Teste para doenças imunomediadas

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Universidade Federal do Acre
Centro de Ciências Biológicas e da Natureza
Hematologia Veterinária
Testes para doenças imunomediadas
Lima. G.s.; vasconcelos. A.s.; viana. W.a.
Objetivos
Teste de Coomb’s ou TAD;
Citometria de fluxo;
FAN;
Caso clínico.
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Teste de coombs direto (TAD)
O teste de Coombs direto é um método que permite a identificação da presença de anticorpos fixados sobre as hemácias.
 
Tecnicamente, baseia-se no fato de que os anticorpos que recobrem as hemácias podem ser identificados pela adição de anticorpos.
Quando positivo, ou seja, indicando a presença de anticorpos aderidos às hemácias, formam-se pontes entre elas, levando ao fenômeno visível de aglutinação.
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Técnica
a) Preparar uma suspensão salina (5%) das hemácias a serem testadas; 
b) Colocar 2 gotas desta suspensão em 1 tubo, adicionar solução fisiológica e centrifugar a 3.000 r.p.m. por um minuto; 
c) desprezar (com cuidado) o sobrenadante deixando o “ botão” de hemácias no fundo do tubo; 
d) repetir a operação mais duas vezes. Na última operação, com auxílio de papel de filtro, procurar desprezar toda a solução salina;
e) adicionar duas gotas de soro de Coombs; 
f) centrifugar à baixa rotação (1.000 r.p.m) por 15 segundos; 
g) leitura: agitar levemente o tubo e observar se há aglutinaçaõ dos eritrócitos.
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Teste de Coombs direto (TAD)
Resultado: Negativo (SEM AGLUTINAÇÃO): significa que o sangue não tem anticorpos ligados aos eritrócitos; 
 Positivo (COM AGLUTINAÇÃO): significa que o sangue tem anticorpos contra os eritrócitos. 
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Fonte: https://goo.gl/5bHRC6
Fonte: Leite et al. 2011.
Indicações
Quando o paciente apresenta sinais sugestivos de anemia hemolítica, como cansaço incomum, falta de ar e icterícia, ou quando a hemoglobina e o hematócrito caem subitamente, podendo ocorrer após transfusão de sangue, ou quando um recém-nascido mostra sinais de anemia hemolítica.
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Diagnóstico
Anemia hemolítica auto-imune; 
Anemia hemolítica induzida por drogas; 
Eritroblastose fetal;
Mononucleose infecciosa;
Infecção por micoplasma;
Sífilis;
Leucemia linfocítica crônica;
Doença linfoproliferativa; 
Lúpus eritematoso sistêmico; 
outra condição reumatológica;
Reação transfusional.
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Citometria de fluxo
A citometria de fluxo é uma tecnologia que permite análise simultânea e multiparamétrica de células ou partículas em suspensão, avaliando-as individualmente. 
À medida que o fluxo de amostra passa por um ou mais feixes de luz (gerados por um ou mais lasers), o sistema óptico-eletrônico registra a forma como as estruturas dispersam a luz do laser incidente e captando as fluorescências emitidas. 
Assim, o equipamento obtém informações de diversos parâmetros, como tamanho relativo, complexidade interna e intensidades de fluorescências de cada célula ou partícula avaliada.
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Técnica
Um feixe de luz de um único comprimento de onda é direcionado a um meio líquido em fluxo. 
Um número de dectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC). 
Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, e os corantes químicos fluorescentes encontrados na partícula ou juntos a partícula podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz. 
Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada individual partícula. 
FSC correlaciona-se com o volume celular e SSC depende da complexidade interna da partícula (por exemplo: forma do núcleo, quantidade e tipo dos grânulos citoplasmáticos e rugosidade da membrana).
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Citometria de fluxo
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Fonte: https://goo.gl/k6fFK1
Fonte: https://goo.gl/YrhYpJ
Indicações
Quantificação de subpopulações linfocitárias;
Avaliação de eritrócitos;
Avaliação de plaquetas;
Imunofenotipagem;
Estudo da viabilidade celular;
Análise do ciclo celular;
Proliferação celular;
Detecção da produção de citocinas
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Diagnóstico
Acompanhamento de pacientes com HIV : Contagem de CD4;
Dinâmica da indução da resposta imune celular;
Imunologia: detecção ou identificação de subtipos de células implicadas na imunidade;
Oncologia: Detecção de célula patológica.
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Teste para anticorpos antinucleares
O FAN (fator antinuclear) são anticorpos contra os núcleos das células do indivíduo. O FAN não é um único anticorpo, ele é um conjunto de anticorpos contra diferentes estruturas das células. Existem vários tipos de FAN, cada um deles associado a um tipo de doença autoimune diferente.
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Indicações
O exame chamado FAN, sigla para fator antinuclear, é um teste habitualmente solicitado para os pacientes que estão com suspeita de uma doença autoimune.
Exemplo: 
Lúpus eritematoso sistêmico.
Artrite reumatoide.
Psoríase.
Hipotireoidismo (Tireoidite de Hashimoto).
Síndrome de Guillain-Barré.
Síndrome de Sjögren.
AHIM.
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Técnica
O exame de FAN é feito com amostras de sangue do paciente com suspeita de doença autoimune;
 Com um corante fluorescente o laboratório marca cada um destes anticorpos;
Depois, mistura-se este sangue em um recipiente com uma cultura de células do animal;
Se houver anticorpos contra estruturas das células do animal, estes irão se fixar às mesmas, tornando-as fluorescentes. 
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Fonte: https://imunologia96.wordpress.com/category/doencas-reumaticas/
Resultados
Se o auto-anticorpo for contra o núcleo das células, a imagem no microscópio será de vários núcleos fluorescentes. 
Se auto-anticorpo for contra o citoplasma das células, vários citoplasmas ficarão brilhando, e assim por diante. Se não houver auto-anticorpos, nenhuma parte das células ficará fluorescente, caracterizando um FAN não-reativo.
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Fonte: https://goo.gl/diFdaF
Imunofluorescência indireta- FAN REAGENTE
Teste para anticorpos antinucleares
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Fonte: https://goo.gl/c6ZAAL
Caso clínico
Fonte:http://www.infoteca.inf.br/conbravet/smarty/templates/arquivos_template/upload_arquivos/acervo/745.pdf
AHIM;
DAT OU Teste de Coomb’s;
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Descrição do caso clínico
Cão fêmea, Lhasa apso, 6 anos;
hiporexia e êmese, cio ha uma semana;
Exame clínico: prostração, abdomialgia, ausência de secreção vaginal, desidratação 7%.
1º suspeita: Piometra
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Exames Complementares:
Ultrassonografia: evidencias de piometra/hemometra e efusão peritoneal;
Hemograma e dosagem sérica: 
CK com[ ] normais;
ALT com[ ] normais;
Leucopenia;
Diferencial não realizada.
Procedimento adotado a partir dai:
laparotomia exploratória e OSH
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Durante o procedimento observou-se: hiperemia e petéquias nos órgãos da cavidade abdominal, peritônio e omento, além de líquido purulento livre, indicando mais uma vez piometra.
1º tratamento: antibioticoterapia, analgesia
2 primeiros dias houve melhora no estado clinico do animal;
3 dia, prostração
Novos exames realizados. Resultados:
Anemia arregenerativa normocítica;
Hipocromia;
Trombicitopenia
Leocograma com neutrofilia, eusinopenia e monocitopenia relativa;
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2º suspeita: hemólise, AHIM
Teste de Coomb´s: resultado positivo
Novo tratamento: corticoterapia e antibioticoterapia
30 dias após o animal teve seus parâmetros normalizados.
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Referências
BRITES. M. G. Trombocitopenia Imunomediada em cães – Revisão bibliográfica e relatos de casos. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Especialização em Análises clínicas veterinárias. Porto Alegre, 2007.
CÂMARA. B. Teste de Coombs direto. Disponível em: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/11/teste-de-coombs-direto.html. Acesso em: 04 mar 2018.
FRANCO. S. Fator antinuclear. Disponível em: http://www.sergiofranco.com.br/bioinforme/index.asp?cs=Imunologia&ps=fatorAntinuclear. Acesso em: 04 mar 2018.
LEITE et al. Anemia Hemolítica Imunomediada em cães-
relato de três casos. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 32, n. 1, p. 319-326, jan./mar. 2011
MARTINS. D.M. GAGLIANI. L.H. Importância da Citometria de Fluxo no Diagnóstico de Fluxo no Diagnóstico Diferencial das Leucemias. Revista UNILUS Ensino e Pesquisa, v. 5, n. 8, jan/jun. 2008.
PINHEIRO. P. Exame FAN (Fator antinuclear) – O que significa FAN positivo. Disponível em: https://www.mdsaude.com/2009/05/o-que-e-o-fan-fator-antinuclear.html. Acesso em 04 mar 2018. 
ROMAGNOLI. G. G. Citometria de Fluxo. Instituto de Biociências de Botucatu. Departamento de Microbiologia e Imunologia. 2013.
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