AULA 9

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AULA 9
Fase analítica
Microbiologia se baseia principalmente a parte de cultura, lâmina e sorologia para busca “indireta” do agente etiológico. 
A parte analítica que refere-se a cultura podemos citar sobre:
Parte química e física dos meios de cultura
A parte química inclui:
Micronutrientes: depende do patógeno que está causando a doença, por isso a importância da presunção do possível patógeno a partir do quadro clínico, história clínica, para que eu possa não inocular em tudo, mas direcionar essa amostra clinica para um meio de cultura diferencial ou seletivo, porque a partir desses eu posso impedir o crescimento de umas e favorecer o crescimento de outras. Por exemplo, o meio para seletivo para Staphylococcos (gram positivos) = é útil para isolar este agente mas também para inibir o crescimento de microbiota (Ágar manitol salgado).
O que é meio diferencial é seletivo, mas o que é meio seletivo não é diferencial. EMB (desdobramento do macConkey – meio diferencial e seletivo / indicador de pH: vermelho de metila. Libera-se ácidos pelo metabolismo da lactose que misturados com a cor do indicador de pH fica vermelho) tem eosina azul de metileno é selecionador e diferenciador de bactérias gram - , e impede o crescimento de gram +. Portanto importante para crescer enterobactérias, e diferindo-as em consumidoras de lactose ou não porque este meio não tem sacarose e sim lactose, diferente do mcConkey (tem mais açucares = sacarose. É um meio mais barato e rotineiro). No meio EMB aparecerá com verde brilhante para as bactérias que fortemente fermentam lactose (libera-se ácidos pelo metabolismo da lactose que misturados com a cor do indicador de pH fica verde), por conta do vermelho de fenol que é um indicador de pH e este abaixa pelo metabolismo da lactose, muito caracterizado por E. coli. E também caracterizado, mas menos, por Enterobacter, Klebsiella, e outros gram - , etc.
Macronutrientes: carbono, nitrogênio, oxigênio (tensões menores), hidrogênio. 
ÁGAR MANITOL SALGADO: Cresce gram + e prevalece o crescimento de S. aureus (Os outros Staphylococcos podem crescer também, mas cresce de forma mais modesta. No entanto, há uma diferença entre S. aureus e os outros Staphylococcos, pois o S. aureus fermenta fortemente o manitol – açúcar – e libera produtos de degradação que quando misturados com o vermelho de fenol dá a coloração amarela/ enquanto os outros Staphylococcos fermentam mais discretamente o manitol). Esse meio favorece o crescimento de S. aureus porque essas bactérias são halofílicas (podem crescer em grandes concentrações de sal).
ÁGAR SANGUE – muito utilizado. Meio complexo. NÃO-SELETIVO. Mas pode ser diferencial para Staphylococcos e Streptococcos bem como para diferenciar os próprios Streptococcos.
ÁGAR CHOCOLATE – muito usado para bactérias fastidiosas: neisserias, pneumococo e haemophylos influenza.
ÁGAR SS – Tenho verde brilhante que inibe o crescimento de outras bactérias gram - . No meio está o TISSULFATO DE SÓDIO que é consumido por algumas bactérias e outras não. As que consumem fazem liberar sulfeto de hidrogênio, fazendo com que apareçam como pontinhos pretos (SALMONELA) e as SHIGELLAS aparecem mais transparentes.
SORBITOL MACKONKEY – cresce patótipos de e. coli (EHEC; EPEC) 
MEIOS DE TRANSPORTE – Não é meio de cultivo, é o contrario. Manutenção de viabilidade pela manutenção de pH. Por vezes se usa também carvão ativado diminui a oxidação da amostra, diminuindo radicais livres.
Anaeróbios – Patógenos geralmente recuperados do ambiente. Exemplos: Stuart, Amies (evolução do Stuart) – A troca de sal orgânico por inorgânico. / Exemplos: Carry Blair - para fezes / CALDO TIOGLICOLATO – é o agente redutor que é adicionado a esses meios de transporte para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias.
FATORES RELACIONADOS À ADEQUADA CONFECÇÃO DO MEIO DE CULTURA; À ESTERELIDADE DO MEIO DE CULTURA (AUTO-CLAVE); TAMPÕES INVIABILIZADOS POR ALTAS TEMPERATURAS; TODOS OS EQUIPAMENTOS MONITORADOS REGULARMENTE; MEIOS VENCIDOS – E DESSA FORMA O INIBIDOR PRESENTE NO MEIO NÃO VAI ESTAR FUNCIONANDO NORMALMENTE, E ENTAO MEIOS SELETIVOS PASSAM A NÃO SELECIONAR MAIS. 
TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO 
A mais comum é a partir de uma alça de platina faz-se a técnica de esgotamento. Para isolar colônias. Só se estabelece as características macroscópicas da colônia quando se faz a técnica de esgotamento. 
Estrias superficiais – esteriliza no bico de busen, pega um pouco da amostra e faz as primeiras estrias (muitas colônias); depois esteriliza de novo, e faz novas estrias a partir da parte final do primeiro estriamento (vai ter mais ou menos colônias); esteriliza de novo e faz as ultimas estrias a partir da parte final do segundo estriamento (vai ter colônias isoladas).
Técnica da placa derramada – Utilizada em situações para anaeróbios, não há estriamento. Mistura a amostra clínica com o ágar na forma líquida (45ºC), pode misturar a amostra clínica pura ou em diluições (1 para 10/1 para 100/1 para 1000 - se dilui porque dependendo do teor de microorganismos presentes na amostra pura isso dificulta a contagem / melhor 10 a menos 2). Isso é homogeneizado em tubo e transferida para placa de petri (homogeniza) e deixar alcançar a temperatura ambiente (37ºC). Após preparação das placas e incubação (48h a 35-37 graus), as bactérias crescerão e estarão por todo o meio de cultura. Qual a função? Contar bactérias e não isolar. E. coli; anaeróbias.
 - Este meio é muito utilizado para doenças que precisam de um determinado numero de agente para caracterizar a doença. 
 - O calor de 42 graus não inviabilizaria as bactérias? Não. Porque as bactérias heterotróficas suportarão altas temperaturas, como E. coli e coliformes fecais como klebsiella, enterobacter.
* Técnica de inoculação de amostra em meios líquidos (caldo)/sólidos em tubos de ensaio.
Inoculação em caldo – enriquecimento. Procedimento: com alça de platina estéril, toco a amostra e inclino a 45 graus o tubo de ensaio com o caldo e toca-se pelas paredes em contato com o caldo, “desinclina” o tubo e homogeniza. Depois realiza-se o “shake” para aumentar a divisão das bactérias através do contato entre elas.
Inoculação em meio sólido – Com o tubo inclinado a 45 graus e com uma agulha esterilizada, toca-se a amostra que pode estar em caldo ou colônia (para as duas situações essa inoculação seria um sub-cultivo), penetra-se o meio de cultura sem tocar o fundo e retira a agulha pelo mesmo caminho para estudar a motilidade, depois faz um estriamento na calda de cometa.