Estudo do potencial químico farmacológico de metabólitos secundários de Aspergillus niger

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Estudo do potencial químico-farmacológico de metabólitos secundários de fungos da costa cearense: Aspergillus niger
Discente: Arthur de Sousa Rocha
Orientadora: Prof. Dr. Patrícia Marinho
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Belém/PA - 2017
Introdução
Os produtos naturais possuem uma rica história no desenvolvimento de medicamentos. Muitas drogas sintéticas usadas na prática clínica foram desenvolvidas, ao menos parcialmente, a partir de fontes naturais. Logo a importância do fungo, na obtenção de metabólitos secundários , haja vista que é um potencial químico-farmacológico.
A espécie Aspergillus niger é um fungo que habita em diferentes ambientes e possui um metabolismo muito versátil, sendo uma das espécies mais importantes de fungos filamentosos utilizados na biotecnologia. A sua utilização para a produção de ácidos orgânicos é uma das principais razões para sua relevância em processos de fermentação industrial e importância comercial. 
Figura 1 - Aspergillus niger 
OBJETIVOS
Avaliar o potencial citotóxico de fungos provenientes de sedimentos da costa cearense frente à linhagem de células tumorais do carcinoma colo retal humano HCT-116 visando a seleção de uma cepa para produção de metabólitos secundários bio-ativos; 
Otimizar as condições de cultivo microbiológico do fungo Aspergillus niger BRF074 em pequena escala variando-se os meios nutricionais e diferentes intervalos de tempo visando a produção de novos compostos bio-ativos; 
Realizar fermentações em grande escala utilizando as condições dos experimentos que se mostraram promissores na produção de metabólitos secundários em pequena escala; 
OBJETIVOS
Isolamento e caracterização estrutural dos metabólitos secundários provenientes dos extratos produzidos nas fermentações em grande escala; 
Investigar a atividade citotóxica de extratos, frações e metabólitos isolados empregando modelos "in vitro", com vistas à descoberta de novas moléculas potencialmente ativas; 
Quantificação dos metabólitos secundários bioativos nos extratos provenientes das diferentes condições de cultivo de A. niger; 
Realizar experimentos de epigenética através do emprego do modificador do epigenoma SAHA no cultivo do micro-organismo, como ferramenta na ativação de rotas Biosintéticas desativadas sob condições normais de cultivo. 
RESULTADOS E DISCUSSÕES 
48 linhagens de fungos foram isoladas de sedimentos da praia do Pecém, litoral do Ceará. 
Todas as cepas obtidas foram cultivadas em meio líquido batata-dextrose (BD) com água do mar sintética por 14 dias e os respectivos extratos orgânicos foram testados frente à linhagem de células tumorais HCT-8 (colón).
A cepa BRF074, posteriormente identificada como sendo Aspergillus niger, foi selecionada para o estudo químico por apresentar alta atividade citotóxica (77%; IC50 0,95).
OTIMIZAÇÃO DE MEIO DE CULTURA
Cultivo em pequena escala em meio de cultura BDL, MPD, BD e MntPL. 
Diante desses resultados, foram avaliados quatro intervalos de crescimento: 07, 14, 21 e 28 dias, e ao final de cada período, os meios líquidos foram filtrados e submetidos à extração com acetato de etila (AcOEt).
Os perfis cromatográficos dos extratos referentes a cada meio de cultivo e período de crescimento foram avaliados por CLAE utilizando coluna analítica em modo reverso, com mistura de solventes H2O/CH3CN em gradiente com a concentração de CH3CN variando de 20% à 100% em 40 minutos. As amostras foram injetadas na concentração de 1 mg/mL e fluxo de 1 mL/min. 
Figura 2 - Inibição do crescimento celular (%) dos extratos do cultivo de A. niger em meio BD com 7, 14, 21 e 28 dias de crescimento, testado na concentração de 50 μg/ml.
Tabela 1 - Massa dos extratos obtidos no cultivo de A. niger em meio de cultura BD com 07, 14, 21 e 28 dias de crescimento
Tabela 2 - Massa dos extratos obtidos no cultivo de A. niger em meio de cultura BDL com 07, 14, 21 e 28 dias de crescimento. 
Figura 3 - Cromatogramas da análise por CLAE correspondente a 7, 14, 21 e 28 dias de cultivo de A. niger em BDL.
Tabela 3 - Massa dos extratos obtidos no cultivo de A. niger em meio de cultura MPD com 07, 14, 21 e 28 dias de crescimento. 
Figura 5 - Cromatogramas da análise por CLAE correspondente a 7, 14, 21 e 28 dias de cultivo de A. niger em BDL.
Figura 6 - Cromatogramas da análise por CLAE correspondente a 7, 14, 21 e 28 dias de cultivo de A. niger em MntPL. 
 
Tabela 4 - Massa dos extratos obtidos no cultivo de A. niger em meio de cultura MntPL com 07, 14, 21 e 28 dias 
Figura 7 - Inibição do crescimento celular (%) dos extratos do cultivo de A. niger nos meios de cultivo BDL, MPD e MntPL com 7, 14, 21 e 28 dias de crescimento, testado nas concentrações de 5 e 50 μg.mL-1 para a linhagem de células HCT-116
ISOLAMENTO 
Foram identificados ao total de 11 substâncias, sendo uma inédita, e também apenas duas das mesmas foram relatadas da a partir da A. niger.
Figura 8- Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F3. 
 
A fração BRF074-BD-F3 (84,2 mg) foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna analítica (modo reverso) para desenvolvimento de um método isocrático, para melhor separação dos seus constituintes químicos. Com a amostra na concentração de 1 mg.mL-1 e um fluxo de 1 mL.min-1, foi possível chegar a um método isocrático H2O/CH3CN 80:20 onde observou-se boa separação dos picos.(ELUENTE: H2O/MeOH 6:4 )
A fração BRF074-BD-F4 (90,0 mg) foi submetida a analise em CLAE utilizando coluna semi-preparativa de fase reversa. A separação foi efetuada empregando-se como fase móvel H2O/CH3CN (70:30), com fluxo de 4,72 mL.min-1 e amostra na concentração de 10 mg.mL-1. (ELUENTE: H2O/MeOH 1:1)
Figura 9 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F4 
Figura 10 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F6 
A fração BRF074-BD-F6 (143,2 mg) foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna analítica (modo reverso) para desenvolvimento de um método isocrático, para melhor separação dos seus constituintes químicos. Com a amostra na concentração de 1 mg.mL-1 e um fluxo de 1 mL.min-1, foi possível chegar a um método isocrático H2O/CH3CN 50:50 onde observou-se boa separação dos picos. (ELUENTE: MeOH/H2O 8:2 )
Figura 11 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F3 
A fração BRF074-BDL-F3 (47,8 mg) foi purificada por CLAE utilizando uma coluna semi-preparativa de fase reversa. A amostra foi injetada na concentração de 15 mg.mL-1, utilizando fluxo de 4,72 mL.min-1 e método isocrático H2O/CH3CN (15:85). O cromatograma (FIGURA 115, p. 181) referente a análise mostrou um pico majoritário com tempo de retenção 6,46 min, que após evaporação do solvente forneceu 6,7 mg de um composto codificado BRF074 (8). (ELUENTE: H2O/MeOH 6:4 )
Figura 12 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F6
A fração BRF074-BDL-F6 foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna semi-preparativa de fase reversa. A separação foi efetuada em condições isocráticas, empregando-se como fase móvel H2O/CH3CN (50:50), com fluxo de 4,72 mL.min-1 e amostra na concentração de 20 mg.mL-1. (ELUENTE: MeOH/H2O 8:2)
Figura 13 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-MPD-F5 
A fração BRF074-MPD-F5 (45,7 mg) foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna analítica (modo reverso) para desenvolvimento de um método isocrático, para melhor separação dos seus constituintes químicos. Com a amostra na concentração de 1mg.mL-1 e um fluxo de 1 mL.min-1, foi possível chegar a um método isocrático H2O/MeOH 45:55 onde observou-se boa separação dos picos. Esse método foi reproduzido em uma coluna semi-preparativa, também operado no modo reverso, com fluxo de 4,72 mL.min-1 e amostra na concentração de 15 mg.mL-1. (ELUENTE: MeOH/H2O 7:3)
CONCLUSÃO
Todos os compostos puros foram submetidos a testes de atividade citotóxica frente a linhagem de células tumorais de cólon
(HCT-116), onde somente o composto inédito BRF074 (11) e as malforminas A BRF074 (9) e C BRF074 (10) se mostraram ativos.
Embora já bastante reportado na literatura, o estudo químico de A. niger resultou no isolamento de compostos inéditos no micro-organismo e no gênero Aspergilus, além de um composto de caráter inédito na literatura BRF074 (11), dos quais alguns com atividade citotóxica. 
Obrigado !!