3 fosforilaoxidativa

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FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA
BIOQUÍMICA II
Profa Dra Jane Marlei Boeira
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Roteiro da aula
Introdução
Teoria quimiosmótica
Enzima ATPase
Translocadores de ATP, ADP e Pi
Agentes desacopladores
Produção de calor pela gordura marrom
Controle da Produção de ATP
Lançadeiras de Glicerol-Fosfato e Malato-Aspartato
Mitocôndrias defeituosas
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Fosforilação oxidativa
Introdução 
O fluxo de elétrons pelos Complexos I, III e IV leva à transferência de prótons do lado da matriz para o espaço intermembranas da mitocôndria. 
O fluxo de prótons de volta à matriz através da ATP sintase (também conhecida como Complexo V) impulsiona a produção de ATP (fosforilação oxidativa)
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Fosforilação oxidativa
Peter Mitchell (1961) propôs a teoria quimiosmótica.
Segundo a teoria: a energia livre do transporte de elétrons é conservada pelo bombeamento de H+ através da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana, criando um gradiente eletroquímico de H+ entre os dois compartimentos mitocondriais.
O potencial eletroquímico desse gradiente é aproveitado para síntese de ATP
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O retorno dos prótons para a matriz se dá pelo componente Fo da enzima ATPase, liberando energia para a síntese de ATP, a partir de ADP e Pi.
Teoria Quimiosmótica
pH externo é menor
 = potencial elétrico de membrana interno é negativo
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Teoria Quimiosmótica
Evidências dessa teoria:
A fosforilação oxidativa necessita de uma membrana mitocondrial interna (MMI) intacta
A MMI é impermeável a íons
O transporte de e- resulta no transporte de H+ para fora da mitocôndria intacta (o espaço intermembranas é equivalente ao citosol)
Os desacopladores (compostos que aumentam a permeabilidade da membrana) não impedem o transporte de e-, mas inibem a síntese de ATP
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Esta teoria foi demonstrada experimentalmente usando a bacteriorrodopsina, uma proteína púrpura de membrana de Halobacterium halobium, que bombeia H+ quando iluminada
Vesículas sintéticas contendo essa proteína e ATP sintase mitocondrial (coração bovino) quando expostas à luz formavam ATP
Demonstrou que a CTE e a ATP sintase são sistemas separados, unidos somente pela força próton-motriz
Teoria Quimiosmótica
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O componente F1 possui o sítio ativo (subunidade b) e o componente Fo possui o canal de prótons (subunidade b2)
Espaço 
intermembranas
Matriz 
A FoF1-ATPase ou ATP-sintase
Domínio F1 33
Domínio F0
ab2c10-12
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Os protômeros idênticos b são distintos em seus estados conformacionais: O tem baixa afinidade por ATP e ADP+Pi, sendo cataliticamente inativo; L liga-se frouxamente aos ligantes e é cataliticamente inativo; T liga-se firmemente aos ligantes sendo cataliticamente ativo. Na primeira etapa ADP + Pi ligam-se ao sítio L.
Mecanismo de alteração da ligação
O = open, aberto; L= loose, frouxo; T = tight, tensa
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A energia liberada pelo retorno dos prótons pelo componente Fo promove a rotação da subunidade g e a conseqüente interconversão dos sítios: o sítio O é transformado em L, o sítio L em T e o sítio T em O. Assim um ATP é sintetizado e outro é liberado do componente F1.
O = open, aberto; L= loose, frouxo; T = tight, tensa
Mecanismo de alteração da ligação
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Mecanismo de alteração da ligação
para ATP sintase
Protômeros catalíticos de F1 são idênticos quimicamente e se interconvertem em 3 estados (T, L, O)
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Mecanismo de alteração da ligação
para ATP sintase
A subunidade  sofre rotação dentro do conjunto 3β3 e atua como um eixo de comando na ligação do motor rotacional impulsionado pelo gradiente de prótons (H+) às mudanças conformacionais nos sítios catalíticos de F1
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ANIMAÇÃO
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Translocadores de nucleotídeos da adenina e fosfato
Translocadores de ATP, ADP e Pi
ATP sintase
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Um ionóforo transportador de prótons H+, como o 2,4-dinitrofenol (DNP), desacopla a fosforilação oxidativa da cadeia respiratória por desfazer o gradiente eletroquímico de prótons H+ gerado pelo transporte de elétrons.
Ação dos Agentes Desacopladores
ANIMAÇÃO: http://www.ensino.ib.unicamp.br/cdbioq/CTE.swf
Matriz 
Elevado pH
Citosol 
Baixo pH
O desacoplamento permite que o transporte de elétrons siga livremente, mesmo quando a síntese de ATP está inibida
Difusão
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Mamíferos recém-nascidos que não possuem pêlos, como os humanos e os que hibernam possuem gordura marron.
As mitoncôdrias da gordura marrom possuem uma proteína denominada termogenina ou proteína desacopladora. Os prótons H+ retornam para a matriz mitocondrial pelo canal existente nesta proteína e não pelo canal da ATP sintase. A energia do retorno produz calor (mantém a T corporal).
O desacoplamento no tecido adiposo marron gera calor
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Proporção P/O
Relaciona a quantidade de ATP sintetizado com a quantidade de O2 reduzido
Experimentos com mitocôndrias isoladas mostram que a oxidação do NADH é associada à síntese de aprox 3ATP e a oxidação do FADH2, com aprox 2ATP – compatível com a teoria quimiosmótica
A oxidação do composto não-fisiológico tetrametil-p-enilenodiamina (que doa um par de elétrons para o Complexo IV), gera aproximadamente 1 ATP
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Controle da síntese de ATP
A velocidade do transporte de elétrons e síntese de ATP são dependentes da [ADP] 
Transporte de elétrons está acoplado à síntese de ATP
ADP tem concentrações limitantes
Quanto mais ADP formado maior a velocidade das reações de catálise e maior produção de ATP
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Controle da Fosforilação Oxidativa
A fosforilação oxidativa é controlada pela proporção  [NADH]/[NAD+] e 				 [ATP]/[ADP][Pi]
 
A glicólise e o Ciclo de Krebs são regulados coordenadamente de acordo com a necessidade para a fosforilação oxidativa
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Controle da Fosforilação Oxidativa
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Oxidação do NADH citossólico
Membrana interna mitocondrial impermeável
Oxidação indireta por lançadeiras
Malato – Aspartato
Células hepáticas, cardíacas e renais
Permeases – proteínas de transporte da membrana
 
Glicerol-fosfato
Músculo esquelético de mamíferos
Músculo de vôo de insetos
NADH – FADH2
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Matriz 
Mal= Malato
OAA = Oxaloacetato
KG = -cetoglutarato
Asp= aspartato
Glu= glutamato
Lançadeira Malato-Aspartato (coração e fígado)
Malato DHase
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Lançadeira do glicerol-fosfato (músculo esquelético de mamíferos)
G-3P desidrogenase citosólica
G-3P desidrogenase motocondrial
No citosol, os elétrons do NADH reduzem a diidroxiacetana-P à glicerol 3-P. Este é reoxidado pela transferência de elétrons a um FAD (produzindo um FADH2) por uma glicerol fosfato desidrogenase mitocondrial
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O DNA mitocondrial possui 37 genes: 13 codificam para as proteínas da cadeia respiratória e para ATP-sintase e os demais codificam rRNAs e tRNAs.
Mitocôndrias Defeituosas
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 O efeito fenotípico de mutações mitocondriais reflete a extensão da dependência de um certo tecido à fosforilação oxidativa. 
 O SNC é o mais sensível, seguido do músculo esquelético, rim e fígado
 Mutações no Complexo I são a causa mais comum de doenças mitocondriais
 Neuropatia Óptica Hereditária de Leber - defeito no gene ND4 (complexo I): Arg → His, induz a falta ATP para o metabolismo dos neurônios
 Afeta o SNC, causando perda da visão bilateral
Mitocôndrias Defeituosas
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A fosforilação oxidativa defeituosa em células  pancreáticas bloqueia a secreção de insulina 
Normalmente quando a glicose sanguínea aumenta, a produção de ATP nas células  aumenta. 
O ATP, bloqueando canais de K+ 
, despolariza a membrana e, assim, abre os canais de Ca+2. 
O influxo de Ca+2 desencadeia a exocitose nas vesículas secretoras, liberando insulina. Quando a fosforilação oxidativa em céls  é defeitousa, a [ATP] nunca é suficiente para desencadear este processo e a insulina não é liberada. 
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 Apoptose ou morte celular programada
 Mitocôndrias atuam como centro de controle desse processo 
 Na mitocôndria lesada, forma-se um poro de transição da permeabilidade
mitocondrial (mtPTP), constituído de um translocador de adenina nucleotídeo e várias outras proteínas, como as Bcl (envolvidas no câncer)
 Citocromo c ativa uma caspase envolvida no processo de apoptose
Mitocôndrias desempenham papel importante na apoptose
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Papel da mitocôndria na apoptose (via intrínseca)
2. Ligação do citocromo c em Apaf 1 formando um complexo
1. Mitocôndria recebe um estímulo apoptótico e libera citocromo c no citosol
5. Caspase 9 ativa as procaspases executoras que induzem apoptose 
3. Formação de um apotossomo (várias moléculas de complexo (Apaf1-cit c)
4. Ativação de uma procaspase 9 que se torna ativa
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Referências
CAMPBELL, Mary K. Bioquímica. Editora ARTMED, POA, 2000.
DEVLIN, Thomas M. Manual de bioquímica com correlações clínicas.Ed. Edgar Blücher Ltda, S.P. 2008. 
LEHNINGER, L. Albert; Nelson, Cox. Princípios de bioquímica; Editora Savier;S.P. 2002
STRYER, L. Bioquímica. Guanabara Koogan, 2008 
VOET, DONALD; JUDITH G; CHARLOTTE W. Fundamentos de bioquímica. Artmed, 2008.
Animações:
	http://www.youtube.com/watch?v=JdjCzhAS2N8&p=FE08A4C2E0F7A782&playnext=1&index=3
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