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Provas bioquímicas para identificação de bacilos gram-negativos Esta aula tem como objetivo a identificação de enterobactérias em gêneros ou espécies, através da utilização de meios de cultura especiais que possibilitam a verificação da presença de enzimas bacterianas relacionadas ao metabolismo de vários substratos. As alterações nos meios produzidas pelo metabolismo bacteriano servirão de base para sua identificação de acordo com o esquema a seguir: PLAQUEAMENTO SELETIVO É a etapa de isolamento bacteriano a partir do espécime clínico, utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. A presença dos corantes eosina amarela e azul de metileno inibem as bactérias Gram positivas. Ao prepararmos este meio, a eosina e o azul de metileno reagem e formam o eosinato de azul de metileno (sal). As bactérias Gram negativas que fermentam lactose (LAC+) e, consequentemente, produzem ácidos que dissociam este sal, apresentando-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem um centro negro, devido ao azul de metileno, enquanto as não fermentadoras (LAC-) formam colônias transparentes. CONFIRMAÇÃO BIOQUÍMICA É um conjunto de provas bioquímicas necessárias para a identificação das colônias suspeitas. Serão utilizados os meios abaixo. Estes meios totalizam oito testes que somados ao da fermentação da lactose permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactérias isoladas em espécimens clínicos. Meio EPM O meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás a partir de glicose, produção de H2S, hidrólise da uréia e desaminação de triptofano. B) Meio MILi O Meio MILi contém os testes de motilidade, indol e descarboxilação de lisina. C) Citrato de Simons Este teste permite identificar espécies que utilizam citrato como única fonte de carbono. 2.1) Fundamento teórico: Hídrólise da uréia: Este teste verifica a habilidade de um microrganismo em utilizar a uréia, formando duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease (uréia ( 2 NH3 + CO2 + H2O). Motilidade: O teste visa verificar se a bactéria é móvel ou imóvel. Logo pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros como por exemplo Enterobacter (usualmente +) e Klebsiella (-). A mobilidade das bactérias é proporcionada pela presença de um ou mais flagelos. As bactérias imóveis não possuem flagelos. Produção de indol: Este teste tem como princípio determinar a habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da molécula de triptofano. Pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros de bactérias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do grupo Klebsiella-Enterobacter (-). Citrato de Simmons: Este teste visa determinar se um microrganismo é capaz de utilizar citrato como uma única fonte de carbono para o seu metabolismo, resultando em uma alcalinidade no meio. As bactérias citrato positivas crescem usando sais de amônia como fonte de nitrogênio, liberando amônia e conseqüentemente deixando o meio alcalino. O indicador de pH é o azul de bromotimol, que em meio ácido fica amarelo e em meio básico, azul. Produção de H2S: Este teste visa determinar a capacidade de produção de íons S-2 a partir do metabolismo bacteriano. Produção de gás: Este teste visa determinar a capacidade de produção de gás CO2 a partir da fermentação da glicose. Descarboxilação de lisina: Este teste visa determinar a capacidade de descarboxilar a lisina, por ação da enzima lisina descarboxilase. 2.2) Procedimento: Tocar a colônia com agulha bacteriológica e semear os 3 meios na seguinte ordem: Citrato, EPM e MILi. Para inocular o meio de citrato deslizar a agulha pelo centro estriando toda a superfície inclinanda. No meio EPM introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir o fundo do tubo. 2.3) Leitura e interpretação: A) Meio EPM: Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de cultura do fundo do tubo. Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade. Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reação fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não. Desaminação do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na superfície do meio. B) Meio MILi Motilidade: A bactéria móvel cresce além da linha de picada. A imóvel somente nesta linha. Resultado Cor do meio Positivo (+) Crescimento fora do local da picada Negativo (-) Crescimento ao redor da picada Descarboxilação da lisina: Quando a lisina é descarboxilada o meio adquire cor púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio não estiver amarelo. Produção de indol: Adicionar 3 gotas a 4 gotas do reativo de Kovacs à superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não produz, o reativo mantém sua cor inalterada. Resultado Cor do reagente Positivo (+) Rosa Negativo (-) Amarelo C) Meio Citrato de Simmons A utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfície do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio não sofre alteração. Resultado Cor do meio Positivo (+) Azul Negativo (-) Verde SISTEMA NUMÉRICO PARA ENTEROKIT B As 9 reações bioquímicas do Enterokit B foram agrupadas em 3 conjuntos de provas. O resultado de cada um destes conjuntos produz um algarismo, de modo que o resultado dos 3 conjuntos produz um número de 3 dígitos, que identifica uma espécie bacteriana. Os 3 conjuntos de provas e seus valores são: � Primeiro algarismo (A) Segundo algarismo(B) Terceiro algarismo(C) Lactose 4 Urease 4 Indol 4 Gás 2 LTD 2 Lisina 2 H2S 1 Mot 1 Citrato 1 Observações: 1) Para a interpretação das provas ver item Leitura e Interpretação. 2) Quando a reação da cepa investigada é positiva (+), colocamos o número correspondente. Exemplos: Urease + = 4, Lisina + = 2. Se a reação é negativa (-), colocamos para a mesma o valor 0. 3) Em seguida somamos os valores obtidos em cada série. O valor de A dá o primeiro algarismo, o valor de B dá o segundo e o valor de C dá o terceiro algarismo. Assim por exemplo uma cepa que apresente o seguinte resultado bioquímico: Lactose - 0 Urease +4 Indol - 0 Gás - 0 LTD +2 Lisina - 0 H2S + 1 Mot +1 Citrato +1 Total: 1 Total: 7 Total:1 terá o número 171 que corresponde na relação à bactéria Proteus mirabillis
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