Citometria de Fluxo

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Citometria de Fluxo 
Fluorescência 
É um sinal com especificidade química. Um material de natureza fluorescente emite luz fluorescente quando excitada por uma luz também. E esse sinal fluorescente pode ser usado na microscopia para formar imagens, pode ser usado na citometria para quantificação, e outros casos.
A ENEGIA DADA PARA EXCITAR O ÁTOMO, NO CASO DA FLUORESCENCIA, SEMPRE É A LUMINOSA.
Uma molécula tem níveis eletrônicos, e cada um deles tem níveis vibracionais. 
O que vai acontecer se jogar luz em uma molécula tem que propriedade de fluorescência? Jogar luz suficiente pode mover o elétron do estado fundamental para o estado excitado, além de promover o estado vibracional, ou seja, vai para o nível eletrônico e vibracional mais excitado. No retorno, ele perde energia, apenas vibracional, não tendo emissão de luz (apenas uma acomodação). O elétron depois de um tempo vai voltar para o estado fundamental, e quando houver essa transição entre níveis de energia ELETRÔNICOS é que ocorre emissão de luz.
Diferença na luz que está jogando para excitar e na florescência que está saindo. Tem que se jogar uma energia maior, e quanto maior a energia, menor o comprimento de onda. Ou seja, para ver a haver a reacomodação e a fluorescência é necessário jogar uma luz de maior energia/menor comprimento de onda para ver outra de menor energia/maior comprimento de onda. 
Ou seja, o stokes shift é a diferença do comprimento que se usa para excitar (comprimento de onda de absorção ou de excitação) e o comprimento de onda de emissão. E ele vem dessa perda de energia que ocorre devido a reacomodação vibracional. Exemplo, com um corante que emite no vermelho normalmente vai se usar luz verde para excitar; Um que emite no azul, normalmente UV. Logo precisamos saber o espectro de absorção e de emissão do marcador. 
 Absorção Emissão 
 E= hf = hc . λ
 ↓λ ↑λ 
Com a velocidade da luz se comporta em função do comprimento de onda.
O máximo da absorção está em 490 e o máximo da emissão em 525 – a diferença é o scoll shift.
Tenho que jogar luz para excitar, e coletar luz. Luz selecionada pelo filtro de excitação (comprimento de onda) e eliminar a luz de excitação com o filtro de absorção, emitindo a fluorescência.
Autofluorescência + marcador – usando a fluorescência secundária. 
Proteína verde – modificação no sistema genético/expressão.
Pontos quânticos – marcador atual (anos 2000).
O FILTRO MAIS USADO É O PASSA BANDA. 
Tem o short pass – passa tudo abaixo do determinado comprimento de onda. E o long pass – passa tudo acima do determinado comprimento de onda.
Espelho dicroico – ele reflete a luz que eu quero excitar, e deixa passar a luz da fluorescência. Ele tira a luz de excitação.
A citometria de fluxo pode ser usada para análise de ciclo e proliferação celular, vias de morte (apoptose/necrose), imunofenotipagem e identificar células sanguíneas, estudar entrada e saída de cálcio da célula, e nos citômetros mais modernos, separação celular. 
Citometria de fluxo é uma técnica multiparametrica (pode usar mais de um parâmetro simultaneamente) QUANTITAVA (principalmente), qualitativa, e rápida. 
Analise mais de células. A análise de tecido - estudado em suspensão.
TODO CITOMETRO TEM QUE TER:
- Sistema de fluxo (forma que ele vai caminhar o sistema biológico para ser analisado);
Aspira as células do pendofire, e coloca em filas indianas, para que cada célula seja analisada individualmente pela luz.
- Sistema óptico (usar parâmetros opticos para extrair informações); 
Laser, detectores e filtros (espelhos que direcionam os sinais para os detectores).
A luz, através de laser (monocromático, polimar) interage célula a célula.
Pelo menos três detectores: Sinais proporcionados pela interação do laser com a célula.
- Espalhamento frontal (FSC) – tamanho.
- Espalhamento lateral (SSC) – complexidade.
- Fluorescência - 
- Sistema eletrônico (análise quantitativa apresentada na forma de gráfico, por exemplo).
Transforma em gráficos sinais que chegam nos detectores (fotomultiplicadores) quem tem sinal de voltagem, interpretado pelo sistema.