Genética I - Parte XIII

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16/06/2014
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Genética
Melissa Vieira Leite
Parte XIII
Engenharia Genética:
conceitos básicos,
ferramentas e aplicações
Engenharia Genética
• Constitui um conjunto de
técnicas de análises
moleculares que permitem
estudos de caracterização,
expressão e modificação do
material genético (DNA e
RNA) dos seres vivos;
• Aspectos éticos;
Ferramentas e técnicas
da engenharia genética
Extração de ácidos nucléicos
• A extração de DNA e RNA são as duas primeiras
etapas técnicas aos estudos posteriores;
• Existem inúmeros processos adotados para sua
extração;
• Nas células animais são diferentes daqueles utilizados
nas células vegetais;
• A principal diferença é a ruptura da parede celular
que é uma etapa comum nas células vegetais e não nas
animais;
• Em geral o DNA genômico obtido nos diversos
procedimentos deve ter uma pureza razoável e não
deve estar degradado;
• Basicamente os protocolos de extração de DNA de
células vivas apresentam as seguintes etapas:
– Ruptura da parede celular e membrana plasmática;
– Extração de proteínas;
– Precipitação de DNA em solução aquosa com agentes
desidratantes (sais e álcoois);
– Degradação do RNA residual pela ação de ribonucleases
(RNAses);
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• Na extração de RNA, algumas medidas adicionais
devem ser tomadas tendo em vista que essa molécula
é mais instável que a do DNA;
• Essa molécula pode ser facilmente degradada pela
ação de RNAses e assim não pode ser utilizada em
nenhuma análise;
• Um dos únicos agentes que garantem a desnaturação
irreversível das RNAses é o dietilpirocarbonato
(DEPC);
• Uso de luvas, pois a RNAse pode estar presente nas
mãos do operador;
• Procedimentos prévios análogos aos da extração de
DNA;
• RNA é precipitado com soluções de acetato de lítio;
• Esses agentes permitem uma precipitação diferencial
de RNA em relação ao DNA;
• Centrifugação: amostra resultante rica em RNA;
• Caso a análise necessite de eliminação completa do
DNA residual, faz-se o tratamento posterior da
amostra com desoxiribonuclease (DNAse), livre de
RNAse;
Reação de polimerase em cadeia (PCR)
• Aplica-se a muitos trabalhos tais como:
– Amplificação de sequências gênicas total ou
parcialmente homólogas a uma conhecida;
– Identificação genotípica (fingerprinting);
– Testes de paternidade;
– Análise de dissimilaridades entre genomas;
– Caracterização de germoplasma;
– Mapeamento genético;
– Seleção diferencial de genes expressos em sistemas;
• A PCR imita a duplicação do DNA in vitro;
• Três etapas:
– Desnaturação da dupla fita de DNA;
– Hibridação de oligonucleotídeos iniciadores (primer);
– Polimerização das novas cadeias de DNA (DNA
polimerase – Taq polimerase ou pfu);
• Etapas repetidas em ciclos de 30 a 40 vezes,
garantindo uma amplificação em progressão
geométrica do DNA a partir da quantidade inicial
colocada no ensaio (da ordem de 25ng de DNA);
• Mecanismo automatizado (Termociclador);
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Eletroforese em gel
• Procedimento básico em todas as análises com ácidos
nucléicos;
• Moléculas de ácidos nucléicos apresentam carga
negativa quando solubilizadas em soluções aquosas;
• Migram em um suporte sólido (agarose ou
poliacrilamida);
• Migram em direção ao polo positivo e se separam de
acordo com o peso molecular;
• Moléculas pequenas tendem a migrar com velocidades
maiores do que as grandes;
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Sistemas de restrição e metilação
• As enzimas de restrição são endonucleases que
cortam o DNA em sítios específicos;
• Podem ter função de metilases: quando isso ocorre,
ela adiciona um radical metila no sítio onde a porção
da enzima com função de restrição atua;
• As enzimas de restrição são consideradas verdadeiras
“tesouras” moleculares, pois podem ser utilizadas para
fragmentar especificamente os genomas de maneira
que possam ser facilmente “colocados” em outros
(clonagem). Porém, para isso é necessária outra
enzima chamada de DNA ligase;
• Aplicações: diagnóstico de doenças genéticas,
mapeamento genético, análises de divergência
genética entre genomas, clonagem e subclonagem de
fragmentos para sequenciamento, estudos de
expressão gênica, etc;
Enzimas modificadoras: polimerases e
ligases
• DNA ligase;
• DNA polimerase I;
• Transcriptase reversa;
Clonagem molecular
• É um estratégia chave da engenharia genética;
• Significa “cortar” determinada sequência gênica de
um genoma e inseri-la em outro DNA que é chamado
de vetor e é em geral um plasmídeo;
• Esse processo só foi possível após a descoberta das
enzimas de restrição e das ligases;
Técnicas básicas para caracterização
de genes
• Construção de biblioteca genômica;
• Construção de biblioteca de cDNA;
• Sequenciamento de DNA;
Construção de biblioteca genômica
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Construção de biblioteca de cDNA
• Conjunto de sequências gênicas de um ser vivo que
expressam-se em uma situação fisiológica específica;
• É obtida do pool de RNAm expresso em uma célula ou
tecido específico;
• A obtenção do cDNA é realizada a partir do RNAm;
• São úteis para caracterizar as sequências de genes
que são especificamente expressas em células;
Sequenciamento de DNA
Técnicas para estudo de
caracterização e expressão de genes
• Southern blotting: é um método da biologia molecular
que serve para verificar se uma determinada
seqüência de DNA está ou não presente em uma
amostra de DNA analisada;
• Northern blotting: é uma técnica usada na pesquisa
em biologia molecular para estudar a expressão
gênica, ou seja, verificar se um determinado gene de
um genoma é ou não transcrito em RNAm e quantificar
isso;
Análise em microarranjos
• É uma técnica experimental da Biologia Molecular que
busca medir os níveis de expressão de transcritos em
larga escala, ou seja, medindo muitos (em alguns casos
todos os) transcritos simultaneamente;
• O termo microarranjo é uma tradução natural e aceita
para o termo em inglês microarray pelo qual esta
técnica é mais conhecida.
• Um DNA microarray, ou DNA-chip, consiste num
arranjo pré-definido de moléculas de DNA
(fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou
oligonucleotídeos) quimicamente ligadas à uma
superfície sólida, usualmente lâminas de microscópio
revestidas com compostos que conferem carga
positiva;
• Os microarrays também podem ser preparados em
membranas de nylon positivamente carregadas;
• A análise em microarranjos tende a superar, com o
tempo, as análises em Southern blotting e Northern
blotting tradicionais;
A tarefa de depositar as sequências é realizada por um
robô
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Aplicações da engenharia genética
• Agricultura;
• Pecuária;
Agricultura
• Seleção de plantas superiores em programas de
melhoramento, em relação a características como
resistência a doenças, pragas e fatores abióticos;
• Manejo das culturas, em especial, quando se pensa
no manejo de pragas e controle biológico;
• Seleção de genótipos que produzem
frutos, legumes e verduras com vida
longa de prateleira;
• Selecionando variedades de frutas
com teor de aroma específico;
• Produção de plantas transgênicas:
– Plantas resistentes a uma doença ou uma praga que
ocasiona restrições de produção;
– Resistentes ao alumínio trocável do solo;
– Resistentes a herbicidas;
– Produtoras de elementos protetores (como anticorpos,
servindo como alimentos protetores), enriquecidas com
proteínas, frutas com menor perecibilidade;
• Desafios:
– Questões relacionadas à
propriedade intelectual e
royalties;
– Discussões e estabelecimento
de critérios claros para evitar
perda do material biológico
natural do planeta;
– Controles e testes de
segurança alimentar e
ambiental;
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Pecuária
• Permite estudos genéticos e moleculares dos
principais patógenos dos diversos rebanhos (leiteiro,
suíno, equino etc);
•Esses estudos podem propiciar ainda estratégias de
controle biológico e produção de vacinas de DNA
(terapia gênica);
• Pode auxiliar programas de melhoramento genético
animal de forma a selecionar características gênicas
específicas contidas em raças, em uma dada progênie,
ou relacionadas a doenças genéticas;
• Fundamentar estudos de produção de animais
transgênicos e a clonagem animal;
• Esses últimos aspectos, sem dúvida, os mais
controversos e polêmicos, exigindo-se ainda,
discussões éticas porque, em especial, a clonagem de
animais, abre prerrogativas e estudos podem
subsidiar a clonagem humana;
“É fundamental diminuir a distância
entre o que se diz e o que se faz de
tal forma que, num dado momento, a
tua fala seja a tua prática.“
Paulo Freire
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