aulatécnicas 2013

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS 
ESCOLA DE ENGENHARIA CIVIL 
ENGENHARIA AMBIENTAL E SANITÁRIA 
 
 
Disciplina BIOLOGIA GERAL 
 
Técnicas de Biologia Celular 
 
Profa. Katia Saavedra 
 
 
 
2013 
 
 
 
Métodos Tradicionais 
 
Métodos Moleculares 
 
 
 
 
CONTEÚDO 
Métodos de obtenção de culturas puras 
• É preciso uma cultura pura de uma única 
espécie para se estudar as características de 
um organismo. 
 
• É preciso encontrar um meio que permita o 
crescimento do organismo desejado. 
Métodos de obtenção de culturas puras 
• Cultura pura: cultura que contenha apenas 
uma única espécie de organismo. 
 
• Culturas mistas: culturas contendo diversos 
tipos de organismos. 
 
 
Meios de cultura 
• Meios de cultura naturais. 
• Para cultivar bactérias em laboratório: 
 -Necessidades nutricionais. 
 -Fornecer as substâncias necessárias ao meio. 
Tipos de meios 
• Meios em laboratório: meios sintéticos. 
 
• Meio sintético: meio preparado a partir de 
materiais de composição precisa ou bem 
definida. 
 
Tipos de meios 
• Meio complexo ou quimicamente não 
definido: 
 Aquele que contém determinados 
materiais conhecidos, mas que variam na 
sua composição química de partida para 
partida. 
• Contêm sangue ou extratos de carne, soja, 
levedura. 
Tipos de meios 
• Ingrediente comum: Peptona. 
• Peptona: produto da digestão enzimática 
das proteínas. 
• Fornece peptídeos que podem ser 
utilizados pelos microrganismos. 
Tipos de meios 
• Os meios complexos contêm oligoelementos 
e vitaminas em quantidades suficientes para 
permitir o crescimento de muitos 
organismos. 
• Exemplo: caldo nutritivo, meios de ágar 
solidificado. 
 
Meio seletivo 
 
• É aquele que favorece o crescimento de 
alguns organismos, mas suprime o 
crescimento de outros. 
 
Meio seletivo 
• Ágar MacConkey: 
 Contém cristal violeta e sais biliares que 
inibem o crescimento de bactérias Gram-
positivas, ao mesmo tempo que permitem o 
crescimento de bactérias Gram-negativas. 
Meio diferencial 
• Possui um constituinte que causa uma 
mudança observável no meio quando ocorre 
uma reação bioquímica específica (mudança 
de cor ou de pH). 
 
Meio de enriquecimento 
• Contém nutrientes especiais que 
permitem o crescimento de um organismo 
específico que não deva estar presente em 
número suficiente para permitir ser 
isolado e identificado. 
• Ele não suprime outros microrganismos. 
FUNGOS 
 
• Heterotróficos. 
• Saprófitas (matéria orgânica morta). 
• Mistura simples (açúcar, fonte de N 
• inorg. ou org. e minerais). 
• Vitaminas. 
• Outros meios complexos providos 
de peptona e extrato de carne . 
 
 
• Em geral necessitam: 
 
 [açúcar] = 4% 
 
• pH menor (3,8 a 5,6) 
• Bactérias (6,5 a 7,5) 
 
• Constatação em Meios Naturais 
 
 
• Bactérias: carne e leite. 
 
• Fungos: frutas cítricas, produtos de 
 padaria, geléias, compostas de 
 frutas. 
 
Composição do esgoto sintético 
 
 Nutrientes Quantidade (mg/L) 
 
 
Amido solúvel 476 
Extrato de carne 476 
Glicose 500 
Bicarbonato de sódio 400 
Óleo de soja 510 
 Detergente 30 gotas 
 Solução de sais 5,0 mL 
Composição da solução de sais para esgoto sintético 
 
Sais inorgânicos Quantidade 
 (g/L) 
 
 
NaCl 50,0 
MgCl2. 6H2O 1,4 
CaCl2. 2H2O 0,9 
 
 
PROTOZOÁRIOS 
 
• pH 6 a 8 
• Heterotróficos aeróbios. 
- Exigências nutricionais complexas 
 (variedade de aa, vitaminas e 
 carboidratos). 
 
Ex: Tetrahymena pyriformis 
 
• 10 aa 
• 7 vitaminas 
• Guanina 
• Uracila 
• Sais inorgânicos 
 
• Amebas: caldo peptonado simples. 
 
• Outros protozoários: emulsões de tecidos 
cerebrais, soro fetal de vitelo ou 
infusão de fígado. 
 
• Alguns protozoários: caldo nutriente + 
células bacterianas. 
 
• Paramecium: leite ninho 
 
 ALGAS (Fotoautotróficas) 
 
• Luz 
• CO2 + H2O 
• íons inorgânicos solúveis 
 
• Euglena: heterotroficamente no 
escuro com pequena variedade 
de substratos orgânicos. 
 
Controle de oxigênio no meio 
 
• O gás oxigênio é borbulhado através do meio 
ou dentro do ambiente de incubação com 
filtros entre a fonte de gás e o meio. 
 
 
Controle de oxigênio no meio 
 
• Para cultivar anaeróbios obrigatórios, todo o 
oxigênio deve ser removido e mantido fora 
do meio. 
 
• Adição de tioglicolato, aa cisteína, ou sulfeto 
de sódio, impede que o oxigênio cause 
efeitos tóxicos aos anaeróbios. 
Manutenção das culturas 
• Cultura de estoque: um organismo uma vez 
isolado pode ser mantido indefinidamente 
em uma cultura pura. 
• Para usá-la novamente: inocular em meio 
fresco. 
 
Manutenção das culturas 
• São mantidas produzindo-se subculturas 
em meio fresco a intervalos freqüentes, 
para se manter o crescimento dos 
organismos. 
 
 
 
MÉTODOS 
MOLECULARES 
Extração dos ácidos nucléicos 
(DNA) 
 Vários protocolos: 
 Química: detergente SDS. 
 Física ou mecânica : pérolas de vidro 
(glass beads). 
 Enzimática: lisozima. 
 Solução Tampão - manter o pH ótimo. 
 Centrifugação: 
-Separação dos outros componentes 
celulares. 
-Separação fase aquosa e orgânica. 
Extração dos ácidos nucléicos 
• Fenol - desnatura proteínas. 
• Clorofórmio - solubiliza lipídios e remove 
fenol. 
• Precipitação do DNA com etanol 100%. 
• Água estéril. 
 
Extração dos ácidos nucléicos 
• Visualização da extração do DNA - 
migração em gel de agarose. 
10000 
6000 
4000 
3000 
2000 
1000 
Extração dos ácidos nucléicos 
Reação em Cadeia da Polimerase 
(PCR) 
 É o método in vitro de síntese enzimática de 
uma seqüência específica de DNA. 
 Descoberto por Kary B. Mullis em 1983. 
  A série repetida de ciclos envolve: 
desnaturação do DNA, anelamento dos 
primers e extensão dos primers pela DNA 
polimerase. 
 São utilizadas duas seqüências de 
oligonucleotídeos (primers) que hibridam nas 
fitas opostas do DNA. 
PCR 
Função dos primers 
 Sintetizados quimicamente. 
 Entre 18 a 24 bases. 
 Define os limites do DNA alvo a ser 
amplificado. 
Características do PCR 
 Processo cíclico: 
•15 a 40 ciclos. 
•Realizado por mudanças de 
temperatura. 
 Específico 
 Sensível 
 Flexível 
Anelamento dos primers 
Extensão dos primers 
Molde 
Síntese de nova fita de DNA 
REQUISSITOS 
 DNA ou RNA molde. 
 DNA polimerase. 
 Primers. 
 dNTPs. 
CICLOS DE TEMPERATURA 
Desnaturação do DNA 
 94 a 100º C. 
 Desnaturar DNA alvo. 
Desnaturar produtos de ciclos prévios. 
 4 a 10 min. de desnaturação inicial. 
 Duração de 30 seg. a 1 min. 
Anelamento dos primers 
 40ºC a 70ºC. 
 Temperatura de “hibridização”. 
 Otimização da temperatura para cada par 
de primers. 
 Tipicamente 30 seg a 2 min. 
Extensão dos primers 
 72ºC. 
 Taq polimerase. 
Faixa de atividade:20ºC a 85ºC. 
Atividade varia 100x nessa faixa. 
 Tempo de extensão varia de acordo com tamanho do 
produto desejado. 
Inibidores do PCR 
 SDS 
 Fenol 
 Etanol 
 Isopropanol 
 Acetato de sódio 
 Cloreto de sódio 
 EDTA 
 Uréia 
PCR 
• Visualização do produto de PCR - 
migração em gel de agarose. 
2000 
1200 
800 
400 
200 
Considerações 
 Taq polimerase requer do extremo 3’ 
OH para iniciar a elongação da fita. 
 Faz a leitura da fita molde na direção 3’ a 
5’ , sendo assim a nova fita sintetizada na 
direção 5’ a 3’. 
Métodos baseados em PCR 
 Eletroforese em gel de gradiente desnaturante 
(DGGE). 
 Polimorfismo do comprimento dos fragmentos 
de restrição terminal (T-RFLP). 
 Análise de restrição do DNA ribossomal 
amplificado (ARDRA). 
 Análise do espaço intergênico ribossomal 
(RISA). 
 Para a sistemática microbiana, o PCR é o 
método básico para obter cópias de segmentos de 
DNA genômico para clonagem e seqüenciamento 
de genes utilizados na caracterização e 
identificação de microrganismos. 
IMPORTÂNCIA 
DGGE 
(Eletroforese em gel de gradiente desnaturante) 
DGGE 
 Método eletroforético originalmente 
desenvolvido para diferenciar mutações 
de uma base em genes homólogos 
amplificados. 
 Consiste na separação dos fragmentos do 
DNA de mesmo comprimento, mas com 
seqüências diferentes. 
 A separação se baseia no decréscimo da 
mobilidade eletroforética da fita de DNA. 
 Separa a fita de DNA baseando-se nas suas 
características de dissociação. 
DGGE 
Cuba de eletroforese 
 A temperatura em que o DNA se 
dissocia depende de sua seqüência. 
 Para ajudar na dissociação do DNA um 
agente desnaturante pode ser adicionado. 
DGGE 
 A temperatura em que o DNA se dissocia, na 
presença de um desnaturante, é dependente da 
concentração: 
• DNA na água dissocia-se a 90ºC 
• DNA na água + 10% desnaturante, 
dissocia-se a 80ºC 
• DNA na água + 40% desnaturante, 
dissocia-se a 60ºC 
DGGE 
 Tamanho do GC-clamp: 40 pb. 
 Separa somente 100-700 pb (limitação da 
matriz de poliacrilamida). 
DGGE 
1100FGC - 1400R 35-55% 968FGC -1392R 40-60% 
Perfil das bandas: Archaea e Bacteria 
DGGE 
VANTAGENS 
 Rápida comparação da diversidade da 
comunidade. 
 Rápida detecção na mudança da estrutura 
da comunidade. 
 Dominância. 
•Isolamento do fragmento de interesse - DNA 
  Produto do PCR 
•Junção dos fragmentos de DNA a um vector 
de clonagem pela ação da DNA ligase. 
  Plasmídeo 
 -Permitir a recombinação do DNA 
estranho. 
 - Fatores de resistência a antibióticos. 
Clonagem 
 Incorporação num hospedeiro. 
 -Transformação da célula ou por 
infecção da célula. Detecção e 
purificação do clone requerido. 
- - galactosidase - hidrolisa X-gal (azul). 
 
Clonagem 
Clonagem 
•Transfere a colônia em meio líquido. 
• Extração do plasmídeo - 
“minipreps”. 
• Verificação em gel de agarose. 
Clonagem 
• A seqüência dos nucleotídeos de um 
gene podem ser seqüenciados. 
Seqüenciamento 
• Método preciso e informativo para a 
identificação de bactérias. 
 
• Permite a identificação de 
organismos nunca antes cultivados 
em amostras complexas. 
 
• Trabalhoso, demanda tempo, 
equipamento e treinamento técnico 
especializado. 
 
Seqüenciamento 
• Os métodos de seqüenciamento baseiam-se 
na produção de fragmentos de DNA de 
comprimentos crescentes, que começam em 
um ponto comum e possuem um dos quatro 
tipos de nucleotídeos em suas extremidades 
terminais. 
 
Seqüenciamento 
• Método de terminação de cadeia: começa 
com a desnaturação do DNA que se quer 
analisar a fim de obter moléculas de uma 
única cadeia. 
• Os nucleotídeos são marcados com uma 
substância radioativa e o procedimento é 
realizado em quatro dispositivos. 
 
Seqüenciamento 
• A síntese das cadeias novas é interrompida 
em sítios específicos porque cada dispositivo 
contém um dos quatro nucleotídeos (ddATP, 
ddTTP, ddGTP, ddCTP). 
 
 
Seqüenciamento 
• Assim se produzem fragmentos de DNA de 
comprimentos crescentes. 
• Os fragmentos são revelados por 
radioautografia e a seqüência de DNA é lida. 
 
Seqüenciamento 
• Outra técnica muito mais rápida emprega 
fragmentos de DNA cujos últimos 
nucleotídeos são marcados 
fluorescentemente. 
• Aplica uma cor determinada a cada tipo de 
nucleotídeo. 
 
Seqüenciamento 
Sequenciamento 
• Determinação da seqüência de 
nucleotídeos de regiões definidas do 
genoma do microrganismo. 
• Alinhamento - eliminação das 
“quimeras” (programa SeqMan). 
• Banco de dados online NCBI-Blast. 
Os fragmentos de diferentes comprimentos migram no gel, os menores na 
frente. São iluminados por um feixe de laser e fluorescem quando 
atravessam a janela do feixe. Os géis têm sido substituídos por capilares 
preenchidos de polímero nas máquinas mais modernas. 
Seqüenciamento