AULA METODOLOGIA 2014

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TECNOLOGIA DA BIOLOGIA CELULAR 
E MOLECULAR 
Metodologia para estudar as células 
Como estudar as células 
 
MODELOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA 
Figure 1-9 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010) 
 Limites de resolução 
Olho humano 100m 
Microscópio óptico 0,25 m 
Microscópio eletrônico 0,0002 m 
MARCOS HISTÓRICOS DO USO DA MICROSCOPIA EM CÉLULAS 
1655 Hooke – Usou um microscópio primitivo para descrever pequenos poros em uma 
seção de cortiça que chamou de “células” 
1664 Leeuwenhoek – reportou a descoberta dos protozoários. Ele observou as 
bactérias pela primeira vez 9 anos mais tarde. 
1833 Brown - publicou suas observações microscópicas em orquídeas, descrevendo 
claramente o núcleo da célula 
1838 Shleiden e Schwann – propuseram a teoria celular afirmando que as células 
nucleadas são as unidades básicas dos tecidos animais e vegetais 
1857 Kölliker – descreveu a mitocôndria em células de músculo 
1879 Flemming – descreveu com grande clareza o comportamento dos cromossomos 
durante a divisão celular 
1881 Cajal e outros histologistas – Desenvolveram métodos de coloração que 
revelaram a estrutura das células nervosas e a organização dos tecidos neurais 
1898 Golgi - Viu pela primeira vez e descreveu o aparelho que leva o seu nome corando 
células com nitrato de prata 
1902 Boveri – Relaciona os cromossomos com a hereditariedade pela observação do 
comportamento destes durante a reprodução sexual 
1952 Palade, Porter e Sjöstrand – Desenvolveram métodos de microscopia eletrônica 
que permitem a visualização de muitas estruturas intracelulares pela primeira vez 
1957 Robertson – Descreveu a estrutura bilaminar da membrana celular, ME 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
Utilizado por Hooke para 
descrever a cortiça 
1940 – com desenvolvimento de novos microscópios, corantes, e 
novas metodologias para preservar os materiais permitiram 
observar diferentes estruturas celulares 
 Busca pelo conhecimento (curiosidade) 
 
 Aperfeiçoamento dos métodos de investigação 
 
 Avanço tecnológico 
I - FATORES QUE CONTRIBUÍRAM PARA O 
DESENVOLVIMENTO DA BIOLOGIA 
 
Zena Silva
Realce
Zena Silva
Realce
Microscópio óptico 
Importância 
Aplicações 
 
O limite de resolução (limite que dois objetos 
podem ser distinguidos) depende – 
 
1) da abertura numérica do sistemas de lentes 
2) do comprimento de onda da luz utilizada 
VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS 
1. Tamanho das células (10 a 20 m); 
 
2. Limite de resolução do olho 200 m; 
 
3. Limite de resolução do microscópio 
óptico 0,2 m 
 
4. Propriedade da luz 
 
 
 
 
 
 
PROPRIEDADES DA LUZ EMPREGADAS NA MICROSCOPIA 
MICROSCOPIA ÓPTICA 
“Objetos visualizados através de um comprimento de 
onda da luz visível” 
 
 
Parte mecânica (suporte) 
 
Parte óptica (condensador,objetiva e ocular) 
Resolução = 0,61 
n sin 
- comprimento de onda = 0,53 m 
n - abertura numérica da objetiva 
sin - seno de 180 = 1ou 1,4 
MICROSCÓPIO ÓPTICO 
CAMPO CLARO 
 
CAMPO ESCURO 
 
CONTRASTE DE FASE 
MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASE 
Utilizados para visualizar células vivas 
 
Este microscópio utiliza as diferenças de fases dos 
raios luminosos em diferenças de intensidade 
Tanto o microscópio de contraste de fase como o de 
fundo escuro permitem observar movimentos como no 
processo de mitose e migração celular 
MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA 
Detecção de proteínas especificas e outras 
moléculas. 
 
2 filtros – 1 filtra luz antes de atingir o objeto 
excitando o corante fluorescente. 
 
Outro filtra luz obtida do objeto bloqueando-a. 
Passa apenas ondas emitidas pelo corante 
fluorescente. 
Fluoresceína emite no verde quando excitada com a luz azul 
 
Rodamina emite no vermelho quando excitada com o verde-amarelo 
 
GFP 
MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA 
Microscópio de fluorescência 
MICROSCÓPIO DE 
FLUORESCÊNCIA 
MICROSCOPIA ELETRÔNICA 
VANTAGEM 
 
Contorna limitações da visão e microscópio óptico, 
aumenta o poder de resolução em virtude do 
comprimento de onda 
 
ENERGIA 
 
Feixe de elétrons – passa por uma série de bobinas, 
focalizados em uma tela fluorescente onde se forma a 
imagem. 
 
07/08 
Microscopia Eletrônica de Transmissão 
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA 
Examinar células intactas e tecidos 
Feixe de elétrons são espalhados pela superfície da amostra 
Fornece imagens tridimensionais da superfície celular. 
 
ESTÔMATOS 
OSTRACODA 
FORMIGA 
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO 
DE VARREDURA 
Microscópio de varredura 
Produz imagens tridimensionais da estrutura da superfície 
Os elétrons são espalhados pela superfície da amostra 
 Criofatura 
 
Congelamento da estrutura das moléculas individuais 
 
Proteínas são bem preservadas, mas a estrutura da célula não 
 
Permite a visualização do interior da membrana celular 
ETAPAS PARA CONFECÇÃO DE CORTES 
PERMANENTES 
1 - Fixação 
 
 1.1 - evita a autólise, 
 1.2 - impede proliferação de bactérias, 
 1.3 - endurece as células, 
 1.4 - aumenta afinidade pelos corantes. 
 
 Formol / Aldeído glutárico/ Tetróxido de ósmio / Glutaraldeído 
 
2 - Desidratação 
 
 2.1 - Retirar água das células, 
 2.2 - Banhos de álcool. 
 3 - Inclusão 
 
3.1 - Proteção do material biológico, 
 
3.2 - facilitar o corte no micrótomo. 
 
 Parafina, Resinas plásticas (araldite, epon) 
 
4- Microtomia 
 
4.1. Micrótomo convencional – microscopia óptica 
 
4.2. Ultra-micrótomo 
 
4.3. Criomicrótomo – cortes a frio e não fixados (permite análises sem 
fixação dos tecidos) 
 
ETAPAS PARA CONFECÇÃO DE CORTES 
PERMANENTES 
CONFECÇÃO DE BLOCOS DE PARAFINA 
MICROTOMIA 
ESPESSURA DAS SECÇÕES 
MICROSCOPIA ÓPTICA = 1 a 6 m 
MET = 20 a 100 nm 
5 – Coloração 
 
 5.1 - Tornar visível os componentes celulares 
 
 5.2 - Tipos de Corantes: 
 
 Básicos – cromóforos combinam-se a grupamentos ácidos. 
DNA, RNA basófilos. 
Ex: Azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina 
 
Ácidos – cromóforos combinam-se a grupamentos básicos. 
Proteínas citoplasmáticas acidófilas. 
Ex: Eosina, fucsina ácida, Orange G 
 
 5.3 – Contraste – metais pesados (sais de chumbo e uranila) 
 
6 – Montagem da lâmina 
ETAPAS PARA CONFECÇÃO DE CORTES 
PERMANENTES 
CITOQUÍMICA 
 
Importância 
 
Pode ser aplicada tanto no microscopia óptica como eletrônica 
 
Citoquímica in situ e extra situ 
 
Imunocitoquímica 
 
Localização intracelular de proteínas específicas 
 
Baseia-se na reação antígeno-anticorpo 
 
Imunocitoquímica: direta ou indireta 
1 - Conjugação do anticorpo e do antígeno com uma enzima como a 
peroxidase, fosfatase alcalina,e outras. 
2 - Este anticorpo conjugado a enzima pode ser utilizado em 
ensaios diretos e indiretos 
3 – O antígeno associado a placa pode ser detectado (revelado) 
através de um anticorpo anti-antígeno marcado (ELISA direto) ou se 
utilizando um anticorpo primário anti-antígeno e um anti-primário 
marcado (ELISA indireto). Este segundo permite uma amplificação 
do sinal 
4- Revelado a reação enzimática a reação poderá ser vista medindo a 
intensidade óptica (DO) utilizando um espectrofotômetro. 
IMUNOCITOQUÍMICA - MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO 
RADIOAUTOGRAFIA 
 
 
Técnica citoquímica in situ aplicada para detectar presença de 
isótopos radioativos 
 
Os isótopos emitem raios gama, alfa, beta podem ser seguidos porum contador geiger ou cintilador 
 
II – MÉTODOS, TÉCNICAS E APLICAÇÕES 
 Microscopia Óptica – descoberta da célula 
 Citoquímicas - localizar, identificar 
estruturas/moléculas. 
 Microscopia Eletrônica - pormenores da célula 
 Métodos de Separação - células, organelas e 
moléculas 
 Cultura de Células – compartimentos celulares, 
constituintes e respectivas funções 
 DNA recombinante – manipulação do genoma 
FRACIONAMENTO DE CÉLULAS EM ORGÂNELAS 
 
Utilidade 
 
Análise das moléculas baseado nas propriedades 
químicas, físicas e biológicas, 
ETAPAS PARA O ROMPIMENTO DE CÉLULAS 
ROMPIMENTO DE CÉLULAS - 
Choque osmótico, vibração ultra-sônica e aparelhos tipo 
liquidificador. 
 
FORMAÇÃO DE HOMOGENATO – partículas ligadas a MP com 
tamanho, carga e densidade distintas. 
 Fracionamento celular 
 
•Claude e Duve em 1940 
 
•Separar componentes da célula com base no tamanho 
e densidade celular 
 
- ruptura da membrana plasmática 
- série de ultracentrífugação 
TÉCNICAS DE SEPARAÇÃO 
Ultracentrifugação – separa os componentes da célula 
com base no seu tamanho, forma e densidade. 
 
Centrifugação normal – separa os componentes que 
diferem marcadamente em tamanho. 
Zena Silva
Retângulo
Coeficiente de centrifugação
Centrifugação fracionada ou diferencial 
Organelas maiores e mais densas sedimentam primeiro. 
Centrifugação velocidade de sedimentação 
Depende do CS (tamanho, forma e densidade) de cada componente. 
Gradiente de sacarose 
Centrifugação sedimentação de equilíbrio 
Sedimentação depende 
da densidade. Partícula 
para no local onde há 
equilíbrio 
SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFIA 
Utilidade – Identificar o tipo de proteína de uma determinada célula e/ou 
organela. 
TÉCNICAS DE ISOLAMENTO PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFIA 
Mistura de proteínas passada 
em coluna com matriz porosa 
que interage com as proteínas 
de forma diferencial. Velocidade 
de migração varia conforme 
interação de cada proteína com 
a matriz. 
Cromatografia em coluna 
Cromatografia de troca iônica 
Proteínas são separadas 
conforme sua carga elétrica na 
superfície. 
Cromatografia de filtração em gel 
Proteínas migram com velocidade 
variável conforme seu tamanho e 
forma. Matriz tem forma de 
peneira. 
Cromatografia de afinidade 
Proteínas se ligam a grupos 
químicos específicos ou 
particulares. 
DETERMINAÇÃO DO TAMANHO E DA COMPOSIÇÃO DE 
SUBUNIDADES DE PROTEÍNAS 
Eletroforese em gel de 
poliacrilamida (SDS – PAGE) 
 
- Baseada na carga líquida das 
proteínas (positiva ou negativa) 
em função dos Aas que as 
compõem. 
- Massa molecular da proteína. 
ETAPAS PARA DA ELETROFORESE 
1)DESDOBRAMENTO EM CADEIAS - detergente sódio dodecil sulfonato 
que se liga às regiões hidrofóbicas, desdobra as proteínas em cadeias 
polipeptídicas. E neutraliza as cargas + das proteínas. 
 
2) ROMPIMENTO DAS LIGAÇÕES DISSULFETO- -mercaptoetanol. Destroi 
a forma original da proteína. 
 
3) MIGRAÇÃO DAS MOLÉCULAS PROTÉICAS 
Mistura sobre o gel e submete-a a um campo elétrico. proteínas migram 
para o pólo + e a velocidade depende do tamanho da molécula de 
cada cadeia polipeptídica. 
 
ELETROFORESE 
ELETROFORESE 
WESTERN BLOTTING 
1. Eletroforese 
2. Transferência da proteína do gel para uma 
membrana 
3. Incubação com anticorpos 
4. Revelação 
SDS-PAGE Western blot 
SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS POR 
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL 
050813 
Propriedades: Carga + massa molecular 
COMO RESOLVER OU CONHECER A ESTRUTURA PRIMÁRIA, 
SECUNDÁRIA, TERCIÁRIA DE UMA PROTEÍNS EXTRAÍDA DAS 
CÉLULAS? 
SEPARAÇÃO E ANALISE DE AMINOÁCIDOS 
 
Utilidade 
 
Determinação da seqüência de 
proteínas ou de cadeias polipeptídicas 
ETAPAS PARA A DETERMINAÇÃO 
LIBERAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DO Aa AMINO-TERMINAL DA CADEIA – 
 
Composto químico liga-se covalentemente ao grupamento amino-livre 
do amino-terminal do peptídeo, ativado o mesmo cliva a ligação 
peptídica e libera o Aa – 
Figure 4-45 (part 1 of 2) Essential Cell Biology (© Garland Science 2010) 
Figure 4-46 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010) 
CRISTALOGRAFIA DE RAIO X E RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 
ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DAS PROTEÍNAS 
Cultura de células 
Técnicas do DNA recombinante 
Extração de DNA Analisar por clonagem 
Analisar por shouthern blot 
Analisar por PCR 
Extração de RNA 
Northern blot 
RT-PCR