Aula Obtenção de Material genômico de difrentes fontes 25.09.12 FCM

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Aula 2: Obtenção de Material Genômico de Diferentes Fontes
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I – DEFINIÇÃO
Qualquer tipo de tecido ou fluido biológico pode ser utilizado como fonte de DNA, uma vez que são formados por células;
 Nas células, o DNA de interesse para a Biologia Molecular encontra-se no núcleo;
 Os tipos de amostras mais comuns, são: sangue, sêmen, saliva, mucosa oral, pele, osso, líquido amniótico, vilosidade coriônica, tumor fresco, tecido parafinado....
OBTENÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO
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OBTENÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO
 O material duro geralmente é fragmentado antes da extração por maceração, o que pode ser feito de muitas formas distintas: com um pistilo e uma cuba, com um ralador, com alicate, etc. Em geral o material deve ser pelo menos mantidos em gelo durante o trabalho, porque a maceração gera um calor local surpreendente, que não se percebe facilmente.
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Dra. Adriana Vieira
Tumor Parafinado
Tumor Fresco
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Dra. Adriana Vieira
A amostra biológica a ser analisada deve ser corretamente escolhida, transportada, coletada e armazenada, devido a sua suceptibilidade à degradação e contaminação;
A degradação biológica do DNA é feita por enzimas produzidas por fungos e bactérias, por causa da umidade e do calor;
 O DNA resiste bem ao calor (temperatura de até 100°C não o destrói), mas existe o problema da contaminação;
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Dra. Adriana Vieira
Ter um conhecimento mínimo sobre as técnicas de estudo para extração e
identificação seqüencial do DNA é de fundamental importância, pois evita que sejam valorizados exames feitos de forma não idônea.
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Dra. Adriana Vieira
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II – OBTENÇÃO DE DNA
Existem várias técnicas para extração do DNA que utilizam diferentes metodologias e espécimes biológicos;
 O sangue é o padrão-ouro de material utilizado para extração de DNA porque é fonte abundante de informação genética e por fornecer amostra fresca para análise;
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Dra. Adriana Vieira
A maioria dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a extração de DNA dos leucócitos humanos;
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2.1 – ETAPAS DA EXTRAÇÃO
1a Etapa: Ruptura ou lise celular; 
2a Etapa: Precipitação ou inativação de proteínas;
3a Etapa: Isolamento dos ácidos nucléicos;
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Dra. Adriana Vieira
1a Etapa: ruptura ou lise celular
 Libera os componentes citoplasmáticos e/ou nucleares intracelulares;
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OBS: 1a Etapa
 Esta etapa em material humano, geralmente se utiliza um DETERGENTE para lisar as membranas celulares.
EX: SDS e Proteinase K
SDS
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2a Etapa: Precipitação ou inativação de proteínas
 Todos os lisados celulares contêm naturalmente 
Mistura de macromoléculas
Fragmentos de membranas lipídicas
Proteínas intracelulares: nucleases degradativas (DNases e RNases) e proteínas ligadoras de DNA
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Dra. Adriana Vieira
O QUE SE DEVE FAZER?
Realizar a extração em baixas temperaturas (gelo), o que reduz a atividade da proteína;
Incorporar inibidores de enzima e/ou substratos, imediatamente, após a lise;
Incubação dos lisados com reagentes desnaturantes de proteínas;
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 Este processo pode ser feito ou por sal (NaCl) ou Fenol
SAL (Salting Out)
O sal contribui com ínos – e +, neutralizando o DNA e as Histonas para que este complexo não se repila e se enovele, impedindo a desintegração do DNA;
O sal aumenta a densidade do meio, facilitando a migração do DNA para o álcool;
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Fenol:
Tem o poder de desproteinização atuando na propriedades hidrofóbicas das proteínas que apresentam afinidade por solvente orgânico;
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3a Etapa: Isolamento dos ácidos nucléicos
 Solubilização em solventes orgânicos, seguida de precipitação;
 Esta etapa ocorre o isolamento do DNA por precipitação alcoólica;
 Se na fase 2 foi utilizado o fenol, é necessário adicionar clorofórmio que tem a função de retirar os resíduos de fenol., antes da utilização do álcool.
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Dra. Adriana Vieira
OBS: Álcool (etílico/ isopropanol):
 O DNA possui baixa solubilidade em álcool etílico e também sofre um processo de desidratação, fazendo com que as moléculas fiquem mais compactas;
 Na forma compacta, o DNA precipita formando uma massa filamentosa e esbranquiçada; 
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Dra. Adriana Vieira
DNA precipitado!!!
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O protocolo mais adequado à rotina laboratorial para avaliação de polimorfismos e mutações genéticas compreende a lise celular com SDS, remoção das proteínas por precipitação com cloreto de sódio concentrado (salting out) e isolamento do DNA genômico por precipitação etanólica (etanol).
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Resultados
RNA de boa qualidade
RNA degradado
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DNA genômico
Resultados
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III – OBTENÇÃO DE RNA
 a principal preocupação na extração de RNA consiste na sua degradação por ribonucleases (RNAses), que são enzimas extremamente resistentes a vários tratamentos, inclusive térmicos.
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Dra. Adriana Vieira
OBTENÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO
O que ser feito para manter a integridade do RNA?
 TRIZOL – reagente pronto para o uso no isolamento do RNA total de células e tecidos. Ele contem uma solução monofásica de fenol e guanidina isotiocianato. Ele mantém a integridade do RNA enquanto rompe as células e dissolve os componentes celulares !!!
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Dra. Adriana Vieira
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RNasin: proteína derivada de fígado de rato. Combate a atividade endógena de Rnase;
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Dra. Adriana Vieira
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DEPC (dietilpirocarbonato) – forte inibidor de RNAses
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Dra. Adriana Vieira
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Dra. Adriana Vieira
KITS DE EXTRAÇÕES AUTOMATIZADAS
 Conjuntos comerciais desenvolvidos para facilitar o rápido isolamento de ácidos nucléicos;
 Utilizam o mesmo princípio básico: lise, inativação/degradação protéica e extração por solventes;
 Divergem da forma pelo qual os ácidos nucléicos são finalmente isolados de lisados celulares;
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Dra. Adriana Vieira
KIT PARA EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE SANGUE TOTAL
Aplicação:  Fundamental nas áreas de biologia molecular, genética, biotecnologia e médica. Ideal para obtenção de um DNA puro com alta qualidade.  Características do produto:  Kit para extração de DNA a partir de sangue fresco ou congelado conservado em citrato, heparina ou EDTA;  Para processar amostras de até 200ul;  O Kit e suficiente para 50 extrações (purificações);  O DNA extraído é obtido dentro de 25-30minutos;  Princípio do Kit: Lise da amostra/lavagem/Eluição do DNA/DNA puro;  O DNA obtido pode ser utilizado para as seguintes aplicações:  - PCR; - Souther blotting; - Digestão por enzimas de restrição 
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Dra. Adriana Vieira
InviTrap® Spin Plant RNA Mini Kit - STRATEC Molecular
The InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit is ideal for easy and quick isolation of total RNA from a wide variety of plant samples and filamentous fungi. 
The kit can be further used for the simultaneous isolation of total RNA and proteins.
The isolated total RNA is ready to use for a broad panel of downstream applications:
RNA dot blots (Northern Blotting); cDNA transcription; real-time PCR (quantitative RT-PCR,
like TaqMan and LightCycler technologies); DDRT-PCR; array technologies
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