MicroRNAs como marcadores de doenças metabólicas

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MicroRNAs como 
marcadores de doenças 
metabólicas 
MicroRNAs as biomakers of metabolic diseases 
 
 
 
 
Luan Barbosa Ribeiro 
Orientador: Prof. Dra.Alice Cristina Rodrigues 
Co-orientador: Karina Cunha e Rocha 
Departamento de Farmacologia – ICB 
 
Assinatura do orientador: 
Assinatura do aluno: 
 
 
 
RESUMO 
MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores que regulam negativamente a 
expressão de mRNAs. Eles são, portanto, reguladores de expressão gênica em nível pós-
transcricional. Os microRNAs possuem papéis essenciais em processos vitais do 
desenvolvimento celular como no metabolismo, na proliferação e na apoptose, e assim 
alterações na sua expressão têm sido associadas a diversas doenças. O laboratório de 
farmacogenômica se dedica a estudar as alterações nas expressões de microRNAs e de 
mRNAs em camundongos com obesidade e diabetes induzidas por meio de dieta 
hiperlipídica. Assim, tornam-se possíveis a identificação da interferência desses 
microRNAs na expressão de mRNAs e a ação terapêutica em novos alvos 
farmacológicos. 
 
ABSTRACT 
MicroRNAs are small non-coding RNAs that negatively regulate mRNAs expression. 
They are, therefore, gene expression regulators at post translational points of control. 
MicroRNAs have essential roles on vital processes of cellular such as on metabolism, 
proliferation and apoptosis and, thus, changes on their expression have been associated 
to many diseases. This pharmacogenomics laboratory is devoted to study the aberrant 
expressions of microRNAs and mRNAs on mice with hiperlipidic diet induced obesity 
and diabetes. Therefore it makes possible the identification of these miRNAs 
interference on mRNAs expression and the therapeutics on new pharmacological 
targets. 
 
 
 
 
INTRODUÇÃO 
A obesidade é uma doença caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura e, 
atualmente, é foco de pesquisas por todo o mundo. Em 2014, o quadro, considerado 
epidemia mundial, já atingia 15% das mulheres e 11% dos homens no mundo, o que 
correspondia a meio milhão de pessoas (1). Por essa razão, há uma grande demanda por 
novas descobertas para o tratamento da obesidade e de suas comorbidades – a exemplo 
do diabetes mellitus do tipo 2 e esteatose hepática. 
Sabe-se que a dieta de um indivíduo está intimamente relacionada à expressão de genes 
importantes para o controle da expressão de reguladores em processos metabólicos, 
como o metabolismo de lipídeos e carboidratos (2). Nesse sentido, podem ser citados os 
genes PPARα e ADIPOQ como reguladores da expressão de genes relacionados ao 
metabolismo de gorduras e de açúcares. De maneira geral, o laboratório de 
Farmacogenômica coordenado pela Profa. Dra. Alice Cristina Rodrigues busca 
investigar associações entre a expressão de pequenas sequências não-codificantes de 
RNA reguladoras desses genes – os microRNAs – e o desenvolvimento de obesidade e 
resistência à insulina, em busca de novos alvos farmacológicos para o tratamento dessas 
doenças. 
Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes de aproximadamente 
22 nucleotídeos que regulam a expressão gênica a nível pós-transcricional. Essa 
regulação depende do grau de complementariedade entre o miRNA e seu RNAm alvo e 
pode ocorrer por dois mecanismos distintos. Quando o pareamento é total, há a 
degradação do RNAm; quando ele é parcial, a tradução é inibida (3). 
A expressão alterada de miRNAs específicos em quadros de doenças pode ser utilizada 
como marcadores da doenças (4). Por esse motivo, o estudo de miRNAs tem sido um 
campo promissor para o desenvolvimento de novos tratamentos para diversas doenças. 
No caso desse laboratório, ganham destaque obesidade e a resistência à insulina. 
A biogênese de um miRNA maduro pode ser descrita, de forma sintética, em 4 etapas 
(processo ilustrado pela figura 1): 
• A RNApolimerase II sintetiza um miRNA primário (pri-miRNA), com forma de 
grampo, no núcleo; 
• A RNase III Drosha, ainda no núcleo, cliva segmentos do pri-miRNA, 
reduzindo-o a aproximadamente 70 bases, sequência denominada pré-miRNA; 
• A RNase III Dicer, agora no citoplasma, cliva o pri-miRNA formando duas 
sequências (5’ e 3’) de RNA, cada um com ~22 nucleotídeos. 
• Uma dessas sequências de miRNA é acoplada ao RISC (RNA-induced silencing 
complex), enquanto a outra é degradada. Esse complexo proteico será 
responsável por uma maior interação entre o miRNA e seu mRNA-alvo. O 
miRNA reconhece seu alvo, inibindo sua expressão (5). 
O princípio da terapia por meio de miRNA é baseado na regulação de sua expressão. 
Caso uma doença seja 
associada ao uma grande 
quantidade de 
determinado miRNA, sua 
expressão pode ser 
reduzida por meio da 
injeção de sequências de 
oligonucleotídeos 
complementares a ele – 
os AntimiRs. Por outro 
lado, se a doença ocorre 
com uma drástica 
redução da expressão de 
um miRNA funcional, 
então é indicada uma terapia de reposição de miRNAs, 
com agentes miméticos de miRNAs (6). Essa injeção já 
foi feita, nesse laboratório, via plasmídeo por meio de 
eletroporação e de lentivírus como vetor. 
MATERIAIS E MÉTODOS 
Animais 
Foi utilizada a linhagem de camundongos (C57BL/6J), porque são sensíveis à indução 
de obesidade por dieta hiperlipídica Os camundongos são alimentados por 8 semanas 
com dieta controle ou hiperlipídica e ao fim do protocolo são eutanasiados e tecidos 
como fígado, rim, hipotálamo, tecido adiposo, músculo esquelético e sangue são 
coletados para a análise de expressão de miRNAs, mRNAs e proteínas. 
Figura 1: ilustração da 
formação de um miRNA 
maduro. (adaptada de Rooij E 
van, Olson EM, Nat. Rev. Drug 
Discov .11:860-872, 2012) 
Quantificação da expressão de microRNAs e RNAm 
Para análise da expressão de mRNAs e miRNAs foi utilizada a técnica de transcrição 
reversa seguida de PCR em tempo real (RT-Qpcr). Para que essa análise seja feita, são 
necessários cinco procedimentos de preparação: a coleta de tecidos na eutanásia, a 
extração de RNA total, a quantificação de RNA por espectrofotometria, síntese de 
cDNA e qPCR. 
Extração de RNA total 
Primeiramente, é feita a homogeneização e a lise no tecido em TRIzol® (Invitrogen Life 
Technologies, Carlsbad, CA, EUA), que também solubiliza proteínas, DNA e RNA. Em 
seguida, é usado clorofórmio para extrair o RNA (a amostra é agitada e centrifugada. A 
camada superior a uma interfase esbranquiçada (de DNA) é transferida a outro tubo, 
pois é a fase que contém RNA. Isopropanol é adicionado para a desidratação e 
precipitação do RNA. A seguir, o isopropanol é retirado e o precipitado é lavado com 
etanol 75%. A solução de etanol é descartada, o restante no microtubo é evaporado. E 
então o precipitado de RNA é ressuspendido em água livre de nuclease. 
QUANTIFICAÇÃO DO RNA EM ESPECTROFOTOMETRIA 
A quantificação e pureza do RNA extraído é realizada em especetrofotômetro UV-Vis 
Biodrop µLite para a determinação de sua quantidade em volume utilizada na reação de 
transcrição reversa. A pureza é avaliada pela relação das absorbâncias a 260 e 280nm. 
SÍNTESE DE CDNA 
A partir de 1µg de RNA total, é utilizada a técnica de transcrição reversa para síntese de 
DNA complementar. São adicionados às amostras de RNA: dNTP mix, 5x first-stand 
buffer RNase out (proteção do RNA), superscript III (enzima transcriptase reversa), 
primer RT (oligodT ou random primer no caso da análise de RNAm e primer 
microRNA-específico para microRNA) e água (RNase free) em quantidade suficiente 
para 20 µL. Essa mistura é incubada por 60ºC por 5 min e 42ºC por 60 min em 
termociclador Veriti (Applied Biosystems). O cDNA obtido é armazenado em freezer a 
-20º C. 
Reação de PCR 
Para a quantificação de RNAm (a exemplo do AdipoQ) ou microRNA é utilizada a 
técnica de PCR em tempo real. Para tal, são misturados 1 µL do cDNAdiluído 10X, 
oligonucleotídeos senso e antisenso e 5µL de master mix (contendo o fluorocromo 
intercalante de DNASyBr Green) e água em quantidade suficiente para 10µL. A mistura 
é colocada em termociclador para PCR em tempo real ABI7500 e é utilizado o 
protocolo de amplificação 95º por 10min, 40 ciclos de 95ºC por 15s e 60ºC por 1 min. 
Ao fim do protocolo, é realizada a curva de dissociação para avaliar se houve 
amplificação de produto específico. 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Uma alta expressão de um RNA é 
identificada quando o platô em um 
gráfico resultante de PCR-real time é 
alcançado em menor quantidade de 
ciclos, ou ainda, quando seu Ct 
(threshold cycle: ciclo em que a amostra 
é capaz de emitir fluorescência suficiente 
para ser detectada pelo equipamento) em 
menos tempo, como ocorre na seguinte 
curva 1. Nesse caso, muitas das amostras 
tiveram seu Ct por volta de 13 e 14 
ciclos. O oposto ocorre na curva 2: 
observa-se a ocorrência de ruídos por 
quase toda a leitura e apenas um possível 
início de amplificação no final. 
A análise por PCR também 
indica a temperatura de 
dissociação do produto de PCR, 
verificada na curva 3, na qual 
ocorre um pico de fluorescência 
apenas em uma temperatura. 
Curvas que possuem mais de um 
pico, como a curva 4, indicam 
ou a formação de produtos 
inespecíficos ou a dimerização 
de primers.
Curva1: amplificação de mRNA de adiponectina 
Curva2: amplificação por PCR de amostras ruins 
Curva4:Curva de dissociação 
com dois picos de outra amostra 
de RNA de AdipoQ 
Curva3: melting curve de mRNA 
de adiponectina 
 
REFERÊNCIAS 
1. World Health Organization (2015). “Health in 2015: from MDGs to SDGs” 
2. Rottiers V, Näär AM (2012) “MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders”. 
Nature Rev Mol Cell Biol. 13: 239-2503. 
3. Frias FT, Medonça M, Martins AR, Gindro AF, Cogliati B, Curi R, Rodrigues AC 
(2016) “MyomiRs as markers of insulin resistence and decreased myogenesis in skeletal 
muscle of diet-induced obese mice”. Front Endocrinol. 7:764. 
4. Small EM, Frost JA, Olson EN (2011) “MicroRNAs add a new dimension to 
cardiovascular disease”. Circulation. 121: 1022-1032. 
5. Rooij E van, Olson EN (2012) “MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: 
opportunities and obstacles” Nat. Rev. Drug Discov .11:860-872, 2012 
6. Soifer HS, Hossi JJ, Saetrom P (2007) “MicroRNAs in disease and potential 
therapeutic applications”. Mol Ther. 15(12): 2070-2079