADPH-dependente transfere o N-amida da glutamina para
o 2-oxo-glutarato numa reação irreversível sem perda do amônio
transferido (VANONI et al., 1991) de acordo com a equação:
GOGAT
Glutamina + 2-oxo-glutarato + NADPH + H 2 glutamato + NADP + Pi
GS
Glutamato + NH3 + ATP glutamina + ADP + Pi
Mg2+
V
V
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165Fixação Biológica de Nitrogênio – Estado da Arte
O glutamato serve como aceptor pela alta afinidade de assimilação
do amônio e, em seguida, ocorre a reação anabólica do metabolismo
dos aminoácidos e síntese de polímeros.
Uma segunda enzima de assimilação do amônio, a glutamato
desidrogenase dependente de NAD(P)H (GDH), também sintetisa
glutamato de acordo com a equação abaixo:
GDH
2-oxo-glutarato + NH3 + NAD(P)H + H
+ glutamato + NAD(P)+
Já que a reação de assimilação de amônio via GDH é de baixa
afinidade, a sua contribuição para a assimilação de NH4
+ só é importante
em altas concentrações de amônio extracelular (OKON et al., 1976).
Entretanto, outras enzimas também são importantes para a assimilação
de glutamato, tais como a GOT (glutamato-oxoloacetato-
aminotransferase) e a GPT (glutamato-piruvato-aminotransferase).
A GPT catalisa a reação:
glutamato + piruvato → 2-oxo-glutarato + alanina
e a GOT catalisa a reação:
glutamato + oxolacetato → 2-oxo-glutarato + aspartato
Bactérias diazotróficas, quando em presença de amônio em
excesso, assimilam este via GDH, e a GS presente está na forma inativa
que é a forma não adenilada. Já na presença de baixas concentrações
de amônio ou em meio livre deste as células demonstram altos níveis
de GS na forma não adenilada (forma ativa) e a síntese da GDH é
reprimida (OKON et al., 1976). O nível de atividade da GOGAT não é
necessariamente afetado por concentrações diferenciais de amônio.
A. lipoferum e A. amazonsense apresentam alta atividade das
enzimas GDH, GOT e GPT e são capazes de crescer na presença de
glutamato como única fonte de nitrogênio e carbono, mas a atividade
da nitrogenase é reprimida e apenas quantidades de 1 a 2 mM não
inibem a enzima e o amônio é excretado. Glutamato ou derivados deste
podem diminuir a atividade do sistema de assimilaçãode amônio de
alta afinidade. Em A. halopraeferens e A. brasilense, a utilização de
glutamato ou outros aminoácidos é tão baixa que a atividade da
V
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166 Capítulo 6
nitrogenase não é inibida, mesmo em altas concentrações externas
(HARTMANN, 1989).
Aminoácidos podem inibir a atividade da nitrogenase, já que são
fontes de N. Para tal precisam ser assimiladas e nem todos os
aminoácidos são metabolizados da mesma forma pelas bactérias.
Em H. seropedicae, L-histidina, L-lisina ou L-arginina são usados para
o crescimento e não afetam a atividade da enzima. Já L-serina e
L-alanina inibem a atividade da nitrogenase (KLASSEN et al., 1997).
Mutantes que não são inibidos pela presença de amônio externo
já foram produzidos em A. brasilense estirpe Sp6 (TURBANTI et al., 1988),
Cd (HARTMANN et al., 1983), além de outros mutantes produzidos a
partir do uso de etilenodiamina, substância esta que afeta o sistema de
absorção de amônio pelas células (MACHADO et al., 1991), entre outros
sistemas de mutação. Em condições gnotobióticas (isto é, sistema
controlado estéril onde se deixa a planta limpa por meio da esterilização
da semente ou por cultivo in vitro e inocula-se um microrganismo
conhecido, neste caso, uma bactéria diazotrófica – gnoto = conhecido),
mutantes excretores de amônio foram capazes de suportar o crescimento
de trigo de forma mais eficiente que as estirpes selvagens (CRISTIANSEN-
WENIGER; VAN VEEN, 1991). A utilização de aminoácidos pode afetar
a atividade da nitrogenase de forma diferencial entre espécies do mesmo
gênero, como é o caso de Azospirillum. Hartmann et al. (1988) discutem
que a qualidade e a composição dos aminoácidos presentes nos
exsudatos de raízes pode variar muito entre espécies de plantas e fases
do crescimento, tal como apresentado por Curl & Truelove (1986), e
que a utilização de certos aminoácidos, como apresentado em
Azospirillum spp., pode ser importante no estabelecimento na rizosfera
de uma planta, em particular, e também pode influenciar a atividade da
nitrogenase em associação com a planta. Maiores estudos sobre a presença
dos diferentes aminoácidos e seus derivativos nestes exsudatos, bem
como sua quantidade, são necessários para se avaliar o potencial da
FBN, já que se sabe que existem diferenças entre variedades de uma
mesma espécie de planta quanto à forma de disponibilização do N fixado.
Da mesma forma, como observado para o oxigênio, a adição de teores
elevados de sacarose também afeta a absorção de diversos aminoácidos
que indiretamente inibem a nitrogenase.
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167Fixação Biológica de Nitrogênio – Estado da Arte
Considerações finais
Vários estudos mostram que a nitrogenase necessita de condições
ótimas para a sua síntese e atividade. Oxigênio, nitrogênio, aminoácidos
podem atuar em diversos níveis e são compostos comuns no ambiente
externo das células. Tanto no solo como na rizosfera e no interior das
plantas, esses compostos estão distribuídos e podem causar uma inibição
da enzima que é de custo elevado à célula bacteriana, mas, por sua
vez, podem estimular o seu crescimento. Na rizosfera, compostos
nitrogenados também são usados por todos os outros microrganismos e,
nesse caso, as vantagens competitivas das bactérias diazotróficas sobre
as outras são perdidas. Num ambiente onde a competição por fontes de
carbono é a força maior que comanda a flutuação populacional, esses
microrganismos, diazotróficos ou não, têm que ser versáteis para
sobreviver.
Os estudos sobre fisiologia, abordados nesta revisão, englobam
em sua maioria trabalhos que foram realizados em laboratório usando
culturas puras ou mesmo extratos enzimáticos. Muito pouco se conhece
sobre esses efeitos in situ e como os outros microrganismos podem afetar
a assimilação dessas moléculas. Não é uma tarefa fácil e mesmo para
associações simbióticas, como as das leguminosas, que formam nódulos,
muito ainda falta ser respondido. O principal problema das associações
de espécies não leguminosas com bactérias diazotróficas é que não há
a formação de nenhuma estrutura visível, como os nódulos das
leguminosas, que proteja e agrupe as bactérias. Uma vez distribuídas no
vegetal, sem nenhum padrão aparente, as células ficam mais suscetíveis
às trocas com o meio externo. Nos estudos de quantificação desses
organismos, as raízes apresentam maiores números e a rizosfera é um
sítio muito importante. É necessário que estudos sejam feitos, usando
plantas vindas do campo, e que metodologias mais sensíveis sejam
desenvolvidas para se obter uma avaliação real do papel desses
organismos em associação com plantas.
Algumas técnicas alternativas já estão disponíveis, tais como o
uso de soros policlonais contra a enzima nitrogenase, que podem ser
aplicados em cortes de tecido vegetal, possibilitando a localização da
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168 Capítulo 6
enzima. Também se pode isolar genes estruturais de nitrogenase de
microrganismos presentes nas plantas que podem informar a que
nitrogenase pertence por meio da comparação de seqüências pelo uso
da reação em cadeia da polimerase. Genes repórteres podem ser ligados
a genes reguladores da nitrogenase e indiretamente indicar a
localização da enzima na sua forma potencialmente ativa. Eletrodos
de oxigênio e amônio, de dimensões diminutas, podem ser introduzidos
diretamente no tecido vegetal e estimar a quantidade desses elementos,
dando uma idéia de onde a nitrogenase pode ser sintetizada ou perma-
necer ativa e complementar às informações genéticas.
Todos esses métodos são extremamente laboriosos e caros.
Um método antigo, rápido e barato é o da redução de acetileno usando
plantas. O grande problema da aplicação desse método em plantas de
campo é a alteração do estado fisiológico, principalmente em relação
à exposição ao oxigênio de plantas retiradas de seu local de plantio.
Para vasos e outros sistemas menores, onde as condições podem ser
mais controladas, não há dificuldade. Atualmente, vários métodos
usando o isótopo mais pesado do nitrogênio (15-N) investem na marcação
do N por intermédio da adição de adubo marcado ou na abundância
natural desse isótopo que, através de anos (milhares), ficam em número
maior que o ar, permitindo a sua detenção. Esses métodos são chamados
de métodos de diluição isotópica, uma vez que o N2 fixado do ar dilui a
marcação do solo. Para maiores detalhes, veja o capítulo referente ao
assunto.
Vale lembrar que nenhum método usado individualmente é capaz
de estabelecer diferenças entre sistemas associativos fixadores de
nitrogênio em plantas que não formam nódulos. Existe muita controvérsia
quanto à quantidade fixada, já que ela é variável em relação ao ambiente
solo-água-planta.
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