O Ácido Desoxirribonucleico

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O Ácido Desoxirribonucleico - DNA
Introdução
Foi intuitivamente que o homem começou a fazer uso da genética a seu favor. Já em 9000 A.C., mesmo sem compreender alguns conceitos, que seriam descobertos mais tarde, o homem selecionou as melhores sementes para o plantio e escolheu os animais mais vigorosos para a reprodução. Os primeiros filósofos da humanidade já falavam de alguns fenômenos genéticos (sem saber a suas causas) e com o desenvolver da sociedade pessoas de todas as áreas como médicos, matemáticos, físicos, padres e filósofos, também contribuíram com ideias para o entendimento da hereditariedade.
No século XVII, um monge Augustiniano chamado Gregor Mendel, deu o primeiro grande passo para desvendar a hereditariedade. Através da análise dos cruzamentos entre ervilhas, Mendel deduziu a presença de fatores hereditários que eram propagados de forma estável de geração a geração, sendo responsáveis pela formação de características individuais.
Com o avanço dos estudos de biologia celular, puderam-se determinar quais os principais componentes moleculares da célula. Durante muito tempo as proteínas carregaram o papel de propagadoras da informação hereditária. Em 1928, Frederick Griffth, um médico londrino, em experimentos com Pneumococcus, células bacterianas causadoras de pneumonia, descobriu o fenômeno da transformação. Neste experimento foi mostrado que Pneumococcus patogênicos, portadores de cápsulas, quando mortos por calor e colocados em contato com células de uma linhagem não encapsulada, e não patogênica, era capaz de transformar as células não patogênicas em células patogênicas encapsuladas e letais (figura 1).
Figura 1- O experimento que levou Griffith a propor um "Princípio Transformante".
Camundongos que recebiam a mistura de bactérias patogênicas mortas e não patogênicas vivas morriam por pneumonia e possuíam células encapsuladas (patogênicas em seu sangue).
Alguns anos mais tarde, em 1942, Avery e colaboradores, baseados no experimento de Griffith, separaram o extrato celular em várias frações (proteínas, DNA, RNA, lipídeos e carboidratos) e repetiram o experimento com os Pneumococcus.
Apenas a fração contendo DNA recuperou a capacidade das bactérias formarem novamente a cápsula. A fração de DNA não perdia a sua capacidade transformante quando tratada com proteases ou quando era aquecido, todavia, o mesmo não valia para o tratamento com DNAse.
Outro experimento que ajudou a confirmar que o DNA era o material genético foi o clássico experimento do liquidificador de Alfred Hershey e Martha Chase em 1952. Para esse experimento marcaram-se duas culturas de fagos T2, uma com fosfato radioativo (32P) e outra com enxofre radioativo (35S), sendo que o fosfato se incorporaria ao DNA e o enxofre às proteínas. De infecções paralelas de E. coli com fagos marcados com enxofre e fosfato radioativos foram tiradas amostras em diferentes tempos e estas, foram agitadas em um liquidificador de forma a separar as cápsulas dos fagos das bactérias. Após isso, as culturas foram centrifugadas, pois as cápsulas virais ficariam no sobrenadante e as células ficariam no precipitado. Foi constatado que grande parte do 32P ficava na fração bacteriana, enquanto que a maior parte da fração proteica ficava no sobrenadante. Dessa forma, Hershey e Chase constataram que o que passava para dentro da bactéria, e que era responsável pela formação dos outros fagos, era o DNA e não as proteínas. 
Figura 2- O experimento do liquidificador de Hershey e Chase para ajudar a confirmar que o DNA é o responsável pela hereditariedade.
Apesar da constatação de que o DNA desempenhava um papel imprescindível na hereditariedade, a comunidade científica ainda relutava um pouco para considerá-lo como o carregador da informação genética. Em 1953 James Watson e Francis Crick, baseados em vários trabalhos da época sobre o DNA (Como o trabalho de Chargaff, sobre a composição do DNA e as proporções das bases e os trabalhos de Wilkins com difração de raios-X de moléculas de DNA), publicaram na revista científica Nature um trabalho denominado “Molecular Structure of Nucleic Acids- A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid” (Estrutura molecular dos ácidos nucléicos- Uma Estrutura para o Ácido Desoxirribonucléico), que descrevia a estrutura do DNA.
Watson e Crick descreveram o DNA como uma dupla fita, enrolada em hélice ao redor de um eixo, sendo as fitas antiparalelas. O DNA possui uma estrutura periódica que se repete a cada 10 nucleotídeos. As bases nitrogenadas das duas fitas estão voltadas para o interior da hélice e pareiam de forma complementar entre si, na qual Adenina se liga a Timina e Guanina se liga a Citosina (figura 3).
Figura 3 - A ligação entre os nucleotídeos, A com T e C com G.
Somente depois do modelo de Watson e Crick o DNA foi considerado o material genético, pois sua própria estrutura já dava fortes indícios de como ocorreria a sua propagação (Replicação) e como era guardada a informação genética. No mesmo ano, Watson e Crick publicaram mais dois trabalhos falando sobre o assunto e em um deles, devido à obviedade do seu modelo, são discutidas as implicações moleculares do modelo na genética, comentando sobre as mutações e sobre a replicação. O reconhecimento final do trabalho de Watson e Crick veio em 1963 com o recebimento do Prêmio Nobel.
Figura 4 – Os descobridores da estrutura do DNA: Watson (à esquerda) e Crick (à direita)
Aspectos funcionais e estruturais 
A estrutura de dupla hélice do DNA
 
O DNA é composto por duas cadeias de nucleotídeos. No entanto, elas não estão lado a lado de uma maneira qualquer. Lembre-se de que os polímeros de nucleotídeos apresentam uma orientação 5’ → 3’ definida pelo esqueleto açúcar-fosfato.
Figura 2: O suporte açúcar-fosfato está representado em preto. No centro da molécula, encontram-se os pares de bases formados por interações do tipo pontes de hidrogênio.
As cadeias de DNA são ditas “complementares”, pois a base presente em uma das cadeias determina a base presente na outra cadeia. Observe que a base C está em frente à base G, a A em frente à T, a G em frente à C e a T em frente à A. Esse arranjo dá a ideia de complementaridade e está de acordo com a regra de Chargaff: A = T e C = G. Além disso, essa complementaridade de bases assegura a formação de uma duplicata exata da informação genética parental quando o DNA é replicado. Repare também que, ao longo dos filamentos, existem sinais negativos, que representam os diversos grupamentos fosfatos carregados negativamente. Lembre-se que, em pH fisiológico, os ácidos nucleicos se comportam como poliânions, o que permite seu fracionamento através da técnica de eletroforese em gel. 
Observe ainda na Figura 2 que as interações entre as bases são do tipo pontes de hidrogênio. A interação entre as bases adenina (A) e timina (T) é formada por duas pontes de hidrogênio, enquanto entre as bases guanina (G) e citosina (C) formam-se 3 pontes de hidrogênio. 
Os dois átomos de hidrogênio no grupamento NH2 são ligeiramente positivos (δ+), uma vez que o nitrogênio, por ser mais eletronegativo que o hidrogênio, tende a atrair os elétrons envolvidos nas ligações N – H. O átomo de oxigênio, por ser também mais eletronegativo que o carbono, atrai os pares de elétrons da ligação dupla com o carbono, ficando ligeiramente negativo (δ-). Esta situação propicia a formação de uma ponte de hidrogênio, ou seja, a interação entre um átomo de H ligeiramente positivo e um átomo ligeiramente negativo, que neste exemplo é o oxigênio, mas poderia também ser o nitrogênio (Figura 3).
As distâncias entre as bases e o espaço ocupado por elas são praticamente os mesmos nos dois pares de bases A=T e C Ξ G (Figura 4). Como o diâmetro da molécula de DNA é constante ao longo de toda a sua extensão, parece razoável que o pareamento ocorra entre uma purina, que apresenta dois anéis fusionados em sua estrutura, e uma pirimidina, que contém apenas um anel. O pareamentoentre duas purinas ou entre duas pirimidinas caracteriza alterações no DNA, promovendo distorções estruturais que são reconhecidas por sistemas de reparo específicos.
Figura 4: Pares de bases definidos por Watson e Crick, também chamados pares Watson-Crick. Representação dos padrões de pontes de hidrogênio formadas entre as bases de cada par, assim como a distância entre as bases e o espaço ocupado por cada par de bases.
No modelo de Watson e Crick, uma volta completa de cada hélice media 34 Å, correspondendo a 10 pares de bases. Estudos posteriores revelaram que a extensão de uma volta completa é de fato 36 Å, englobando 10,5 pares de bases. Consequentemente, a distância entre dois pares de bases é de 3,4 Å. O diâmetro interno ao longo de toda a estrutura é de 20 Å. Observe que, dentro dos limites do contorno cilíndrico da dupla hélice, encontram-se dois sulcos: o sulco maior, de aproximadamente 23 Å, e o sulco menor, de cerca de 13 Å (Figura 5). Esses sulcos são grandes o bastante para acomodar cadeias polipeptídicas, fundamentais nos processos celulares que contam com a participação do DNA, como replicação e transcrição. 
Figura 5: A dupla hélice de DNA. São destacados: os sulcos maior e menor, a extensão correspondente a uma volta completa da hélice, o diâmetro da molécula, os sentidos dos filamentos, o eixo e os pares de bases na parte central da molécula e os sinais negativos representando os fosfatos carregados negativamente.
Forças que estabilizam a dupla hélice do DNA 
O contato íntimo entre os pares de bases, que estão posicionados em um plano quase perpendicular ao eixo da dupla hélice, é favorecido por interações fracas, que são de suma importância para a estabilização da estrutura tridimensional do DNA. 
Os pares de bases se posicionam no interior da dupla hélice, ficando, portanto, protegidos da água. Em contrapartida, o suporte açúcar-fosfato, carregado eletricamente e hidrofílico, localiza-se no exterior, em contato direto com a água. A estabilidade da estrutura helicoidal é diminuída pela repulsão entre os grupos fosfatos dos filamentos. Por isso, eles devem ser mantidos afastados o máximo possível um do outro para reduzir a repulsão eletrostática. Essa repulsão também é neutralizada pela presença de íons positivos, como por exemplo Mg2+, poliaminas e polipeptídeos com cadeias laterais carregadas positivamente. No módulo intermediário, você aprenderá que o DNA eucariótico encontra-se em associação com histonas, proteínas carregadas positivamente, no núcleo da célula. 
A disposição planar dos átomos dos anéis das bases nitrogenadas é importante, pois permite o “empilhamento das bases”. Além disso, as bases são hidrofóbicas e praticamente insolúveis em água no pH intracelular. Entretanto, em valores de pH ácidos ou básicos, as bases se tornam carregadas e sua solubilidade em água aumenta. 
As interações hidrofóbicas existentes entre duas ou mais bases, em que os planos de seus anéis ficam paralelos, como se fosse um empilhamento de moedas constituem uma das interações importantes entre as bases dos ácidos nucleicos. O empilhamento das bases também envolve uma combinação de interações dos tipos Van der Waals e dipolo-dipolo. É importante você saber que o empilhamento de bases contribui para minimizar o contato das bases com água e que as forças de empilhamento estabilizam a dupla hélice quase tanto quanto as pontes de hidrogênio.
Desnaturação e renaturação do DNA 
Uma solução de DNA em sua estrutura nativa apresenta-se viscosa em pH 7,0 a 25ºC. Quando essa solução é submetida a extremos de pH ou a temperaturas acima de 80ºC, sua viscosidade diminui drasticamente, indicando a mudança física do DNA. Assim, o calor e os extremos de pH causam a “desnaturação do DNA dupla hélice”.
ÁCIDO RIBONUCLEICO- RNA
Estrutura do RNA 
O RNA é uma molécula intermediária na síntese de proteínas. Ela faz a intermediação entre o DNA e as proteínas. As principais diferenças entre o RNA e o DNA são sutis, mas fazem com que o RNA seja mais instável que o DNA. Nesta aula vamos estudar os aspectos estruturais e funcionais dessa molécula. 
 
O RNA como material genético 
Em 1957, os pesquisadores Fraenkel-Conrat e Singer identificaram o RNA como material genético de um vírus que causa descoloração da folha de muitas plantas, incluindo o do fumo: o Tobacco Mosaic Virus (TMV). O TMV foi empregado nos experimentos de Fraenkel-Conrat e Singer porque já se sabia que era constituído apenas de RNA e proteína. O papel do RNA como material genético se restringe a grupos específicos de vírus. 
Características químicas dos RNAs 
O DNA e o RNA são quimicamente similares. O RNA também é um polímero linear não ramificado de nucleotídeos. Observe na tabela a seguir as principais diferenças entre RNA e DNA. 
A presença do grupo 2’-hidroxila adjacente faz com que a ligação fosfodiéster do RNA seja mais susceptível às hidrólises química e enzimática do que a ligação fosfodiéster do DNA. Essa característica faz com que alguns RNAs – como os RNAs mensageiros (mRNAs) de bactérias – sejam sintetizados, usados e degradados em minutos. 
Os RNAs de eucariotos, cujo tamanho varia de 65 a mais de 200.000 nucleotídeos, apresentam sequencias de bases complementares às sequencias de porções específicas de somente uma fita de DNA. O resultado disso é que todos os RNAs celulares analisados até o momento são lineares e apresentam uma única cadeia polinucleotídica, ou seja, uma única fita. Assim, diferentemente da composição de bases do DNA, as razões de A + U e C + G no RNA não são iguais, e a regra de Chargaff não se aplica. O mesmo ocorre com moléculas de DNA formadas por um único filamento, como é o caso do material genético de alguns bacteriófagos. Em contrapartida, se estivermos tratando de duas fitas de RNA, como o genoma de certos vírus de RNA, a complementaridade pode existir e a regra de Chargaff pode ser aplicada. 
Como essa molécula é constituída por um único filamento, parece óbvio que ela não forme uma dupla hélice extensa. As estruturas tridimensionais de muitos RNAs são complexas e únicas. Para a estrutura do RNA, o empilhamento de bases, que atua restringindo as possíveis conformações da molécula, é mais importante para a determinação de interações intermoleculares1 e intramoleculares2 do que a ponte de hidrogênio. As interações de empilhamento de bases desempenham, portanto, um importante papel na estabilização da conformação da molécula. 
A estrutura helicoidal também existe no RNA, mesmo na ausência de pareamento extensivo de bases do tipo Watson-Crick, ou seja, A=T e C Ξ G. A estrutura helicoidal ocorre principalmente por causa das forças de empilhamento de bases, que são mais fortes entre duas purinas do que entre uma purina e uma pirimidina ou entre duas pirimidinas. Ao longo desta disciplina, a representação de pares de bases que não sejam os pares Watson-Crick (formados entre as bases A e T e entre as bases C e G) será feita com o símbolo (•) entre os símbolos das bases envolvidas no pareamento. 
As sequencias complementares na molécula de RNA podem produzir estruturas ainda mais complexas. Uma região do RNA pode formar pares de bases com regiões complementares tanto de RNA como de DNA. Quando com o RNA, forma-se um híbrido RNA–DNA formado entre regiões complementares de cada uma das moléculas. O pareamento de bases segue o padrão descrito para o DNA: G pareia com C e A pareia com U (ou com um eventual T presente em alguns RNAs). Outra característica importante é que as duplas hélices formadas entre RNAs ou RNA e DNA são sempre antiparalelas, assim como no DNA. Note a orientação das fitas na Figura 3B. A formação do híbrido só é possível quando as moléculas apresentam regiões complementares (ou homólogas). As setas indicam os pares de bases A-U. 
As sequências complementares na molécula de RNA podem produzir estruturas ainda mais complexas. Uma região do RNA pode formar pares de bases com regiões complementares tanto de RNA como deDNA. Quando com o RNA, forma-se um híbrido RNA–DNA formado entre regiões complementares de cada uma das moléculas. O pareamento de bases segue o padrão descrito para o DNA: G pareia com C e A pareia com U (ou com um eventual T presente em alguns RNAs). Outra característica importante é que as duplas hélices formadas entre RNAs ou RNA e DNA são sempre antiparalelas, assim como no DNA. Note a orientação das fitas na Figura 3B. A formação do híbrido só é possível quando as moléculas apresentam regiões complementares (ou homólogas). As setas indicam os pares de bases A-U. 
A estrutura de dupla fita nas regiões que apresentam complementaridade de bases é uma dupla hélice voltada para a direita, como a da forma A do DNA. As quebras na hélice regular da forma A do RNA são causadas por bases mal emparelhadas ou desemparelhadas, e geram alças internas (internal loops, em inglês) e saliências (bulges, em inglês). As regiões helicoidais duplas no RNA são chamadas hastes e alças ou hairpin, do inglês. Essa última estrutura apresenta variações em relação ao comprimento da região com pareamento de bases e o tamanho e o número de alças não pareadas(Figura 4). 
Figura 4: Estruturas secundárias do RNA. (A) Saliência, alças internas, hastes e alças. (B) Hélice enrolada para a direita, forma A, associada a regiões de pareamento.
Muitos RNAs têm capacidade de formar estruturas helicoidais geradas por pareamentos de bases em uma grande extensão de sua cadeia. Observe a representação da estrutura secundária de um RNA, com destaque para o par não tradicional G•U (em cinza), as partes da molécula que estão ligadas por pontes de hidrogênio, chamadas hastes ou braços, e as partes em que essas interações não ocorrem, chamadas alças. Outros pareamentos também podem ocorrer entre diferentes regiões da molécula, resultando em uma estrutura tridimensional característica e certamente fundamental para a função desempenhada.
Figura 5: Estrutura secundária do RNA da enzima ribonuclease* P (RNase P) de Escherichia coli. Ribonuclease é a enzima que catalisa a hidrólise do RNA.
São reconhecidos três tipos de RNA; eles se diferenciam entre si na estrutura e na função. 
RNAs de transferência (tRNAs): encaminham os aminoácidos dispersos no citoplasma ao local onde ocorre a síntese das proteínas. 
RNAs ribossomais (rRNAs): fazem parte da estrutura dos ribossomos (organelas citoplasmáticas) onde ocorre a síntese de proteínas. 
RNAs Mensageiros (mRNAs): Transportam as informações do código genético do DNA para o citoplasma, ou seja, determinam a sequencia dos aminoácidos na construção das proteínas. 
Estrutura do RNA de transferência (tRNA) 
Aproximadamente 15% do total de RNA celular correspondem aos tRNAs. Para desempenhar seu papel na síntese de proteínas, eles precisam desempenhar duas funções: i) ativar os aminoácidos que serão transportados para os ribossomos e transferi-los para a cadeia polipeptídica nascente; ii) reconhecer a informação contida no mRNA, mais especificamente nos códons (sequencia de três nucleotídeos adjacentes em um ácido nucleico, que codifica um aminoácido específico) do mRNA, assegurando que o aminoácido correto seja incorporado à cadeia peptídica crescente. 
Sabe-se que cada tRNA pode transferir apenas um aminoácido. Entretanto, embora apenas 20 aminoácidos sejam utilizados na síntese proteica, a variedade de tRNAs na célula é grande, existindo pelo menos um tRNA específico para cada um dos aminoácidos incorporados numa cadeia polipeptídica. 
Os tRNAs são polirribonucleotídeos relativamente pequenos, apresentando entre 73 e 93 ribonucleotídeos, o que corresponde a uma faixa de peso molecular de 24.000 a 31.000. As sequencias de todas as moléculas de tRNA de inúmeros organismos – mais de 1.000 conhecidas até o momento – apresentam uma estrutura secundária comum semelhante a uma folha de trevo. 
Figura 6: Estrutura secundária geral dos tRNAs. Os círculos fechados representam os nucleotídeos comuns (derivados das bases A, C, G e T); as linhas entre eles representam pontes de hidrogênio, que caracterizam os pares de bases. As características e/ou resíduos invariantes estão representados em cinza. Note os quatro braços sempre presentes e um braço extra que não está presente em todos os tRNAs. 
Pu – qualquer purina; Pi – qualquer pirimidina; G* – guanosina ou 2’-O-metilguanosina; ψ – pseudouridina.
Dois braços de um tRNA são importantes para que a molécula possa desempenhar sua função: o braço do aminoácido, que se liga a um aminoácido específico, e o braço do anticódon, que contém uma sequencia complementar ao códon no mRNA, o que assegura a ordem dos aminoácidos na proteína, de acordo com a sequencia de bases no mRNA. Os outros dois ou três braços são importantes apenas para a conformação tridimensional das moléculas de tRNAs. 
Ao analisar a estrutura geral dos tRNAs, constatamos que alguns nucleotídeos não variam com o tipo de tRNA e a presença de vários nucleotídeos modificados, como os resíduos ψ – a letra grega psi – (pseudouridina), D (5,6-dihidrouridina), m1G (1-metilguanosina) e I (inosina), dentre outros. Uma peculiaridade interessante é que essas modificações são introduzidas após a síntese da molécula de tRNA. 
Agora que você já estudou as peculiaridades das moléculas de tRNA, incluindo a estrutura de folha de trevo (estrutura secundária), é importante que você conheça sua estrutura tridimensional. Essa estrutura foi escolhida para a imagem de abertura desta aula. Na próxima figura, você pode ver uma representação da estrutura tridimensional do tRNAPhe, proposta com base na análise de difração de raios-X. A estrutura se assemelha a um L torcido. Os dois braços importantes para que o tRNA desempenhe suas funções, os braços do aminoácido e do anticódon, estão arranjados de forma específica no espaço. Essa estrutura, que tem sido observada em todos os tRNAs estudados até o momento, é fundamental para as etapas de ativação de aminoácidos e de transferência de aminoácido para a cadeia peptídica nascente no ribossomo.
Figura 7: Estrutura tridimensional do tRNAPhe de levedura proposta a partir da análise de difração de raios-X. A) diagrama esquemático; B) modelo de preenchimento espacial.
ESTRUTURA DO RNA RIBOSSOMAL (rRNA) 
O rRNA representa cerca de 80% do RNA presente na célula. Estudos de dissociação dos ribossomos foram de extrema importância para entender sua estrutura, suas propriedades e seu papel na síntese de proteínas. A técnica de ultracentrifugação analítica, cujo princípio básico consiste na observação do movimento de moléculas em uma centrífuga, foi (e ainda é) muito empregada no monitoramento da dissociação e da reassociação dos ribossomos. Nessa técnica, o movimento de uma partícula, que nesse caso específico pode ser ribossomo, RNA ou proteína, é caracterizado pelo coeficiente de sedimentação expresso em unidades Svedberg (S), em homenagem a seu criador, Theodor Svedberg (1884 – 1971). A partir de agora, a unidade “S” será comumente empregada para designar os ribossomos de procariotos ou eucariotos, suas subunidades maior e menor e seus rRNAs constituintes. Os ribossomos de procariotos e eucariotos são sempre constituídos de duas subunidades de tamanhos diferentes. Cada subunidade é formada de uma a três moléculas de rRNA e inúmeras proteínas diferentes. 
Na bactéria Escherichia coli, a subunidade menor do ribossomo, também chamada subunidade 30S, é formada por uma molécula de rRNA 16S e 21 proteínas diferentes. A subunidade maior, conhecida por subunidade 50S, é constituída de duas moléculas de rRNA, os rRNAs 5S e 23S, e 36 proteínas, sendo 33 proteínas diferentes. A partícula inteira apresenta coeficiente de sedimentação de 70S. Repare que não basta simplesmente somar os valores de coeficiente de sedimentação das duas subunidades para determinar o coeficiente do ribossomo, o que comprova que o valor de S depende da forma da partícula. 
Vale mencionar que os rRNAs são metabolicamente estáveis; essa estabilidade é frutode sua associação com as proteínas ribossomais. 
Os ribossomos de uma célula eucariótica, não considerando aqueles presentes na mitocôndria e em cloroplasto, são maiores e mais complexos que os ribossomos bacterianos, apresentando coeficiente de sedimentação de 80S. Eles também têm duas subunidades que, apesar de poderem variar de tamanho entre as espécies, apresentam valores médios de coeficiente de sedimentação de 40S e 60S para as subunidades menores e maiores, respectivamente. A subunidade 40S contém uma subunidade 18S e a subunidade 60S é formada pelos rRNAs 5S, 5,8S e 28S. Em associação a esses rRNAs, encontram-se mais de 80 proteínas diferentes.
 
Figura 9: Comparação dos ribossomos procarióticos e eucarióticos. Estão representadas a subunidade menor (A) e a subunidade maior (B) com os dados relativos a cada uma delas. Mr é a massa molecular relativa.
Estrutura do RNA mensageiro (mRNA)
 
Dos três principais tipos de RNA, os mRNAs são os menos abundantes, representando, na maioria das células, entre 5 e 10% do RNA celular total. Os mRNAs são sintetizados utilizando a mensagem contida na sequencia de bases de porções específicas do genoma de um organismo. As sequencias de bases do mRNA, por sua vez, determinarão a ordem dos aminoácidos nas proteínas sintetizadas nos ribossomos. Os mRNAs eucarióticos são monocistrônicos, isto é, contêm informação para apenas uma cadeia polipeptídica. Em contrapartida, os mRNAs procarióticos são geralmente policistrônicos, ou seja, contêm informações para a síntese de mais de uma proteína.
É importante ressaltar que o fenótipo e o estado funcional de uma célula está diretamente relacionado ao seu conteúdo de mRNA. Assim, células que se multiplicam muito rapidamente necessitam de diferentes proteínas em curto intervalo de tempo. Para atender a essa exigência, é de se esperar que os mRNAs tenham um tempo de vida pequeno, sendo rapidamente degradados após participarem da síntese de proteínas, para que os ribonucleotídeos sejam reciclados e utilizados na síntese de moléculas de outros mRNAs. 
Os mRNAs apresentam muita variação no tamanho. Isso é fácil de ser entendido, pois eles codificam proteínas (determinam a sequencia de aminoácidos nas cadeias polipeptídicas) dos mais diversos tamanhos. Logo, é de se esperar que eles apresentem tamanhos heterogêneos. 
REPLICAÇÃO DO DNA
A replicação do DNA é semiconservativa, cada uma das fitas serve como molde para a construção de uma nova molécula. Esse processo permite que a informação genética (sequencia de nucleotídeos) seja copiada de modo extremamente simples e eficiente.
	Em condições normais a dupla hélice de DNA é muito estável, por exemplo, apenas em temperaturas muito altas (próximas a 1000 C) as pontes de hidrogênio são desfeitas e as fitas complementares se separam. Porém, a transferência de informação genética, seja através de replicação (transferência de informação de uma molécula de DNA para outra) ou de transcrição (transferência de informação de uma molécula de DNA para uma molécula de RNA) depende da separação das fitas complementares. É necessário que a dupla hélice seja desfeita, que as bases sejam expostas para formação da nova fita complementar. As cadeias de DNA separadas (em fita simples) constituem as fitas moldes para o processo de replicação. 
A replicação ou duplicação do DNA é um processo complexo, realizado por um conjunto de proteínas que recebe o nome de maquinaria ou máquina de replicação. 
	A replicação do DNA só ocorre porque “proteínas iniciadoras” sintetizadas no momento adequado (fim de G1) se ligam a sítios específicos do DNA, denominados de origens de replicação. A ligação das proteínas iniciadoras nas origens de replicação promove a separação das duas fitas do DNA, expondo um pequeno número de bases sem pareamento
As origens de replicação são formadas por sequencias de nucleotídeos especiais – em leveduras, por exemplo, são conjuntos de aproximadamente 100 pares de bases (pb), ricos em bases AT (mais fáceis de serem separadas). O número de origens de replicação é variável, dependendo da espécie ou do grupo de organismos. 
O genoma das bactérias tem uma organização bem simples, sendo constituído por uma única molécula de DNA circular maior (o cromossomo bacteriano) e pequenos círculos de DNA (os plasmídeos), cada um desses elementos contém apenas uma origem de replicação.
	
Para os cromossomos eucariontes, formados por longas moléculas de DNA linear, existem várias origens de replicação, o que permite que a duplicação do DNA se inicie simultaneamente em vários locais dos cromossomos, tornando o processo mais rápido. Estima-se que o genoma humano, formado por um conjunto de 23 moléculas de DNA (células n), tenha aproximadamente 10.000 origens de replicação. 
A partir de cada origem de replicação formam-se duas forquilhas que permitem a replicação bidirecional. 
As proteínas que participam da replicação afastam progressivamente as fitas de DNA, a partir do espaço criado na origem de replicação. Assim, a extensão de fita molde vai se ampliando e permitindo a entrada de nucleotídeos complementares que se orientam espontaneamente no sentido antiparalelo ao da fita molde (Figura 21). A velocidade de deslocamento das forquilhas é grande, no DNA humano estima-se que seja de 100 pb/segundo e em bactérias é dez vezes mais rápido.
	
Para que a replicação ocorra, a DNA polimerase deve se associar á fita molde do DNA e se deslocar sobre ela, realizando as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos livres que parearam com as bases da fita molde. 
	A DNA polimerase sempre faz a ligação de um novo nucleotídeo a partir da extremidade 3’- OH livre do último nucleotídeo, por isso, costuma-se dizer que a fita nova do DNA “cresce” da extremidade 5’ para a extremidade 3’ e que a DNA polimerase se “desloca” na fita nova de 5’para 3’.
Cada uma das fitas da dupla hélice tem sua polaridade definida pelo modo como as pentoses estão posicionadas - enquanto uma fita tem orientação 5’-3’a outra têm orientação 3’-5’. A mesma orientação antiparalela é mantida na fita nova que se forma durante a replicação do DNA. Assim, apenas uma das fitas novas terá a extremidade 3’-OH livre voltada para a direção em que a forquilha de replicação se move. Como a DNA polimerase só pode adicionar novos nucleotídeos em uma extremidade 3’-OH livre, uma das fitas novas crescerá acompanhando a forquilha de replicação e a outra será produzida em direção oposta ao do deslocamento da forquilha. 
A fita nova com a extremidade 3’-OH livre voltada para a direção oposta ao deslocamento da forquilha de replicação terá crescimento descontínuo, será produzida aos poucos, em pequenos pedaços denominados fragmentos de Okazaki.
Nessa fita, a DNA polimerase se ligará á fita molde e se deslocará em sentido oposto ao da abertura da forquilha, sendo necessário que periodicamente abandone a fita molde, retorne á forquilha de replicação e novamente se ligue à fita molde, sintetizando um novo trecho de DNA. A velocidade de replicação da fita com extremidade 3’-OH livre voltada “para fora” da forquilha é menor e por isso ela TAMBÉM é denominada de fita retardatária. A outra fita, que tem extremidade 3’-OH livre voltada “para dentro” da forquilha, é denominada de fita líder. Os pareamentos entre as bases A-T e C-G são ditos obrigatórios, embora esses sejam apenas os pareamentos mais estáveis que se pode obter entre purinas e pirimidinas. Eventualmente, outros tipos de pareamentos podem se formar, por exemplo, pares G-T, G-A ou U-G. Esses pares são bem menos estáveis, mas que se não fossem detectados como “erros” de pareamento causariam grandes alterações na informação genética transmitida de uma célula para outra. 
	A DNA polimerase tem atividade revisora, ou seja, é capaz de verificar se os nucleotídeos da fita nova estão corretamente pareados com a fita molde. A atividade revisora (ou mecanismo de revisão, verificação ou proofreading) permite que antes de realizar adiçãode um novo nucleotídeo, a DNA polimerase verifique se o último nucleotídeo que foi ligado á fita de DNA nascente está corretamente pareado com a fita molde. 
	Se o pareamento estiver incorreto, a DNA polimerase desfaz a ligação fosfodiéster e o nucleotídeo mal pareado é desligado da cadeia de DNA em formação. A capacidade de remover nucleotídeos da extremidade da fita de DNA nascente corresponde à atividade de nuclease da DNA polimerase. Essa enzima, portanto é capaz de realizar duas atividades bem diferentes: realiza polimerização de nucleotídeos no sentido 5’-3’ e degrada a fita de DNA (remove nucleotídeos) no sentido 3’-5’ .
A atividade de revisão que a DNA polimerase executa antes da adição de um novo nucleotídeo é obrigatória. Se não existir ligação para revisar, a DNA polimerase também não pode fazer polimerização. É necessário que exista sempre alguns nucleotídeos já ligados entre si e pareados com a fita molde, para que e DNA polimerase possa atuar. Esse pequeno trecho de fita nova, pareada com a fita molde, fornece a extremidade 3’-OH livre, para que a DNA polimerase possa adicionar o próximo nucleotídeo. 
	A DNA polimerase não faz síntese de novo, porque necessita de um pequeno fragmento que forneça a extremidade 3’-OH livre para iniciar sua atividade. Isso significa dizer que a DNA polimerase não pode iniciar a construção da nova fita de DNA, ligando entre si os dois primeiros nucleotídeos. 
	O pequeno segmento de fita nova que permite a ação da DNA polimerase recebe o nome de primer ou sequencia iniciadora. Essa sequencia de nucleotídeos fornece os pareamentos necessários para a atividade de revisão da DNA polimerase e a extremidade 3’-OH livre para a polimerização. 
	Como nenhuma DNA polimerase faz síntese de novo, a enzima que faz a ligação entre os primeiros nucleotídeos que iniciam a síntese de uma nova fita de DNA (primer) pertence à outra classe. Essa enzima, denominada de primase, é classificada como RNA polimerase, pois utiliza como substrato ribonucleotídeos. Na verdade, cada nova fita de DNA é iniciada por um pequeno trecho de RNA, aproximadamente 10 ribonucleotídeos ligados entre si e complementares á fita molde de DNA.
	Para a fita líder (fita nova que “cresce” acompanhando o deslocamento da forquilha de replicação) é necessário apenas um primer na origem de replicação. A DNA polimerase se liga á extremidade 3’-OH livre dessa sequencia de ribonucleotídeos e passa a fazer as ligações entre os desoxirribonucleotídeos complementares a fita molde, acompanhando a abertura da forquilha de replicação. 
	Na fita retardatária ou descontínua, é necessário que, periodicamente, a primase adicione um novo primer. A partir de cada primer é construído um fragmento de fita nova de DNA, mas como o deslocamento da DNA polimerase é no sentido contrário ao da abertura da forquilha de replicação, logo a enzima não encontra mais fita molde disponível e abandona o DNA. Para produzir uma fita nova complementar a fita molde que foi recém exposta pelo deslocamento da forquilha, é preciso ocorrer a adição de um novo primer. Os fragmentos de DNA que compõem a fita de DNA com replicação descontínua são chamados de Fragmentos de OKazaki. 
	A fita com replicação descontínua é transformada em uma fita de DNA completa, sem interrupções e sem ribonucleotídeos através da atividade de outras três enzimas. A remoção do primer é feita por uma nuclease (enzima que destrói ácidos nucléicos, removendo nucleotídeos) e uma D
Na polimerase especial, denominada de polimerase de reparo, faz a ligação entre os dessoxirribonucleotídeos complementares á região antes ocupada pelo primer. Finalmente, a DNA-ligase faz a união entre a extremidade 5’de um fragmento e a e extremidade 3’do outro, eliminando as interrupções que existiam na fita retardatária.
	A primase, como toda RNA polimerase, não possui atividade revisora e os primers podem conter vários erros de pareamento, isso, porém não constitui fonte de mutações uma vez que todos os primers são removidos e substituídos. As ligações entre os novos nucleotídeos que substituem o primer são feitas pela DNA polimerases que atuam no reparo de DNA e que possuem atividade revisora. 	A abertura da dupla hélice depende da atividade de enzimas denominadas DNA-helicases, que catalisam o desenrolamento do DNA (Figura 30) 
A deficiência de atividade de DNA-Helicase durante muito tempo foi  associada a um distúrbio  raro conhecido como Síndrome de Hutchinson-Gilford (Figura 31). O envelhecimento precoce é sem dúvida a característica mais notável dessa síndrome. A hipótese era que o mau funcionamento da helicase seria responsável por renovação deficiente dos tecidos. Em 2002, finalmente foi identificado o gene relacionado a esse distúrbio e não é um gene para helicase. A hipótese original não foi confirmada. A proteína associada e esse tipo de progeria pertencem à família das lamininas e se localiza na membrana nuclear.
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As fitas simples que são produzidas pela passagem da helicase rapidamente tornariam a se associar se não fosse a presença de proteínas que se ligam á fita simples. São essas proteínas, denominadas de SSB (single-strand DNA-binding proteins), que evitam a formação de pontes de hidrogênio entre as bases das fitas molde (Figura 32). 
	Também participa da replicação uma proteína, denominada de grampo deslizante que forma um anel em torno da fita molde e faz com que a DNA polimerase fique firmemente associada ao DNA molde (Figura 33). Na fita com replicação descontínua, o grampo deslizante libera a DNa polimerase, cada vez que chega em um fragmento já pronto.
	A frente da forquilha de replicação de deslocam as girases, enzimas classificadas como topoisomerases, que reconhecem as regiões em que a dupla hélice do DNA está apresentando “maior torção”. É necessário lembrar que a ação da helicase, ao abrir a dupla hélice de DNA, faz com que as “voltas” removidas da região aberta sejam transferidas “para frente”. 
	(Situação semelhante pode ser observada quando tentamos separar um fio de lã afastando os fios menores. Se o fio tiver apenas alguns centímetros e possuir extremidades livres, a separação fará com que as extremidades girem. Se o fio for muito longo, a abertura provocara a formação de dobramentos nas regiões á frente da abertura).
Fluxo da informação genética: transcrição e tradução
O DNA é o depósito de toda a informação genética estável nos procariotos e eucariotos. Nos genomas dos seres vivos, sejam eles organizados na forma circular (comum aos procariotos) ou linear (como nos eucariotos, formando cromossomos), toda a informação genética necessária ao organismo para enfrentar uma gama imensa de condições ambientais distintas está estocada no DNA. Se pensarmos nos metazoários, todo o programa para a formação e desenvolvimento do embrião, com as complexas relações espaciais e temporais entre as células formadoras de um indivíduo, tudo isto está "escrito" no DNA. Mas, a qualquer momento, uma célula emprega apenas uma fração consideravelmente reduzida de toda esta informação genética. A forma com que esta informação é selecionada será discutida no próximo item. Procuraremos aqui focalizar nossa atenção na produção dos intermediários da informação gênica, as moléculas de RNA, e no produto final da expressão de um gene, a proteína.
As moléculas de RNA existentes na células são todas sintetizadas a partir da transcrição de trechos do DNA (genômico, mitocondrial ou de cloroplasto) e têm uma estrutura geral mostrada na figura a seguir. Devemos ter em mente que, mais uma vez, o pareamento de bases é determinante na síntese da nova fita de RNA: a adenina do DNA pareia com uma uracila no RNA, a timina com a adenina e a guanina e a citosina com a citosina e a guanina, como na fita dupla de DNA.
 Modelo plano da molécula de RNA. Há, como no DNA, a tendência ao pareamento entre as bases, o que gera grampos na estrutura do RNA. Assim, na natureza, os RNAs apresentam-se muito dobrados e com muitos trechos emfita dupla.
 
Podemos agrupar a maior parte dos RNAs em três grandes grupos: a) os RNA mensageiros ou mRNAs, que serão lidos pelos ribossomos e que trazem, assim a informação genética para a síntese de proteínas; b) os RNA ribossomais ou rRNA, que, junto com mais de 3 dezenas de diferentes proteínas, formam os ribossomos. Cada ribossomo é composto de duas sub-unidades diferentes. Na menor há um rRNA e na maior dois. Estas sub-unidades estão separadas no citossol e só se unem para a síntese protéica, como veremos mais adiante; c) os RNA transportadores, ou tRNAs, que são "carregados" com aminoácidos de uma forma extraordinariamente precisa pela enzima aminoacil-tRNA sintase. Os tRNAs têm a função de trazer ao ribossomo o aminoácido requerido pelo códon apresentado pelo mRNA na cavidade A da sub-unidade maior do ribossomo. Veremos este mecanismo com mais detalhe no sub-item dedicado à síntese proteica. 
 
A transcrição
Qual a diferença fundamental entre a transcrição e a tradução? Uma analogia pode nos esclarecer isto. Imagine a palavra PTERIGON. O que poderia significar isto? Os caracteres são obviamente escritos num alfabeto que não é o nosso. Contudo, e usando regras muito simples, podemos transcrever a palavra para nosso alfabeto. Basta lembrar que a primeira letra é a letra grega maiúscula pi, que equivale a um p, a quarta letra é um rô maiúsculo, equivalente a um r, e assim por diante. A palavra escrita no alfabeto cirílico aparece como PTÉRIGON em nosso alfabeto. Muito bem, e daí? O que significa afinal Ptérigon? Para compreendermos o significado da palavra, mesmo após a transcrição, precisamos de um mecanismo muito mais sofisticado: a tradução. O significado é aproximadamente asa. Da mesma forma, o processo de transcrição se limita a reproduzir em RNA o que está escrito em DNA, o que não apresenta maiores dificuldades: as bases A, T, G e C da fita molde de DNA comandam o pareamento de U, A, C e G na fita recém sintetizada de RNA. 
A enzima que sintetiza RNA é a RNA polimerase. Nos procariotos parece haver apenas uma RNA pol, mas nos eucariotos elas são distintas, especializadas na síntese de cada um dos grupos de RNAs. Focalizemos nossa atenção no modelo procarioto, pois até o momento as técnicas da engenharia genética que empregam a RNA pol baseiam-se mais neste grupo de organismos. A RNA polimerase precisa iniciar a síntese de um novo RNA precisamente em um determinado local. Analogamente, se pedíssemos que o leitor transcrevesse com letra de mão o segundo parágrafo do capítulo II de um certo livro, o leitor deveria identificar o capítulo e saber como se caracteriza um parágrafo para iniciar seu trabalho. A nível molecular este processo é feito pela identificação pela RNA pol de uma sequência de bases do DNA conhecida como promotor. 
A RNA pol não precisa "abrir" o DNA para ler as sequências de bases. Ela procura a sequência característica do promotor deslizando sobre o DNA e procurando a sequência através da fenda maior da dupla hélice. Seria como se procurássemos identificar um grupo de amigos olhando-os pelas costas ou pelo lado. Afinal, não é tão difícil, principalmente se pensarmos que só há 4 "amigos": A, T, G e C. A figura a seguir mostra as diferenças entre "perfis" ou "lados" dos pareamentos AT e GC.
Como os pares de bases no DNA podem ser reconhecidos pelos seus perfis, sem necessidade de se abrir a dupla hélice. Na figura estão mostrados 2 pares vistos num sentido ao longo da molécula de DNA. No outro sentido as imagens são especulares para os pares CG e TA.
Para o reconhecimento do promotor a RNA polimerase utiliza a sub-unidade sigma (s). A enzima é formada de 6 sub-unidades: 2 sub-unidades a, uma b e uma b’, uma w e a sub-unidade s. A sub-unidade s não se liga fortemente às demais, que formam um núcleo enzimaticamente ativo a2b’bw. Assim que a RNA pol se liga ao promotor, a sub-unidade s se desliga do núcleo enzimático, que prossegue na síntese do RNA até alcançar um terminador (ver adiante). Mas afinal, como é este promotor? 
Como quase tudo na natureza, o promotor não é único. Existe, sim, um consenso em torno de sua sequência. Se tomarmos a primeira base transcrita em RNA como a base +1, a sequência de consenso de um promotor da bactéria Escherichia coli (o fusquinha da genética de microrganismos) será como mostrado na figura a seguir. A redução da afinidade e, portanto, da frequência com que um promotor é ligado e o gene é transcrito pela RNApol, está diretamente associada à homologia com a sequência de consenso. É através da variação das sequências nas duas caixas (conhecidas como caixa TATA, ou caixa de Pribnow, e caixa -35) que é modulada a transcrição relativa dos genes constitutivos (aqueles que são expressos o tempo todo durante a vida da célula). Um gene cujo produto deva ser abundante tem um promotor com sequência mais próxima ao consenso, enquanto que um gene cujo produto deva ser raro na célula tem, em geral, um promotor com as sequências das duas caixas bastante divergentes do consenso. Alterações fora das caixas são menos importantes, desde que não diminuam a distância entre elas.
Diagrama representativo de um promotor genérico de E. coli. As caixas -35 e -10 (também chamada caixa de Pribnow ou caixa TATA) são muito conservadas entre distintos promotores. Pequenas variações nestas sequências podem reduzir drasticamente a afinidade do fator sigma da RNA pol pelo promotor. A base +1 é, por convenção, aquela onde se inicia a transcrição. A RNA pol, uma vez acoplada ao promotor, ocupa cerca de 5 voltas do DNA.
Para reforçar a ideia do que seja o consenso de uma sequência, imagine a palavra PRESIDENTE. Escrita desta forma consensual (ou seja, aceita como correta por todos os alfabetizados da língua portuguesa), seria sempre associada ao conceito Presidente. Entretanto, se trocássemos alguma letra, por exemplo, o S por Z, a grafia errônea PREZIDENTE não faria com que o sentido se perdesse, ao menos na maior parte dos casos (um purista poderia argumentar que o redator não queria dizer Presidente). Se alterássemos a grafia de forma mais drástica, por exemplo, para PRESIDEMTI, poderíamos, ao menos em alguns casos, reconhecer a ideia presidente na palavra. Podemos afirmar que as alterações discutidas enfraquecem (ou corrompem) progressivamente o conteúdo informacional da palavra. Entretanto, basta uma pequena mudança (do S para V), e a grafia PREVIDENTE perderia completamente su associação com o conceito Presidente. Da mesma forma, no caso dos promotores bacterianos, a troca de algumas bases nas caixas de consenso pode enfraquecer o promotor, fazendo com que a afinidade do fator s por ele seja consideravelmente reduzida.  Também no caso dos promotores, a troca de certas bases por outras elimina completamente a função promotora da estrutura. Assim, algumas das bases são 100% conservadas, dentro das duas caixas de consenso.
Embora se tenha mais liberdade em alterar a sequência da região promotora fora das caixas de consenso, não podemos retirar nem acrescentar bases entre as caixas, porque a distância entre elas (aproximadamente duas voltas de DNA ou 20 pares de bases) deve ser mantida. Chegamos, então, a um importante conceito na biologia molecular: distância também é informação. O fator s deve reconhecer as duas caixas de consenso (primeiro a TATA e depois a -35) e para tal elas devem estar a uma determinada distância entre si. Uma redução desta distância (ou um aumento) seria equivalente a um alargamento ou estreitamento de um par de trilhos de trem: os vagões não poderiam mais caminhar sobre eles, porque a distância entre as rodas (os sítios de reconhecimento das caixas de consenso no fator s) é fixa, determinada pela estrutura do eixo de rodas (ou da molécula, no caso do s).
Este tipo de arranjo particular da estrutura do promotor permite que, com apenas um par de 6 bases (cada caixa consenso tem em geral uma dúzia de bases) um promotor seja determinado com imensa precisão. O que queremos dizer com isto? Podemos formulara questão de outra forma: qual a probabilidade de uma sequência de 6 bases ocorrer ao acaso no DNA? Para cada base a probabilidade de ser um T, digamos, é 1/4, pois podemos ter T, A, G ou C. O mesmo se aplica para as demais bases da sequência, portanto, a probabilidade de se ter a sequência TAATTA, por exemplo, ao acaso, é 1/4x1/4x1/4x1/4x1/4x1/4= (1/4)6 ou, aproximadamente, 1/4000. Não é uma probabilidade muito pequena, considerando que há de 2 a 10 milhões de bases num genoma procarioto. Mas, se considerarmos que há uma segunda caixa, a probabilidade conjunta das duas terem as sequências esperadas é (1/4)6x(1/4)6 = (1/4)12 ou, aproximadamente, 1/16 milhões. Neste caso, o encontro de uma tal sequência não pode ser fortuito! Além disso, a distância entre elas deve ser de aproximadamente 20 bases, e a caixa TATA deve estar abaixo (3') da caixa -35. Estas duas outras restrições fazem com que um par de caixas com estas características seja, fatalmente, um promotor.
Finalmente, podemos agora claramente perceber que a Natureza desenvolveu um sistema extremamente preciso para determinar o início da transcrição, dando-lhe, contudo, flexibilidade para criar promotores fracos (para genes cuja expressão não deva ser muito grande) e promotores fortes (para genes cujo produto seja necessário em grandes quantidades).
A Natureza também usa o recurso de troca de fatores s para orquestrar o silenciamento e a ativação de grupos de genes. Um exemplo disso é a troca do fator s70, que é a sub-unidade normalmente empregada pela E. coli a 37oC, pelo fator s28, após um choque térmico (elevação da temperatura de cultivo para 42oC ou mais). Quando a bactéria é submetida a um choque térmico, a partir de um promotor reconhecido pelo fator sigma normal (o s70 ), o mRNA para uma nova proteína, o fator  s28, é sintetizado. À medida em que aumenta a concentração deste novo fator no citosol bacteriano, ele vai substituindo o velho sigma, pois tem maior afinidade pelo núcleo enzimático da RNA polimerase. Em pouco tempo todas as RNA polimerases têm este novo sigma associado a elas e só reconhecem promotores de choque térmico, que comandam a síntese de mRNAs para as cahamadas HSPs ou proteínas de choque térmico. O promotor de choque térmico também tem duas caixas de consenso, mas as sequências são um pouco diferentes das de um promotor normal, e mais distantes entre si. 
A substituição por competição do fator s normal por um fator s viral é uma das estratégias adotadas por vírus bacterianos para controlar a maquinaria biossintética da célula hospedeira. A substituição sequencial de fatores s por microrganismos que formam cistos ou esporos é também uma forma elegante de orquestrar a ativação sequencial de muitos genes.
Uma vez iniciada a transcrição, o fator sigma se separa das demais subunidades, que seguem na tarefa de polimerizar o novo RNA, até que alcancem um trecho no DNA que sinaliza o fim da transcrição. Como se dá esta sinalização? Em princípio somos tentados a imaginar um sistema semelhante ao do promotor: a polimerase reconheceria uma região terminadora e se desacoplaria do DNA. Entretanto, não é isto que ocorre: de fato, há uma região terminadora, mas a RNA polimerase a transcreve em RNA e é este transcrito que, formando uma estrutura muito especial chamada grampo de terminação, sinaliza à RNA pol que ela deve parar a síntese de RNA. A análise de muitas dezenas de regiões terminadoras mostrou que sua sequência apresenta características comuns, que podem ser resumidas da seguinte forma: na fita de DNA que está servindo de molde para a síntese do RNA surge uma sequência com cerca de 8 bases que, após um espaçador de tamanho variável (4 a 15 bases, em geral), é seguida de outra sequência complementar a ela, porém em sentido contrário; logo após esta região simétrica há uma sequência longa de Timinas (um poliT), na fita 5’-3’. Quando a polimerase transcreve esta região, o RNA formado vai tender a parear as duas regiões homólogas, restando uma cauda poliU. Esta estrutura, conhecida como grampo de terminação, sinaliza para a polimerase que ela deve terminar a síntese de RNA. 
Sinais de início e término da síntese de RNA pela RNA polimerase bacteriana. O sinal de início é o promotor, reconhecido pelo fator sigma. O sinal de término é reconhecido a posteriori (isto é, pela estrutura formada no RNA), e tem, no DNA, uma simetria diádica, seguida de um poli-T.
Através destes dois sistemas a bactéria determina onde começa e onde termina a síntese de um RNA, da mesma forma que sabemos onde se inicia e onde termina um parágrafo num texto qualquer. O que determina que parágrafo deve ser lido, e quantas vezes deveremos repetir a leitura é assunto do ítem sobre controle da expressão gênica.
Nos eucariotos os promotores são muitas vezes bem mais complexos do que esboçado aqui para E. coli. É comum que somente a caixa TATA seja identificada. Sequências auxiliares, que comandam a expressão, podem estar próximas à posição +1, mas também podem estar distantes centenas ou mesmo milhares de pares de bases. Estas sequências, conhecidas como "enhancers" ou estimuladores, são raramente encontrados em procariotos.  
O controle da transcrição em eucariotos é um assunto ainda em franco desenvolvimento, mas já está claro que há enormes diferenças nos sistemas de controle. Mesmo em procariotos pode haver um sistema semelhante ao ativador, como mostrado na figura abaixo, mas é muito menos comum que nos eucariotos.
(A) Ativação gênica à distância: NtrC é uma proteína reguladora de gene bacteriana e atua como um enhancer. A ativação requer mudança conformacional do DNA e a hidrólise de ATP. Embora rara em procariotos, esta forma de ativação é a regra em eucariotos. (B) Agrupamento dos fatores de transcrição (TF) gerais necessários ao início da transcrição de um gene eucarioto pela RNA polimerase II.
 
A tradução
Afinal, qual é o destino dos RNAs na bactéria? A verdade é que a vida média de um mRNA bacteriano é muito curta, raramente ultrapassando 60 segundos. Por que? Temos que ter em mente que a “vida" de uma E. coli dura meia hora. Neste intervalo ela passa por profundas transformações metabólicas. Por isso, um mRNA só é necessário por breves instantes, sendo em seguida descartado. Em eucariotos, contudo, os mRNA podem ter vida média muito mais longa. Os demais RNAs também tem uma vida média curta, porém bem maior que a dos mRNA pois são necessários de uma forma mais homogênea ao longo do ciclo de vida da bactéria. O “turn over” (substituição de uma molécula por outra mais nova) é um fenômeno geral e está relacionado com a instabilidade termodinâmica de qualquer estrutura a nível molecular.   
No caso dos mRNA de procariotos, a sua degradação é controlada por um processo engenhoso. A transcrição e a tradução estão de tal forma acopladas que, imediatamente após a síntese de um pequeno trecho de mRNA, os ribossomos já se ligam a este RNA nascente, protegendo-o da degradação pelas RNases bacterianas. O acoplamento da transcrição com a tradução é uma característica dos procariotos. Nos eucariotos o transcrito primário do DNA que dará origem a um mRNA é feito no núcleo, enquanto o mRNA e traduzido no citoplasma (recentemente um grupo de pesquisadores mostrou que pode haver tradução no núcleo( Iborra et al., Science 293:1139, 2001). A figura a seguir mostra o acoplamento da transcrição e da tradução. 
Representação esquemática do acoplamento entre a transcrição e a tradução em procariotos.
 
O processo de tradução se inicia pela ligação da sub-unidade menor do ribossoma a um sítio (sequência) específica no mRNA chamado RBS (ribosome binding site). Esta ligação é mediada, provavelmente, pelo pareamento de uma sequência do rRNA 16 S (que faz parte da composição da sub-unidade leve) com a sequência de Shine-Delgarno (ou RBS). À sub-unidade menor acopla-se, então, o primeiro tRNA (sempre para formil-metionina, em E. coli), e o conjunto desliza pelo mRNA até encontrar o códon AUG (identificado pelo anticódoncorrespondente no tRNA). Mais uma vez, é necessário um ajuste preciso da posição de início da leitura do mRNA pelo ribossoma. Para cada mRNA existem potencialmente três diferentes quadros de leitura (já que as bases são lidas em trincas), porém só um quadro de leitura é correto. Pode parecer estranho que uma sub-unidade aberta (sem o acoplamento prévio da outra), junto com um tRNA para formil-metionina, seja necessária para encontrar o códon de início da síntese proteica. Mas, se ponderarmos sobre a questão, veremos que o tRNA sozinho não poderia se ligar ao códon de iniciação, pois ele apenas reconhece um códon AUG (ou GUG) e desta forma se ligaria a qualquer uma destas trincas, em qualquer quadro de leitura, ao longo do mRNA. A sub-unidade leve, por sua vez, não tem como reconhecer o códon AUG, mas "sabe" onde é a sequência RBS e determina, assim, que a primeira trinca AUG abaixo de seu sítio de ligação será o início da síntese protéica. Então, fica claro que a associação das duas moléculas, tRNA e sub-unidade leve do ribossoma, é imprescindível.
Ao conjunto sub-unidade menor/ tRNA, já na posição exata para início da síntese proteica, liga-se, então, a sub-unidade maior, completando o ribossoma. O ribossoma tem formada, assim, uma cavidade P (à esquerda, no desenho), onde está o tRNA com a formil-metionina, e uma cavidade A, ainda vazia, a sua direita, aguardando a chegada do próximo tRNA transportando o aminoácido correspondente ao códon apresentado no fundo da cavidade. Quando isto acontece uma reação química (ligação peptídica) ocorre entre o primeiro aminoácido e o segundo, transferindo desta forma o primeiro para se ligar ao segundo, que permanece pelo seu lado ligado ao seu tRNA. O primeiro tRNA, agora ocupando a cavidade P do ribossomo, está descarregado. O ribossomo então desloca-se no mesmo sentido que já vinha fazendo, descartando assim o tRNA vazio (provisoriamente alojado numa cavidade E, que significa exit), posicionando o segundo tRNA com os dois aminoácidos a ele aderidos na cavidade P e liberando a cavidade A para receber um novo tRNA carregado. O processo se repete até que um sinal de terminação seja encontrado. Neste caso o ribossoma espera não um tRNA mas uma proteína conhecida como fator de terminação, que se liga no sítio A ao códon de terminação, desestabiliza o ribossomo e interrompe irreversivelmente a síntese. Há vários fatores proteicos chamados fatores de iniciação e fatores de alongamento que colaboram neste processo. Como as técnicas em genética molecular raramente lançam mão da síntese proteica in vitro, não nos deteremos mais neste assunto. O leitor é convidado a consultar os livros-texto sugeridos ou qualquer outro bom livro que trate do assunto a nível molecular (Bioquímica, Lehninger; p. ex.). A figura a seguir ilustra o mecanismo de síntese proteica em procariotos.
Neste modelo do processo de tradução há um sítio E ( “empty” = vazio), onde se aloja o tRNA descarregado antes de sair do ribossomo.Estão representados os diversos fatores que participam do processo de tradução, além do ribossoma e dos tRNAs. Para uma descrição do processo, cf. texto acima.
 
         Novamente, em eucariotos a complexidade do processo de transcrição/ tradução é consideravelmente maior. Isto se dá por duas razões: primeiro, os genes eucariotos costumam ser interrompidos por sequências que não codificam aminoácidos. Estas sequências, chamadas introns, e as sequências que serão empregadas pelo ribossoma (ou para formar tRNA ou rRNA) são transcritas para um longo RNA, chamado transcrito primário, ou ainda RNA heterogêneo nuclear. Deste transcrito primário têm que ser retirados os introns, o que é feito por um processo enzimático chamado “splicing”. Além disso, o pré-mRNA ainda sofre outras alterações, como a adição de uma cauda poliA na extremidade 3´ e de um “cap" 7-metil-guanosina na extremidade 5´ antes de se tornar um mRNA e poder passar ao citoplasma, onde será traduzido.
O splicing de RNA é catalisado pelo spliceossomo, formado pelas snRNP (pequenas ribonucleoproteinas nucleares) U1, U2, U5 e U4/U6, além de outros componentes, não representados na figura. Na primeira etapa do slicing o nucleotídeo ramificado A, próximo ao sítio de splicing 3’, ataca o sítio 5’ de splicing e corta o RNA.  A extremidade 5’ resultante fica ligada covalentemente ao A. Na segunda etapa, a extremidade 3’ do exon da esquerda, deixada livre na etapa anterior, ataca o sítio de splicing 3’ do intron, clivando o lariat (laço) e unindo os dois exons. 
 
         O mecanismo de splicing mostrado acima é essencialmente igual para todos os mRNAs eucariotos que contenham um intron.  A figura a seguir mostra a forma com que o transcrito primário do gene para a ovalbumina de galinha é processado para gerar um mRNA maduro; 
A figura mostra a remoção organizada de 7 introns necessários para a obtenção do mRNA de ovalbumina maduro, a partir do transcrito primário. Os sítios de splicing nas posições 5’ e 3’ estão representados pelas letras D e A (doador e aceptor, respectivamente).
    O splicing de tRNAs e de rRNAs pode ser feito sem a participação do spliceossomo. De fato, é o próprio RNA que se auto processa, numa reação conhecida como self splicing. Esta atividade enzimática do RNA contraria a antiga assertiva da bioquímica que diz “toda enzima é uma proteína”.
TABELA DOS AMINOÁCIDOS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTS, B. Fundamentos de biologia celular: uma introdução a biologia molecular da célula. Porto Alegre: Artmed, 2006
http://www.ufpe.br/biolmol/aula3_RNAtranscri.htm