1) Estrutura Funcao Acidos Nucleicos 2 [Modo de Compatibilidade][1]

Prévia do material em texto

ESTRUTURA E FUNÇÃO
DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Lewin, B. Genes VII.Artmed editora, Porto Alegre, 2001.955p
Suzuki, et al. Introdução a Genética. Guanabara Koogan, Rio de 
Janeiro , 1992. 633p.
Seres vivos:
a) PROCARIOTOS
b) EUCARIOTOS
Bactérias
Algas azuis
Micoplasmas
AnimaisAnimais
Vegetais
Protistas :
Protozoários
Algas
Fungos
Ribossomos
Nucleóide (DNA compactado)
Pili
Flagelo
Célula procariótica (bactérias):
Não tem organelas (núcleo, 
Tamanho do genoma:
E. Coli : 4.600 kb
3.000 proteínas
Mycoplasma genitalium: 580 kb
470 proteínas
Envelope celular 
(membrana)
Não tem organelas (núcleo, 
mitocondrias, etc)
Material genético compactado 
no nucleóide (não 
compartimentalizado)
Cromossomo único, circular 
fechado (na maioria das 
bactérias, ex: Escherichia coli)
Exceção: Borrelia burgdorferi 
DNA dupla hélice e linear
Célula eucariótica:
Organelas (núcleo, 
mitocôndrias, cloroplastos, etc)
Material genético compactado 
no núcleo
Cromossomos lineares
DNA de fita dupla
Ribossomos
Envelope nuclear
Núcleo
Ribossomos
Mitocondrias
Cloroplasto
Breve história da genética 
•1865: os genes são fatores particulados
•1884: Primeira publicação dos trabalhos de Mendel
•1884: Descoberta dos cromossomos
• 1869: descoberta do DNA (Friedrich Miescher)
•1900 : redescoberta das leis de Mendel
• 1903: os cromossomos são unidades hereditárias
• 1910: os genes estão nos cromossomos• 1910: os genes estão nos cromossomos
• 1913: os cromossomos contem arranjos lineares de genes
• 1927: as mutações são mudanças físicas nos genes
• 1931: a recombinação é causada pelo crossing-over
• 1944: o DNA é o material genético
• 1945: um gene codifica uma proteína
• 1953: o DNA é uma dupla hélice
• 1958: o DNA replica de forma semiconservativa
•1960: Descoberta do RNA mensageiro
• 1961: o código genético é uma trinca
Breve história da genética 
•1977: o DNA pode ser seqüenciado
•1987: os genomas podem ser seqüenciados
• 1988: Inicio do projeto genoma Humano
• 2005 : Importância do “DNA lixo”
•Atualmente: Projetos Proteômica
• 2010: sintese “in vitro” do genoma de uma bactéria
• 2010: Revisão do conceito de gene ( “um gene é um• 2010: Revisão do conceito de gene ( “um gene é um
•segmento de DNA que codifica um produto funcional 
(polipeptídeo ou RNA)”
Material genético está presente nos cromossomos
Dúvida: DNA
RNA
Proteínas
O DNA é o material
genético em todos os
organismos exceto em
alguns vírus (vírus de RNA)
Comprovado por Griffith 1928 e Avery e colaboradores em 1944
Griffith, 1928 
Avery, McLeod 
& McCarty
1944
Princípio 
transformante
Hershey e 
Chase,1953
Só Fagos 
marcados com 
32P produziam 
filhos 
radioativos
Compactação do DNA
Antes da descoberta do DNA pressupunha que o material
responsável pelas características herdáveis deveria ter três
características principais:
1) Conter toda a informação para a estruturação da célula de um
organismo, suas funções, desenvolvimento e reprodução de forma
estável.
2) Se replicar com precisão para que a progênie de células tenha a2) Se replicar com precisão para que a progênie de células tenha a
mesma informação genética que as células parentais.
3) Ser capaz de variação (mutação e recombinação), senão não
haveria evolução
FORMAS DE DNA
Cromossomo bacteriano
Plasmídeo
LINEAR
Plasmídeo
DNA mitocondrial
DNA de cloroplasto
DNA de alguns vírus 
(bacteriófagos)
CIRCULAR
Fonte
Fita Simples 
(FS) ou
Fita Dupla 
(FD)
Circular 
ou linear
Número de 
bases (b) ou 
pares de 
bases (pb)
% (C+G)
SV40
Vírus de macaco
FD Circular 5.243 pb 40,80
Fago
M13
FS Circular 6.470 b 40,75
Propriedades das moléculas de DNA encontradas em vários organismos
M13
Vírus mosaico
da couve-flor
FD Circular 8.031 pb 40,19
AD-2
Adenovírus
FD Linear 35.937 pb 55,20
Fago T2 FD Linear 1,7 x 105 pb 52
E. coli FD Circular 4,2 x 106 pb 53
Drosophila melanogaster
(um cromossomo)
FD Linear 6,5 x 107 pb 40
Componentes dos ácidos nucléicos
•Nucleosídeos:
açúcar + base nitrogenada
(pentose)
•Nucleotídeos:•Nucleotídeos:
Nucleosídeo + grupo fosfato
A ligação entre a base
nitrogenada e a pentose é feita
covalentemente através de uma
ligação N-glicosídica com a
hidroxila ligada ao carbono-1 da
pentose.
A ligação entre o grupo
fosfato e a pentose é feita
através de uma ligação
fosfoéster com a hidroxila ligada
ao carbono-5 da pentose.
Bases Nitrogenadas
Composição 
dos ácidos 
nucléicos
Uracila Timina
Ribose
Composição 
dos ácidos 
nucléicos
Citosina 2´desoxirribose
Adenina Guanina
Ácido fosfórico
RNA
Ribonucleotídeo
DNA
POLINUCLEOTÍDEOS:
dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP
2´- Desoxiadenosina 5-´trifosfato
2´- Desoxiguanosina 5-´trifosfato
2´- Desoxicitidina 5-´trifosfato
2´- Desoxitimidina 5-´trifosfato
Desoxirribonucleotídeos
2´- Desoxitimidina 5-´trifosfato
Ácidos nucléicos são
polímeros lineares de
nucleotídeos
unidos por ligações
fosfodiéster 5´ – 3´.
Cadeia polinucleotídicaCadeia polinucleotídica
Sequencias de ácidos 
nucléicos, por convenção, 
são escritas na 5´- 3´
Sequencia de bases: como
a informação genética é
carregada
Os nucleotídeos estão
ligados covalentemente
por ligações
fosfodiéster.
A posição 3’ da
molécula de açúcar
liga-se ao grupamentoliga-se ao grupamento
fosfato que se liga a
posição 5’da molécula
de açúcar subseqüente
O alongamento da fita de DNA ocorre SEMPRE na
direção 5' para 3'
Estrutura da Molécula de DNA
1953 Watson e Crick propuseram um modelo de estrutura 
tridimensional do DNA
a) Estudos de difração do raio X (Franklin e Wilkins)
b) Estudos químicos da molécula ( Chargaff)b) Estudos químicos da molécula ( Chargaff)
DAMA SOMBRIAROSALIND FRANKLIN: A DAMA SOMBRIA 
DO DNA (1920 – 1958)
R. Franklin e M. Wilkins (1953): Difração de raios-X
Moléculas de DNA assumem estrutura helicoidal, 
com 2 periodicidades (3.4 e 34Aº ) ao longo do eixo 
da hélice. Rosalind Franklin: The Dark Lady 
of DNA. Brenda Maddox
Erwin Chargaff (1950) “Regras de Chargaff”
As quantidades relativas de A, T, G e C são características de
cada organismo, não variando entre diferentes tecidos ou em
diferentes condições fisiológicas.
Em qualquer DNA celular, a quantidade de resíduos A=T e
G=C.
The Double Helix - James D. Watson
(leitura adicional) 
J. Watson e F. Crick (1953):
•Modêlo tri-dimensional para a estrutura do DNA:
•Duas cadeias de DNA complementares (pareamento de bases)
• São anti-paralelas (direções opostas),
• Formam uma dupla-hélice com rotação no sentido anti-horário
(“right-handed”). Fitas enrolam para a direita
•Arcabouço açúcar-fosfato do lado externo (cargas negativas)•Arcabouço açúcar-fosfato do lado externo (cargas negativas)
• As bases ficam no interior da cadeia (degraus)
•A torção das fitas gera dupla hélice com sulco maior e sulco
menor
•Duas cadeias estão associadas por pontes de Hidrogênio entre as
bases.
DNA fita dupla: cadeias antiparalelas
Bases no meio
Ligações glicosídicas no DNA, entre 
as desoxirriboses e as bases 
nitrogenadas, não estão diretamente 
opostas na dupla-hélice, gerando 2 
cavidades desiguais em seu contorno.cavidades desiguais em seu contorno.
PONTES DE HIDROGÊNIO
Estrutura Química e Tamanho das bases nitrogenadas
CETO ( C=O ) 
GRUPOS
AMINO ( C-NH2 )
Permitem a formação de PONTES 
DE HIDROGÊNIO entre as bases.
T e U grupo CETO
A grupo AMINOA grupo AMINO
C e G grupos CETO e AMINO
T e U grupo CETO
A grupo AMINO
1 ponte de hidrogênio 
A grupo AMINO
C e G grupos CETO e AMINO 2pontes de hidrogênio
1 ponte de hidrogênio adicional entre os nitrogênios
dos anéis aromáticos em todos os pares de bases
OUTROS PAREAMENTOS PAREAMENTO DE HOOGSTEEN
Ocorre em fitas triplas dos anéis aromáticos de RNA e DNA : GA , CA e TG.
Com base na estrutura de dupla hélice do DNA e nas características de 
hidrofobicidade das moléculas, a estrutura do DNA fica da seguinte forma:
•••• O grupo fosfato e o açúcar (parte hidrofílica) - estão localizados na parte 
externa da molécula.
•••• As bases nitrogenadas (parte hidrofóbica) - estão localizadas na parte interna 
da molécula.
T A
GC
A T
G C
Pontes de hidrogênio entre bases C-G e A-T
em fitas de DNA complementares estabilizam e
conferem especificidade a dupla-fita de DNA
FORÇAS QUE ESTABILIZAM A ESTRUTURA DA DUPLA-HÉLICE 
a) fortes para manter a integridade do DNA
FORÇAS
b) permitir uma flexibilidade conformacional, essencial para suas atividades 
•Ligações covalentes: une os átomos nas moléculas (pontes de hidrogênio)
•Força de Van der Walls: ligações moleculares (fracas) entre os anéis 
aromáticos de bases adjacentes que são fracas, mas aditivas na manutenção 
da estrutura.da estrutura.
Efeitos hidrofóbicos interações hidrofóbicas entre bases 
nitrogenadas adjacentes
os anéis purínicos e pirimidínicos das bases são forçados para o
interior da dupla-hélice.
•Efeitos hidrofílicos as cadeias de açúcar-fosfato (carregados 
negativamente) interagem com cátions (principalmente Mg2+) em solução, 
neutraliza a repulsão entre as duas cadeias estabiliza a dupla-hélice. 
Dupla – hélice
Antiparalelas
Estrutura da Molécula de DNA
Antiparalelas
DNA Açúcar, Grupo fosfato e Bases nitrogenadas
Anéis aromáticos das bases nitrogenadas 
(hidrofóbicos)
Bases pareadas entre as duas fitas
DUPLA-HÉLICE DO DNA PROPOSTA POR WATSON E CRICK 
A) Modelo 
simplificado
B) Modelo molecular 
mostrando as cavidades
A B
CM
Cm
Cm
Cm
CM
Tipos de DNA mais comuns encontradas em condições fisiológicas. CM= 
cavidade maior; Cm= cavidade menor.
Características das diferentes formas de hélice 
dupla de DNA
Forma A Forma B Forma Z
Sentido helicoidal Giro para a direita Giro para a direita Giro para a esquerda
Diâmetro ~2,6 nm ~2,0 nm ~1,8 nm
Pares de base por giro da hélice (n) 11 10 12 (6 dímeros)
Giro helicoidal por pb (=360/n) 33° 36° 60°(por dímero)
Subida da hélice por pb (h) 0,26 nm 0,34 nm 0,37 nmSubida da hélice por pb (h) 0,26 nm 0,34 nm 0,37 nm
Espaçamento na hélice (=nh) 2,8 nm 3,4 nm 4,5 nm 
Inclinação da base em relação ao 
eixo da hélice 20° 6° 7°
Sulco maior Estreito/profundo Largo/profundo Achatado
Sulco menor Largo/raso Estreito/profundo Estreito/profundo
Ligação glicosídica anti anti anti (pir)
sin (pur)
CONSEQÜÊNCIAS DA DUPLA HÉLICE
1. Molécula pode ser duplicada ou replicada
(especificidade entre as bases)
2. Seqüência de pares de nucleotídeos dita a
seqüência de aminoácidos na proteína
3. Os ácidos nucléicos hibridizam por
pareamento de bases
PROPRIEDADES DO DNA
Propriedade crucial: capacidade da 
dupla hélice separar em duas fitas 
simples sem romper as ligações 
covalentes
A dupla hélice de DNA pode ser 
desnaturada reversivelmente:
Agentes desnaturantes:
Aquecimento
Extremos de pH
Desnaturação e 
Renaturação da 
fita dupla de DNA
Fusão ( melting)
Reanelamento
Fundamentais para os processos de:Fundamentais para os processos de:
REPLICAÇÃO
TRANSCRIÇÃO
RECOMBINAÇÂO
Tm= Temperatura de 
fusão(melting)
Tm é uma função do 
conteúdo de G + C da 
amostra de DNA, varia de 
80°C a 100°C.
40% de GC (mamíferos): 
DNA desnatura com uma 
Tm em torno de 87°C.
Cada molécula de DNA
Apresenta uma Tm 
diferente
Rompimento de pares de bases:
GC ( três pontes de hidrogênio) são necessárias temperaturas mais 
elevadas, pH mais altos ou maiores concentrações de agentes desnaturantes 
do que para a separação de um par AT (duas pontes de hidrogênio).
Quanto maior a porcentagem de CG, maior será a temperatura 
necessária para a desnaturação, > valor daTm
Relação entre a
composição de bases
e a Tm
RENATURAÇÃO DO DNA
a) Resfriamento
Temperatura 25°C abaixo da Tm lentamente
Resfriamento abrupto fitas de DNA colapsam
b) Sedimentação por centrifugação
c)Tratamento com enzimas específicas para fita simples (nuclease S1)c)Tratamento com enzimas específicas para fita simples (nuclease S1)
UTILIZAÇÃO:
Caracterização de genomas
Identificação de sequências de interesse Hibridização
Replicação
Transcrição
Ácido Desoxirribonucleico
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA
Transcrição
Tradução
Proteína
Ácido Ribonucleico
Replicação do DNA
Replicação do DNA:
Processo que precede a divisão celular e através do qual são
geradas cópias idênticas das moléculas de DNA presentes
na célula-mãe, a seguir herdadas pelas duas células-filhas
Divisão celular (fase S da intérfase)
Duplicaçao dos cromossomos
Separaçao dos cromossomos
Divisao celular
A replicação 
semi-conserva-
tiva foi provada 
em experimentos 
nos quais o DNA 
de Eschericchia 
coli foi inicial-
mente marcado 
com 15N, mais 
pesado.Nas 
gerações gerações 
sucessoras, 
cultivadas sem 
15N, formaram-se 
DNAs híbridos, 
que não se 
formariam se a 
replicação não 
fosse semi-
conservativaMeselson e Sthal, 1958
Replicação envolve várias atividades enzimáticas nas seguintes 
fases:
• Iniciação : reconhecimento de uma origem por um complexo 
protéico. Nas Forquilhas de replicação
•Alongamento ou extensão: replissomo )outro complexo protéico..
• Terminação: reações de junção e/ou terminação.
Síntese de nova fita: DNAs polimerases 
Envolvidas em reparo (DNA polimeraseI e II), 
Envolvida na replicação : DNA polimerase III
Estendem a fita pela adição de um nucleotídeo por vez a uma 
rxtremidade 3’-OH
DNA é sintetizado por DNA polimerases
• DNA polimerase I foi isolada a partir de E.coli em 1955 por A.
Kornberg
• As DNA polimerases necessitam sempre de um DNA molde e de 
uma seqüência iniciadora (Primer).
• O substrato da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´-trifosfato.• O substrato da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´-trifosfato.
• A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 
3´OH da cadeia em crescimento.
•Sentido da síntese sempre é 5’ → 3’.
Forquilha de Replicação:
Região do DNA onde ocorre a transição do DNA mãe fita dupla, para as 
novas fitas filhas duplas
Fragmentos de Okasaki:
Bactéria: 1.000 a 2.000 pb
Eucariotos: 150 a 200 pb
Todas as DNA polimerases conhecidas são capazes de estender fitas 
de DNA apenas na direção 5'→ 3'
Como, então, se dá a síntese na direção 3'→ 5' da forquilha de 
replicação?
Todas as DNA polimerases conhecidas são capazes de estender fitas 
de DNA apenas na direção 5'→ 3'
Como, então, se dá a síntese na direção 3'→ 5' da forquilha de 
replicação?
O que ocorre é uma replicação descontínua numa direção e contínua 
na outra; os fragmentos (de Okasaki) são unidos mais tarde por uma 
ligase
Todas as DNA 
polimerasesprecisam de um 
grupo 3'-OH para 
estender a cadeia 
de DNA
Como, então, se 
inicia a síntese de 
DNA?
Uma enzima Uma enzima 
chamada primase 
sintetiza um 
PRIMER de RNA 
tanto na fita lider 
como nos 
fragmentos de 
Okasaki
Elongação da cadeia Atividade revisora (atividade
exonuclease 3’ → 5’) garante a
fidelidade da replicação
Replicon:
Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de
replicação
• Origem + Término
• Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
• O genoma de uma célula procariótica possui um único
replicon
• Cada cromossomo eucariótico possui vários replicons e• Cada cromossomo eucariótico possui vários replicons e
todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que
não simultaneamente
O genoma bacteriano circular possui um único replicon
• A velocidade da forquilha de 
replicação bacteriana é 50.000 
pb/min
• Uma única origem de replicação 
em E.coli (OriC, 245 pb)
• Bidirecional
O genoma eucariótico possui vários replicons
• A velocidade da forquilha de replicação eucariótica é 2.000 pb/min
• Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos 
diferentes
• Fase S do ciclo celular demora ~ 6hrs em uma célula somática
Replicação: Síntese
Replicação em E. coli
Iniciação - 1º estágio da replicação em E.coli
Estrutura da origem de replicação bacteriana oriC
• A origem de replicação OriC é extremamente conservada.
• sequências repetidas com 9 e 13 bases, ricas em A-T são
reconhecidas por > 9 enzimas diferentes..
Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli
DNA A : Reconhece a origem oriC e abre a dupla fita em sítios 
específicos 
DNA B (helicase) : Desenrola o DNA
DNA C : Auxilia a ligação de DNAB na origem
HU : Proteína do tipo histona que estimula a iniciação
Primase (DNAG): Sintetiza os iniciadores de RNAPrimase (DNAG): Sintetiza os iniciadores de RNA
Single strand binding (SSB): Liga a fita simples de DNA
RNA polimerase: Facilita a ação da DNAA
DNA girase: (topoisomerase): Alivia a tensão torsional gerada pela 
abertura da dupla-fita
Dam Metilase: Metila as sequências GATC na OriC 
Elongação - 2º estágio da replicação
Aplicações na PCR:
•Sentido da síntese 5’ 3’ da cadeia
•Capacidade do DNA de desnaturar e renaturar•Capacidade do DNA de desnaturar e renaturar
•Temperatura de melting
•Necessidade de iniciadores (primer)
•Propriedades das DNAs polimerases