Introdução à Microbiologia

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Introdução à Microbiologia
Morfologia Básica: existem quatro tipos morfológicos fundamentais para bactérias, as arredondadas, as alongadas, as espiraladas e as filamentosas.
Arredondadas: incluem os cocos, que geralmente são arredondados, ovais, alongados ou achatados nas extremidades. Durante a reprodução, alguns cocos podem permanecer ligados uns aos outros, sendo denominados diplococos. Quando isto ocorre em maior número, chegando a formar cadeias, trata-se de estreptococos. Aqueles que se dividem em dois planos, formando grupos de quatro cocos, são denominados tétrade. Aqueles que se dividem em três planos, formando um cubo, chamam-se sarcinas. Já os que se dividem em planos múltiplos, formando agrupamentos semelhantes a cachos de uva, são chamados estafilococos. 
Alongadas: incluem os bacilos, que possuem a forma de bastonetes. Diferentemente dos cocos, os bacilos se reproduzem apenas ao longo de seu eixo curto, existindo um menor número de agrupamentos destes em comparação aos primeiros. A maioria dos bacilos se apresenta como bastonetes simples. Os diplobacilos se apresentam em pares após a reprodução, e os estreptobacilos se agrupam em cadeias. Alguns bacilos se assemelham a canudinhos, outros possuem as extremidades côncavas, como charutos. Existem também os cocobacilos, ovais e muitos semelhantes aos cocos. 
Espiraladas: incluem os vibriões, espirilos e espiroquetas. As bactérias espiraladas possuem sempre uma ou mais curvaturas. As bactérias que se assemelham com um bastonete curvo são os vibriões. Já os espirilos possuem forma helicoidal e um corpo bastante rígido. As espiroquetas também têm forma helicoidal; seus corpos, porém, são flexíveis. 
Filamentosas
Componentes Estruturais Bacterianos: glicocálice, flagelo, filamentos axiais, fímbrias, pili, parede celular, membrana plasmática, citoplasma, nucleóide, cromossomo, plasmídeo, ribossomos, inclusões, endosporos. 
Glicocálice: polímero viscoso e gelatinoso situado externamente à parede celular composto de polissacarídeo, polipeptídeo ou ambos. É produzido dentro da célula e secretado para a superfície celular. Quando o glicocálice se encontra organizado e firmemente aderido à parede celular, pode ser descrito como uma cápsula. Já quando a substância não é organizada e sua adesão é fraca junto à parede, sua descrição se refere a uma camada viscosa. As cápsulas frequentemente protegem a bactéria patogênica da fagocitose, e o glicocálice auxilia as bactérias a se fixarem no seu ambiente-alvo, formando o biofilme, facilitando também a comunicação entre células. Também protege a célula contra a desidratação, e sua viscosidade inibe o movimento de nutrientes para fora da célula. 
Flagelos: longos apêndices filamentosos que propelem as bactérias. As que não possuem flagelo denominam-se atríqueas. Quando distribuídos ao longo de toda a célula, trata-se de uma bactéria peritríquea. Quando os flagelos se situam nos polos das células, estes podem ser denominados polares. Se houver apenas um flagelo em um polo da célula, a bactéria é dita monotríquea. Em ambas as extremidades, a bactéria é anfitríquea. No caso de existir um tufo de flagelos em uma extremidade, trata-se de uma lofotríquea. Se existirem dois tufos, um em cada polo da célula, a bactéria é anfilofotríquea. 
Filamentos Axiais: feixes de fibrilas que se originam nas extremidades das células, sob uma bainha externa, formando uma espiral em torno da célula. São encontrados apenas nas espiroquetas. 
Fímbrias e Pili: apêndices semelhantes a pelos, porém mais curtos, retos e finos, usados mais para fixação e transferência de DNA ao invés de mobilidade. Constituem-se de pilina. As fímbrias podem ocorrer nos pólos bacterianos ou se distribuirem homogeneamente por toda a superfície da célula. Possuem a tendência de se aderir umas às outras e às superfícies. Estão envolvidas na formação de biofilme e outros agregados. Os pili normalmente são mais longos, havendo apenas um ou dois por célula. Estão envolvidos na mobilidade celular (mobilidade por deslizamento e translocação bacteriana) e na transferência de DNA (conjugação). 
Parede Celular: estrutura complexa, semirrígida, responsável pela fora da célula. Circunda a membrana plasmática, que é mais frágil, protegendo-a e o interior da célula das alterações adversas do ambiente externo. Sua principal função é prevenir a ruptura de células bacterianas quando a pressão da água no meio intracelular for mais elevada do que a do meio extracelular. Também ajuda a manter a forma e serve de ancoragem para flagelos. A parede celular é importante pois contribui para a capacidade de algumas espécies causarem doenças e também por ser o local de ação de alguns antibióticos. A composição química da parede celular é usada para diferenciar os principais tipos de bactérias. A parede celular bacteriana é composta de uma rede macromolecular denominada peptideoglicano, que se apresenta isoladamente ou em combinação com outras substâncias. O peptideoglicano é composto por um dissacarídeo repetitivo ligado por polipeptídeos. O primeiro compõe-se do monossacarídeo N-acetilglicosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM). Moléculas alternadas de NAG e NAM são ligadas em filas de 10 a 65 açúcares para formar um esqueleto de carboidratos. Filas adjacentes são ligadas por polipeptídeos. A ligação peptídica sempre inclui cadeias laterais de tetrapeptídeos , as quais consistem em quatro aminoácidos ligados ao NAM. Os aminoácidos ocorrem em um padrão alternado de formas D e L. As cadeias laterais paralelas de tetrapeptídeos podem se ligar diretamente umas às outras ou serem unidas por uma ponte cruzada peptídica, consistindo de uma cadeia curta de aminoácidos. A penicilina interfere com a ligação final das filas de peptideoglicanas pelas pontes cruzadas peptídicas, enfraquecendo a parede celular e provocando a lise da célula. 
Parede Celular de gram-positivas: consiste em muitas camadas de peptideoglicanos, contendo ácidos teióicos, constituídos de um álcool (glicerol ou ribitol) e fosfato. Existem duas classes de ácidos teioicos: ácido lipoteioico, que atravessa a camada de peptiodeoglicano e se encontra ligado à membrana plasmática, e ácido teióico da parede, que, por sua vez, liga-se à camada de peptideoglicano. Devido à sua carga negativa, os ácidos teióicos podem se ligar e regular o movimento de cátions para dentro e para fora da célula. Também assumem um papel no crescimento celular, impedindo a lise, e fornecem boa parte da especificidade antigênica da parede. 
Parede Celular de gram-negativas: consistem em uma ou poucas camadas de peptideoglicano e uma membrana externa. O peptideoglicano está associado a lipoproteínas na membrana externa e se situa no periplasma, fluido entre membrana externa e membrana plasmática. Este contém uma grande concentração de enzimas de degradação e proteínas de transporte. As paredes celulares de bactérias gram-negativas não possuem ácidos teióicos. A membrana externa da célula gram-negativa consiste em lipopolissacarídeos (LPS), lipoproteínas e fosfolipídeos, e tem várias funções especializadas. Sua forte carga negativa é um importante fator na evasão da fagocitose e nas ações do complemento, que são dois componentes de defesa do hospedeiro. Também fornece uma barreira contra certos antibióticos, enzimas digestivas (lisozima), detergentes, metais pesados, sais biliares e certos corantes. Entretanto, a membrana externa não é impermeável a todas as substâncias. Parte da permeabilidade da membrana externa se dá por meio de porinas, proteínas que formam canais. Estas permitem a passagem de moléculas como nucleotídeos, dissacarídeos, peptídeos, aminoácidos, vitamina B12 e ferro. O LPS é uma molécula grande e complexa que contém lipídeos e carboidratos, possuindo 3 componentes: lipídeo A, cerne polissacarídico e um polissacarídeo O. O lipídeo A está embebido na parede superior da membrana externa. Quando as bactérias gram-negativas morrem, este lipídeo é liberado, funcionando como uma endotoxina. O cernepolissacarídico é ligado ao lipídeo A e contém açúcares incomuns. Seu papel é estrutural: fornecer estabilidade. O polissacarídeo O se estende para fora do cerne polissacarídico e é composto por moléculas de açúcar. Funciona como um antígeno. Seu papel é comparável ao dos ácidos teióicos nas bactérias gram-positivas. 
Paredes Celulares Atípicas: certos tipos de células bacterianas não possuem parede celular ou apresentam pouco material da mesma. Entre elas, o gênero Mycoplasma, cujas membranas plasmáticas são únicas por possuírem esteróis que as protegem da lise. As arquibactérias podem não ter parede ou possuírem paredes incomuns compostas de polissacarídeos e proteínas, porém não de peptídeoglicano. Essas paredes, entretanto, contém uma substância similar, a pseudomureína, que possui ácido N-acetiltalosaminurônico em vez de NAM, e não possui D-aminoácidos. As bactérias do gênero Mycobacterium e Nocardia possuem alta concentração (60%) de um lipídeo céreo hidrofóbico (ácido micólico) em sua parede que previne a entrada de corantes, incluindo aqueles aplicados na técnica de Gram. O ácido micólico forma uma parede externa a uma camada fina de peptideoglicano. Os dois se unem por meio de um polissacarídeo. Esta parede hidrofóbica cérea induz as culturas de Mycobacterium a se agregar e aderir à paredes dos frascos de cultura. 
Membrana Plasmática: estrutura fina situada no interior da parede celular, revestindo o citoplasma da célula. Consiste principalmente de fosfolipídeos e proteínas. A função mais importante da membrana plasmática é servir como uma barreira seletiva através da qual materiais entram e saem da célula (permeabilidade seletiva). Também são importantes na digestão de nutrientes e na produção de energia. A membrana plasmática das bactérias contêm enzimas capazes de catalisar as reações químicas que degradam os nutrientes e produzem ATP. 
Citoplasma: substância da célula no interior da membrana plasmática. É composto por água, proteínas, carboidratos, lipídeos, íons inorgânicos e compostos de baixo peso molecular. O citoplasma é espesso, aquoso, semitransparente e elástico. As principais estruturas encontradas no citoplasma são uma área nuclear, contendo DNA, ribossomos e os depósitos de reserva denominados inclusões. Proteínas filamentosas no citoplasma são responsáveis pela forma helicoidal e de bastonete da célula bacteriana. 
Nucleóide: contém uma única molécula longa e contínua de DNA de fita dupla, com frequência arranjada de forma circular, denominada cromossomo bacteriano. Pode ser esférico, alongado ou em forma de halteres. O cromossomo se encontra fixado à membrana plasmática. 
Plasmídeos: pequenas moléculas de DNA de fita dupla e circulares. Trata-se de elementos genéticos extracromossômicos que se replicam independentemente. Estão associados a proteínas da membrana plasmática. Contém de 5 a 100 genes que não são cruciais para a sobrevivência da bactéria em condições normais. Podem transportar genes para atividades como resistência a antibióticos, tolerância a metais tóxicos, produção de toxinas e síntese de enzimas. Podem ser transferidos de uma bactéria para outra. 
Ribossomos: organela responsável pela síntese proteica. São compostos de duas subunidades, cada qual consistindo de proteína e um tipo de RNA denominado RNA ribossômico. 
Inclusões: vários tipos de depósitos de reserva. As células podem acumular certos nutrientes quando são abundantes e usá-los durante períodos de escassez. Os vários tipos de inclusões são: grânulos metacromáticos, grânulos polissacarídicos, inclusões lipídicas, grânulos de enxofre, carboxissomos, vacúolos de gás e magnetossomos. 
Endosporos: quando alguns nutrientes essenciais se esgotam, certas bactérias gram-positivas formam células especializadas de “repouso”, denominadas endosporos. Trata-se de células desidratadas altamente duráveis, com paredes espessas e camadas adicionais. Os endosporos são formados dentro da membrana celular bacteriana. Quando liberados no ambiente, podem sobreviver a temperaturas extremas, falta de água, exposição a substâncias tóxicas e radiação. O processo de formação dos endosporos é chamado esporulação ou esporogênese. No primeiro estágio observável, um cromossomo bacteriano recém-replicado e uma pequena porção de citoplasma são isolados por uma invaginação da membrana, denominada septo do esporo. Este torna-se uma membrana dupla que circunda o cromossomo e o citoplasma. Essa estrutura é denominada pré-esporo. Camadas espessas de peptideoglicano são dispostas entre as duas lâminas da membrana. Então, uma espessa camada de proteína se forma em torno da membrana externa. Esse revestimento é responsável pela resistência dos endosporos. A célula original é degradada, e o endosporo é liberado. O cerne altamente desidratado do endosporo contém somente DNA, RNA, ribossomos, enzimas e algumas moléculas pequenas importantes (ácido dipocolínico). Um endosporo retorna ao seu estado vegetativo por um processo denominado germinação. A germinação é ativada por uma lesão química ou física no revestimento do endosporo. Então, as enzimas do endosporo rompem as camadas extras que o circumdam, a água entra e o metabolismo recomeça. 
Coloração de Gram: desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram e classifica as bactérias em dois grandes grupos, as gram-positivas e as gram-negativas. As etapas deste processo se dão da seguinte forma:
Fixar a lâmina no calor do bico de Bünsen.
Corar com cristal violeta por 1 minuto. Esta coloração impregna todas as células, sendo denominada coloração primária. 
Enxaguar a lâmina.
Recobrir o esfregaço com lugol/iodo por 1 minuto. 
Lavar a lâmina com solução álcool-acetona por 5s.
Corar o esfregaço com safranina por 30 segundos. A safranina contrasta com a coloração primária, sendo denominada contra-corante. 
Lavar e secar a lâmina antes de levá-la ao microscópio, usando óleo de imersão para o aumento de 100x. Limpar o miscroscópio com xilol. 
O cristal violeta e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactéria, corando-a de violeta. As bactérias que retém essa coloração após a tetativa de descolorí-las com álcool-acetona são classificadas de gram-positivas. As demais bactérias são gram-negativas, coradas com safranina nas estapas seguintes do método de Gram, adquirindo um aspecto rosado. 
Nas primeiras etapas da coloração de Gram, as moléculas de cristal violeta penetram facilmente na parede celular das bactérias. Lá formam o complexo cristal violeta-iodo, bem maior do que as moléculas anteriores, o que impede a saída do corante. No entanto, a solução álcool-acetona age na camada de lipopolissacarídeos das bactérias gram-negativas, descolorindo-as. A partir de então, as bactérias gram-negativas permanecem incolores até ser adicionado o corante safranina. 
Técnica de Ziehl-Neelsen ou Coloração Álcool-Ácido Resistente: coloração diferencial que se liga fortemente a bactérias que possuem material céreo na parede celular. Utiliza-se esta técnica para identificar todas as bactérias do gênero Mycobacterium, incluindo M. tuberculosis e M. leprae, e bactérias do gênero Nocardia. As etapas deste processo são as seguinte:
Fixar a lâmina;
Cobrir o esfregaço com carbolfucsina; 
Aquecer lentamente a lâmina até emissão de vapor, sem chegar à ebulição;
Corar durante 5min;
Lavar com água em abundância;
Cobrir a lâmina com descorante álcool-ácido a 3% por 5 a 10s;
Lavar e remover o excesso do líquido;
Aplicar contracorante de contraste azul de metileno durate 1min;
Enxaguar, escorrer e secar ao ar.
Os micro-organismos álcool-ácido resistentes retêm a cor vermelha, uma vez que a carbofucsina é mais solúvel nos lipídeos da parede celular do que no álcool-ácido. Em bactérias que não são álcool-ácido resistentes, a carbolfucsina é rapidamente removida durante a descoloração, deixando estas células incolores até a aplicação de azul de metileno.