Aula Biomol I

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BIOLOGIA MOLECULAR I
ESTRUTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS E ORGANIZAÇÃO DO GENOMA EUCARIOTO
Gizelle Zenker Justo
Ácidos nucleicos são polímeros: de unidades complexas chamadas nucleotídeos. Os nucleotídeos são constituídos por: base nitrogenada, uma pentose (açúcar) e um fosfato. A molécula sem o grupo fosfato é chamada de nucleosídio. 
 
Nos desoxirribonucleotídeos o grupo –OH no C2’ (em vermelho) é substituído pelo –H. A versatilidade dos RNAs dependem deste grupo no C2’.
As hidrólises dos nucleosídios trifosfatos fornecem energia química para direcionar reações celulares: ATP (adenosina 5’-trifosfato, mais usado), UTP, GTP e CTP. Além de funcionarem como precursores ativados da síntese de DNA e RNA.
Formação da cadeia polinucleotídica: 
 Os nucleotídeos podem ligar-se por reações de condensação que se designam por ligações fosfodiésteres. Eles são unidos covalentemente por ligações fosfodiésteres entre o grupo 5’-hidroxila de uma pentose e o grupo 3’-hidroxila da seguinte.
As ligações fosfodiésteres oferece à cadeia de acido nucleico uma polaridade especifica e extremidades 5’ e 3’ distintas, ou seja, cada fita possui uma polaridade determinada pelo grupo funcional que ela carrega.
Bases: são derivadas de compostos parentais:
Pirimidina: Adenina (Adenina) e Guanina (G)
Purina: Citosina (C), Uracila (U) e Timina (T). 
Características das moléculas: são receptoras de elétrons; hidrofóbicas e relativamente insolúveis em água no pH próximos à neutralidade da célula. 
Interações entre as bases: interações por pontes de hidrogênio entre pares de base complementares envolvendo os grupos amino e carbonila, que permitem uma associação complementar de duas (ocasionalmente três ou quatro) fitas de ácido nucleico. As interações hidrofóbicas de empilhamento, que provoca torção; elimina espaços entre as bases e exclui a moléculas de água do interior. Desempenham um papel importante na estabilização das estruturas tanto do DNA como do RNA: contribuem para a estabilidade da dupla hélice (as bases púricas e pirimídicas de ambas as fitas estão empilhadas dentro da dupla hélice com suas estruturas hidrofóbicas e perpendiculares ao longo do eixo). 
ESTRUTURA DO DNA
Os espaçamentos diferentes entre as moléculas de açúcares geram os sulcos maiores ou menores, ou seja, a hélice de DNA tem cavidades (Sulcos) de diferentes tamanhos, e quanto maior o sulco, o torna mais acessível às interações com proteínas que reconhecem sequências específicas do DNA.
o DNA celular é extremamente compacto e possui alto grau de organização estrutural
O DNA é uma molécula flexível. A variação estrutural do DNA confere à molécula diferentes conformações possíveis da desoxirribose, a rotação sobre as ligações contíguas que fazem o esqueleto fosfodesoxirribose e a rotação livre sobre a ligação C-1’N-glicosidica.
Estrutura de um ácido nucleico: Primária é a sequência de nucleotídeos e sua estrutura covalente. Secundária, O DNA pode assumir qualquer estrutura estável regular (dupla hélice) e Terciária, o complexo de enovelamento do cromossomo dentro da cromatina eucariótica e no nucleóide bacteriano (zona nuclear que contem o cromossomo mas não possui membrana envoltória).
Regras de Chargaff: foram cruciais para o modelo de Watson e Crick.
A composição de bases de DNA varia de uma espécie para outra;
A composição de bases do DNA de uma mesma espécie não se altera coma idade do individuo, estado nutricional ou alteração ambiental;
Em todos os DNAs celulares, o número de A=T e o número de G=C.
Modelo de Watson e Crick (a estrutura também é conhecida como forma B):
A estrutura do DNA é uma hélice de dupla fita, antiparalela, para a direita. O modelo tridimensional consiste de duas cadeias helicoidais de DNA em volta do mesmo eixo para formar uma dupla hélice com o sentido da mão direita;
No padrão de pareamento, três pontes de hidrogênio podem ser formadas entre G e C (G≡C), mas apenas duas podem ser formadas entre A e T (A  T) outros pareamentos são possíveis, mas tendem (em graus variáveis) a desestabilizar a estrutura da dupla hélice;
As duas cadeias polinucleotídicas da dupla hélice são complementares.
Conformações do DNA: formas B, A (11pb) e Z (zig-zag, 12pb), sendo a estrutura B, com 10,5 pb, a forma mais estável para uma molécula de sequência aleatória do DNA sob condições fisiológicas.
Sequências de DNA: palíndromo e espelho repetido 
Pareamento Hoogsteen: não são do tipo Watson e Crick e permitem a formação de DNA Tríplex, com duas fitas de pirimidinas e uma fita de purina, ou ao contrário. São mais estáveis em pH baixo porque a trinca G≡C ⋅C+ requer uma citosina protonada.
A dupla hélice do DNA e RNA pode ser desnaturada. Soluções de DNA nativo são altamente viscosos em pH 7 e à temperatura de 25°C. 
Desnaturação: concentrações salinas, extremos de pH e temperatura podem ocasionar a desnaturação (melting) ou fusão da dupla hélice do DNA. O rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases pareadas, das interações hidrofóbicas (empilhamento de bases) produz um desenovelamento da dupla hélice formando fitas únicas, completamente separadas. mas nenhumas das ligações covalentes são rompidas. 
Renaturação: é um processo de reenovelamento ou anelamento produzindo um duplex intacto. Ocorre em uma etapa ou duas (para fitas totalmente separadas), quando o pH ou temperatura retornam às condições biológicas dos organismos.
Cada espécie de DNA possui uma temperatura de desnaturação característica, ou ponto de fusão (tm): quanto maior o conteúdo de bases G=C, maior o ponto de fusão do DNA, isso porque pares de bases G=C, com três pontes de hidrogênio requerem maior energia térmica para dissociar. 
Efeito da desnaturação: produz o aumento na absorção da luz UV, efeito hipercrômico. a interação entre as bases empilhadas em um ácido nucléico tem o efeito de diminuir a sua absorção de luz em reação a mesma concentração de uma solução com ácidos nucleicos livres. e a absorção é diminuída mais ainda quando duas fitas complementares estão pareadas, efeito hipocrômico.
A transição de um DNA de fita dupla a uma forma desnaturada de fita única pode ser detectada pelo monitoramento da absorção de Luz. Absorção de luz do DNA 260nm.
Superespiralamento do DNA é a manifestação de uma tensão estrutural e uma propriedade intrínseca da estrutura terciária: O DNA é espiralado na forma de uma dupla hélice, com ambas as fitas do DNA espiraladas em volta de um eixo. O espiralamento desse eixo produz o superespiralamento. Quando não há nenhuma curvatura no eixo sobre si mesmo, o DNA é dito estar em um estado relaxado. A tensão é resultado do subenovelamento da dupla hélice do DNA em um circulo fechado. 
O espiralamento do DNA requer menos energia que a quebra das pontes de hidrogênio que estabilizam os pares de bases.
Efeitos do subenovelamento: a redução de uma volta induz a tensão estrutural – superespiralamento, logo o DNA possui menos voltas helicoidais; o DNA acomoda um maior numero de bases por volta; o estado de tensão resultante representa uma forma de armazenar maior energia; torna mais fácil separar as fitas de DNA, dando acesso às informações. Promoção de DNA cruciformes (trechos de DNA Z).
O subenovelamento é definido pelo link number da topologia: o numero de ligações (Lk) pode ser definido como numero de vezes que a segunda fita de DNA cruz a outra. DNA circular: relaxado (LK0) é usado como referência. Então, o subenovelamento em termos de alteração pode ser descrito pela equação: ΔLk = LK – LK0
Topoisômeros: são isômeros, ou seja, as duas formas diferentes que a molécula de DNA circular, fechada, pode assumir, as quais diferem apenas no seu numero de ligação: superespiralamento positivo e negativo. 
Topoisomerases I e II: são as enzimas responsáveis por hidrolisar (catalisar) superespiras de DNA duplex circulares, fechados, ou seja, aliviar a tensão da alfa hélice conforme aumenta ou diminui o numero de voltas (subenovelamento + ou-). Classe I promove a quebra de fita simples para que haja a formação de uma nova abertura ou a condensação das hélices, e a classe II promove clivagem de duas fitas de DNA.
ESTRUTURA DO RNA 
RNA é um polímero de fita simples de subunidades de nucleotídeos unidos entre si por ligação fosfodiéster e estrutura randômica; possui um grupo hidroxila no C2’ da aldopentose e uracila em vez de Timina como no DNA.
Pareamento padrão do RNA: G pareia se com C e A pareia-se com U. AMP, UMP, GMP e CMP são seus nucleosídios.
Estruturas de fitas simples se dobram em uma variedade de motivos estruturais secundários (dupla hélice) estabilizadas por pareamentos de bases segundo Watson-Crick. Os duplex de DNA são mais estáveis que de DNA
Hélices de RNA contêm pares de bases incomuns, como GU Wabble, GA imino;
Hélices de RNA contêm bases triplas as quis são importantes para o auto-dobramento das moléculas.
O RNA não fica livre em fita simples na célula, pois seria muita fácil sua degradação por hidrólise;
É responsável pelo armazenamento e transmissão da informação, quanto catálise.
Tipos de RNA
mRNA: completamente processado com adição de uma extremidade 5´CAP e da cauda de poli-A para funcionalidade do mRNA. Cópia da sequencia do DNA gnômico responsável por transferir (codificar) a informação genética do DNA (núcleo) aos ribossomos para a síntese das proteínas (citoplasma).
tRNA: possui estrutura cruciforme e fita simples, podendo existir pares de bases nitrogenadas intra-cadeias. Reconhecem a informação codificada pelo mRNA e transferem o aminoácido apropriado ao ribossomo (citoplasma) para a síntese proteica pela interação entre anticódon do tRNA e o códon do mRNA; 
rRNA: componente do ribossomo que pode ter atividade catalítica;
snRNA – pequenos RNA nucleares: participam do splincing do pré-mRNA (remoção dos íntrons) 
sncRNA: papel no processamento do rRNA, direcionam a clivagem da cadeia de RNA e a modificação de bases durante a maturação das moléculas de rRNA.
miRNA: formam pares de bases amplamente mas não completamente com moléculas de mRNA, inibindo a tradução de mRNA alvo
Os RNAs possuem coeficiente de sedimentação (S), conforme a densidade ou gradiente de sedimentação
Muitas funções do RNA estão associadas à proteínas: complexo RNA-proteína ou ribonucleoproteína (RNP).
O RNA pode parear com regiões complementares, quer do RNA ou do DNA. 
VIAS DA INFORMAÇÃO 
 						 O esclarecimento de como a informação no DNA é convertido em proteínas funcionais veio com a descoberta tanto do RNA mensageiro quanto do RNA de transferência e com a decifração do código genético – dogma central
ORGANIZAÇÃO DOS CROMOSSOMOS
Genes são segmentos de um cromossomo que contém a informação para um polipeptídio funcional ou uma molécula de RNA. Possuem íntrons, éxons, região promotora e enhancers, que são sequências do DNA que funcionam como ativadores, que sinalizam quando o gene deve ser transcritos.
O material genético dos eucariotos está distribuído nos cromossomos, moléculas de ácido nucleico que são o repositório da informação genética. Uma célula somática humana possui 46 cromossomos. Cada cromossomo de uma célula eucariótica contém uma única molécula de DNA duplex muito longa. O DNA de um genoma humano contém 22 pares mais os cromossomos sexuais X e Y, estendido tem cerca de 1m. A maioria das células humanas é diploide e cada célula contém um total de 2m de DNA.
Muitos genes nas células eucarióticas e uns poucos nas bactérias possuem elementos estruturais importantes: suas sequências nucleotídicas são interrompidas por sequencias não codificadoras, chamadas íntrons, que não codificam uma sequência de aminoácidos no produto polipeptídico. E os segmentos codificadores separados por íntrons são chamados de éxons.
Outros tipos de sequências no genoma humano: 
Transposon (elementos transponíveis) que incluem os LINEs (Long interspersed elements), SINEs (Short interspersed elements), sequências Alu (assim chamadas, pois inclui uma cópia de sequência de reconhecimento para Alul, uma endonuclease de restrição) e transposons do tipo retrovírus; éxons (sequências codificadoras); sequências miscelâneas que incluem as sequencias e repetições simples (SSR, ou DNA satélite ou DNA simples) e grandes duplicações segmentárias (SD), etc.
Cromossomos eucarióticos possuem duas importantes sequências repetitivas de DNA: centrômeros que são os pontos de fixação para o fuso mitótico e os telômeros, localizados nas extremidades dos cromossomos que ajudam a estabilizá-los, são sequencias curtas de cópias repetidas de uma sequência de oligonucleotídeos.
Nas células eucarióticas que não estão se dividindo (em G0) e naquelas na interface (G1,S e G2), o material cromossômico, a cromatina, está amorfo e parece estar dispersa no núcleo. Na fase S da interfase, o DNA nesse estado amorfo se replica, cada cromossomo produzindo pares de cromátides-filhas. Os cromossomos tornam-se mais condensados durante a prófase mitose, tornando os pares de cromátides-filhas especificas. 
Cromatina consiste de DNA e proteínas, ao lado de uma porção de RNA: está fortemente associada às histonas (família de 5 proteínas básicas) que associam fortemente com o DNA, empacotando-o e organizando-o em unidades estruturais sucessivas chamadas de nucleossomos ( consiste de uma fita de DNA embrulhada em volta de um núcleo de histona), e outras proteínas como coensimas. Na cromatina, há uma região mais densa (heterocromatina) e outra menos densa (eucromatina).
As histonas contêm um alto teor de arginina e lisina, variam entre si em relação massa molares e conteúdo de aminoácidos. Possuem um domínio C-terminal onde ocorrem interações H-H e H-DNA, e no domínio N-terminal contendo resíduos de Lys carregados. Elas se ligam à regiões especificas no DNA, ricos em pares A=T, compactando o DNA.
A eucromatina se refere a um local do DNA onde os genes estão ativos e está aberta e acessível ao RNA, auxiliando na síntese do mesmo. Ela está desenrolada e o material genético consegue ter muito contato com as enzimas. Já a heterocromatina está ligada a genes inativos, pois o DNA não encontra uma quantidade necessária de superfície para manter contato com as substâncias.
REPLICAÇÃO DO DNA 
Leny Toma
O mecanismo de replicação está baseado no pareamento de bases da dupla hélice do DNA. A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases.
Características: precisão da sequencia de bases, permitindo que a maioria dos seres vivos transmitam informações genéticas precisas de uma geração a outra, além de evitar que as alterações nas células somáticas originem doenças ou mutações.
Modelos propostos: semiconservativo, conservativo e disperso (não se aplica biologicamente). Mas Watson e Crick comprovaram a hipótese da replicação semiconservativa pelo experimento de Meselson e Stahl.
A replicação do DNA é semiconservativa: cada fita do DNA (dupla hélice) atua como um molde para a síntese de uma nova fita complementar, produzindo duas novas moléculas de DNA, cada uma com uma fita nova e uma fita velha.
O novo DNA é feito por enzimas denominadas DNA polimerases, que necessitam de um molde e um primer (iniciador) e sintetizam DNA na direção 5' para 3', ou seja, adicionam nucleotídeos na extremidade 3' – OH de uma fita de DNA que se encontra emparelhada a cadeia molde	. Elas revisam (ou conferem) seu trabalho, removendo a maior parte dos nucleotídeos erroneamente adicionados à cadeia.
Durante a replicação do DNA, uma nova fita (fita líder) é feita como uma peça contínua. A outra (fita atrasada) é feita em pequenas partes. 
A replicação do DNA requer outras enzimas além da DNA polimerase, incluindo DNA primase, DNA helicase, DNA ligase, e topoisomerases.
MECANISMO 
Etapas da duplicação do DNA:
Abertura das fitas do DNA através da formação da zona de replicação
Elongação das fitas por síntese bidirecional: síntese da fita líder e atrasada
FinalizaçãoA replicação inicia na origem e prossegue bidirecionalmente: A origem de replicação (OriC) é um sitio específico onde as fitas do DNA parental são desenoveladas (abertas) pelas enzimas que reconhecem esse sitio, conforme o DNA se abre são formadas as forquilhas de replicação, onde as fitas são separadas e replicadas simultaneamente. O segmento de DNA que se replica a partir de uma origem de replicação é denominado replicon. Assim, o cromossomo das bactérias contém um único replicon, enquanto os cromossomos dos organismos eucarióticos contêm vários e a replicação inicia na fase S.
A iniciação é afetada pela metilação do DNA e por interações com a mebrana plasmática: o DNA OriC é metilado pela Dam metilase.
A síntese do DNA prossegue emuma direção 5’→3’ e é semidescontínua: a fita descontínua (atrasada) é sintetizada em pedaços curtos – fragmentos de Okasaki – e é aquela em que a síntese 5’ →3’ prossegue na direção oposta a forquilha de replicação. E a fita líder, é aquela que a síntese 5’ →3’prossegue na mesma direção da forquilha.
O DNA é sintetizado pelas DNAs polimerases: A E. coli possui pelo menos cinco DNA polimerases, sendo a Polimerase III, principal enzima (haloenzima) da replicação em E. coli. A pol II envolvida no reparo do DNA. Somente a DNA polimerase I tem atividade exonuclease 5’→3’.
Para que a polimerase III do DNA comece uma polimerização é necessário primers de RNA, que são responsáveis por catalisas a síntese de um pequeno fragmento de RNA sobre a cadeia molde do DNA, o qual atua como iniciador para a polimerase III do DNA adicionar desoxirribonucleotídeos.
A DNA polimerase possui atividade nucleásica revisora; A atividade exonuclease 3’ → 5’ remove o nucleotídeo despareado recém sintetizado (em procarioto).
A replicação requer outras enzimas e fatores proteicos: o complexo formado por diversas enzimas e proteínas que promovem a síntese de DNA na forquilha é chamado de replissomo:
DnaA: reconhece sequencias ori; abre o duplex em sítios específicos na origem
 DnaB (helicase): promovem o desenrolamento da hélice e separação das cadeias polinucleotídicas, usando a energia química do ATP;
DnaC: requerida para ligação da DnaB na origem
Topoisomerases (II): são enzimas que aliviam o estresse topológico na estrutura helicoidal criado pela separação das fitas. 
Primase (DnaG): são enzimas que catalisam a síntese dos primers de RNA, mas ao final os primers são removidos e substituídos pelo DNA.
RNAse H: identifica e remove cada iniciador (primer) de RNA, pois é uma enzima que degrada híbridos de DNA/RNA.
Dna ligase: é responsável por selar os cortes (que é o substrato para a atividade de uma DNA polimerase I) no esqueleto do DNA na forma de uma ligação fosfodiéster gerados pela remoção dos primers.
SSB: proteínas ligantes responsáveis por manter separadas as cadeias.
Replicação em eucariotos: a replicação nos cromossomos nucleares envolvem a DNA polimerase α em associação com a polimerase δ (principal para a replicação). A polimerase ԑ substitui em algumas situações a δ, como no reparo do DNA e pode funcionar na remoção dos iniciadores dos fragmentos Okasaki na forquilha.
PCNA: uma proteína chamada de proliferating cell nuclear antigen, encontrada em grandes quantidades no núcleo das células de proliferação que estimula a atividade da Polimerase δ. Sua estrutura e função são semelhante a subunidade β da DNA polimerase III da E. coli, formando uma braçadeira circular que amplifica a processividade da polimerase.
A replicação requer fatores proteicos: RPA (proteína de replicação A), uma proteína eucariótica de ligação ao DNA de fita simples equivalente em função à proteína SSB da E. coli. RFC (fator de replicação C), um posicionador da braçadeira para a PCNA e facilita a montagem de complexos de replicação ativos.
A terminação em eucariotos lineares envolve a síntese dos telômeros nas extremidades de cada cromossomo. Portanto, além dos do molde e primers, a replicação do DNA em eucariotos requer a extremidade de uma molécula de DNA linear. Essas extremidades não são facilmente replicadas pelas DNA polímeras e, portanto sem um mecanismo especial para a replicação das extremidades, os cromossomos seriam de alguma forma encurtados a cada geração celular, sendo assim necessitam de enzimas que adicionam os telômeros às extremidades – telomerases
TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO DO RNA
Cida Pinhal
MECANISMOS DA TRANSCRIÇÃO
Diferença entre replicação e transcrição: na replicação todos os genes são copiados, na transcrição nem todos os genes são necessariamente transcritos. A RNA polimerase reconhece uma região específica do DNA para iniciar a transcrição do gene especifico, ou seja, ela sintetiza somente proteínas que exercerão função naquela região. Embora o DNA de todas as células seja iguais, o que difere cada uma delas é a sintetize de RNA. 
O processo de síntese (transcrição) de RNA ocorre no núcleo assim como o processamento, e posteriormente são transferidos ao citoplasma para se tornarem moléculas ativas (proteínas)
A síntese (transcrição) ocorre no sentido 5’→3’, ou seja, se um novo nucleotídeo for incorporado à fita sintetizada, ele vai ser incorporado na extremidade 3’, e não na 5’ onde tem um grupamento de fosfato livre.
A transcrição é catalisada pela RNA polimerase II dependente de DNA, que usa ribonucleotídios 5’-trifosfatos para sintetizar o RNA complementar à fita molde do DNA duplex. Ao contrário das DNA polimerases, as polimerases do RNA não requer um iniciador para iniciar a síntese, são capazes de iniciar uma nova cadeia de RNA a partir de um molde de DNA. Os procariontes possuem apenas um tipo de polimerase do RNA, enquanto os eucariontes possuem três:
RNA polimerase I: está presente no nucléolo e sintetiza essencialmente os rRNAs;
RNA polimerase II: está no nucleoplasma, e é responsável pela transcrição dos mRNAs e sintetiza um RNA pequeno (snRNA) – regula o processamento 
RNA polimerase III: sintetiza os tRNAs e 5S RNA
Diferenças de nucléolo e nucleoplasma: Densidade de material genético. O nucléolo é uma estrutura densa corada no núcleo das células eucarióticas, onde encontramos rRNA (transcritos primários) e RNA polimerase; e o nucleoplasma é a porção do conteúdo celular envolto pela membrana nuclear onde encontra se os nucleotídeos trifosfatos, fitas de DNA e fitas de RNA sendo transcritos, etc.
A RNA polimerase usa uma das fitas de DNA (a fita molde) como uma referência para fazer uma molécula de RNA nova, complementar.
A RNA polimerase não apresenta um sítio catalítico exonucleasico 3’ →5’ separado para a revisão (como apresentado nas DNA polimerases)
O processo de transcrição pela Pol II pode ser descrito nas fases de montagem, iniciação, alongamento e terminação associados com proteínas características.
O produto da transcrição do DNA é sempre um RNA de fita única: mRNA, rRNA ou tRNA. A fita única tende a assumir uma conformação helicoidal de mão direita, dominada por interações empilhamento de bases que são mais fortes entre purina-purina. 
Nas bactérias, o mRNA é transcrito e traduzido em um único compartimento celular e os dois processos ocorrem simultaneamente. Na célula eucarionte, a síntese e a maturação dos mRNA ocorrem exclusivamente no núcleo, apenas quando o RNAm está maduro ele é exportado para o citoplasma e traduzido. Além disso, nos procariotos uma molécula de mRNA que codifica uma cadeia polipeptídica é monocistrônico, se ela codifica para dois ou mais polipeptídios diferentes, o mRNA é policistrônico.
A iniciação da síntese do RNA ocorre nas regiões promotoras reconhecidas pelas RNA polimerase, que se liga a sequências específicas chamadas de promotores, que direcionam a transcrição dos genes. Regiões promotoras são regiões que antecedem o início do gene em aproximadamente 200 nucleotídeos e possuem um domínio chamado TATABOX (-30 nucleotídeos antes do inicio do gene), rica em nucleotídeos que tem Timidina e Adenina. 
Nas células eucarióticas a transcrição depende essencialmente de regiõesque são reconhecidas pela Pol II como a região TATABOX (quando o gene possui), complexo de proteínas e fatores de transcrição (TBP e TAFs).
RNA polimerase II, é central para a expressão genica em eucariotos e requer fatores de transcrição para o complexo de transcrição. Existem estudos que demonstram que os fatores de transcrição que controlam a expressão gênica se encontram em regiões intrônicas. O TBP, por exemplo,é o fator que reconhece especificamente a sequencia TATABOX, TAFII estabiliza a ligação de TBP ao promotor, TFIIB, TFIIE, TFIIF, etc.
No citoplasma, existem fatores que auxiliam no reconhecimento do mRNA pelos ribossomos para a síntese proteica: elF4E, elF4G e PABI
Metilação e acetilação auxiliam no processo de transcrição: A RNA polimerase não inicia a transcrição em regiões de DNA onde há histonas super metiladas ou moléculas de DNA super metiladas, pois são as formas mais densas e compactas da molécula, impedindo a ação da RNA polimerase. Por sua vez quando as histonas sofrem acetilação, isso faz com que as interações Entre histonas e DNA sejam menos densas, promovendo uma descompactação do DNA o que favorece o reconhecimento dos fatores e RNA polimerase da região que deve ser transcritos.
PROCESSAMENTO DO RNA 
Após a transcrição o RNA resultante é um transcrito primário que necessita de algumas alterações – processamento – para adquirir maior estabilidade, proteção e caracterizar a molécula de RNA que irá para o citoplasma para ser traduzida. Varias enzimas que catalisam essas reações residem em RNA, como ribozimas e ribonucleoproteínas. Entre outras modificações possíveis, podemos citar nos eucariotos:
A adição de uma caulda poli (A) nos mRNAs, pela clivagem da extremidade 3’. Serve como sítio de ligação para proteinas, que por sua vez ajudam a proteger o mRNA de enzimas.
E na extremidade 5’ é adicionado uma capacete 5’ (CAP 5’), um resíduo 7-metilguanosina ligado ao resíduo 5’ terminal do mRNA. O capacete tem a função de proteger o mRNA das ribonucleases e participar na ligação do mRNA ao ribossomo para iniciar a tradução;
Splincing do mRNA, processamento que ocorre no núcleo, onde há a remoção dos íntrons do transcrito primário e os éxons são unidos para formar uma sequência continua que especifica um polipeptídio funcional. Esse processo é catalisado pelas ribonucleoproteínas, como ribonucleossomo, spliceossomo.
Um gene pode codificar diferentes proteínas, desde que os éxons sejam recarregados de formas diferentes – splincing alternativo – isoformas.
Splincig alternativo: Os RNAs ribossômicos das células eucarióticas e procarióticas também sofrem processamento pós-transcrição, são chamadas de RNAs pré-ribossômicos que são sintetizados pela Pol I. Processamento que oferece fatores proteicos específicos para cada tecido. É importante em células eucarióticas para regulação gênica em tecidos específicos. Determinação do sexo em Drosophila.
SINTESE DE RNA E DNA DEPENDENTES DE RNA
Transcritase reversa: enzima encontrada no retrovírus constituída de RNA como material genético e são capazes de promover cópias de moléculas DNA a partir de moléculas de RNA viral. A transcritase reversa catalisa primeiro a síntese de uma fita de DNA complementar ao RNA viral, depois degrada a fita de RNA do híbrido RNA-DNA viral.
Importância: tornaram possível a síntese de DNA complementar em um molde de mRNA, e o DNA sintético preparado dessa maneira, chamado de DNA complementar (cDNA), pode usado para clonagens de genes celulares. 
TECNOLOGIA DA INFORMAÇÃO
Técnicas que permitem a avaliação da molécula de DNA: PCR, Hibridização e Sequenciamento
PCR – POLYMERASE CHAIN REACTION
Amplificação de segmentos de DNA in vitro
A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável (Taq polimerase) e requer primers de DNA (pedaços curtos de fita simples com 20 aminoácidos), projetados especificamente para a região de interesse;
A incubação é realizada em um termociclador, que é o aparelho responsável pela execução de todos os ciclos da reação aquecendo e resfriando
A reação é repetida ciclicamente (25 a 35 ciclos) a uma série de alterações de temperatura:
Desnaturação (94°C): aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar as fitas de DNA, proporcionando um molde de fita simples.
Anelamento (55°C): resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequencias complementares no DNA molde de fita simples.
Extensão (72°C): eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.
Principais ingredientes: Água, MgCl2, Tampão, dNTPs, Taq DNA polimerase, Primers, DNA extraído da amostra.
Aplicações: Determinar mutações, teste de indivíduos e paternidade.	
Diversidade da PCR:
	Qualitativo
	Quantitativo e Qualitativo
	PCR
Multiplex
Nested-PCR
Transcriptase Reversa
RAPD/AP/RFLP
MLST (Multilocus Sequence Typing)
HRM (High Resolution Melting)
	qPCR
Multiplex
Transcriptase Reversa
 
HIBRIDIZAÇÃO DO DNA
É o processo de detecção baseado na sequência de um gene particular ou segmento do ácido nucleico; mostra o pareamento da molécula de DNA/DNA; RNA/RNA, DNA/RNA por complementariedade de bases nitrogenadas, embora os híbridos RNA/ RNA são os mais estáveis, têm uma temperatura de desnaturação superior aos outros híbridos.
Quando uma solução aquosa de DNA é submetida a altas temperaturas (100 °C) ou alto pH (≥ 13), a complementariedade de bases é rompida e a dupla hélice de dissocia em duas fitas simples – desnaturação do DNA. Porém se mantidas a um período prolongado a 65°C a 70°C, as fitas simples complementares de DNA reconstituem em dupla hélice – hibridização ou Renaturação do DNA.
A hibridização usa sondas de DNA ou RNA (sequência específica com aproximadamente 70 nucleotídeos) de fita simples marcada com corantes fluorescentes ou isótopos radioativos no fosfato da ligação fosfodiéster ou qualquer hidrogênio do composto, para detectar sequências de ácidos nucleicos complementares no tecido, na célula ou mesmo em um cromossomo isolado. 
Para marcar as moléculas de DNA, uma DNA polimerase copia o marcado na presença de nucleotídeos que são radioativos (normalmente marcados com 32p) ou quimicamente. As moléculas de DNA não radioativas carregam um marcador químico especifico que pode ser detectado por um anticorpo apropriado.
Os radioisótopos utilizados para marcação de sondas são os fluoróforos e o trítio, embora o fluoróforos seja mais comumente utilizado devido seu baixo tempo de radiação na molécula.
3H (12,4 anos – radiação b)
32p (14,3 dias – radiação b)
33p (25,5 dias – radiação b)
Marcação de sondas “Nick Translation” – o processo de marcação de sondas por “Nick Translation” sempre parte de 1ug de DNA. Os componentes de reação são: nucleotideos não marcado (dNTPs normais A, T, C e G); nucleotideos marcados (dUTP) e uma mistura de enzimas composta por DNase I e DNA polimerase I. A DNase I hidrolisa o DNA gerando quebras (Nicks) em cada uma das fitas da molécula de DNA. A DNA polimerase I têm três atividades: 1) função exonucleasica que remove bases a partir da quebra no sentido 5’→3’; 2) função polimerásica que adiciona novos nucleotideos a partir da extremidade 3’ e 3) uma atividade de reparo 3’→5’. Assim nucleotideos marcados e não marcados da mistura de nick translation são incorporados ao DNA sintetizado.
Hibridização do DNA “in situ” ou Fish
Método que permite a visualização, identificação, localização simultânea de microrganismo in situ. Identifica um segmento de DNA de um tecido de uma célula, porém sem extração do material genético. Consiste na visualização direta em microscópios óticos epifluorescentes em cortes histológicos. Tem como vantagem a facilidade de sintetizar sondas especificas marcadas do que produzir anticorpos clonais e a possibilidade de detectar somente bactérias viáveis nos tecidos no momento da fixação.
Procedimentos básicos: 1) fixação e permeabilização da amostra; 2) hibridização; 3) lavagem para remoção das sondas em excesso; 4) detecção pela microscopiafluorescente.
Técnicas de Hibridização
Southern-blot: verificar se uma sequência de DNA específica (gene de interesse) está ou não presente na amostra em análise que contém uma mistura complexa (genoma inteiro de um organismo).
Northern-blot: estuda a expressão gênica, ou seja, verificar se um determinado gene de um genoma é ou não transcrito em RNA e quantificar isso.
Western blot: detectar proteínas em um homogenato (células bem trituradas) ou um extrato de um tecido biológico. Essa técnica usa eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa.
SOUTHERN- BLOT
É um método de hibridização após a transferência de gel que analisa o DNA e não o RNA.
Os fragmentos de DNA, originados da digestão do DNA gnômico das endonucleases de restrição, são primeiramente separados de acordo com o seu tamanho, por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos de DNA são desnaturados embebedando-se o gel em solução alcalina. Uma membrana de nitrocelulose ou de náilon é colocado sobre o gel, e os fragmentos de DNA são transferidos para a membrana por blotting, por meio da capilaridade (sobre a membrana são colocados uma camada de papel absorvente e um peso). A membrana contendo os ácidos nucleicos é colocada em uma solução tampão salina contendo a sonda marcada radioativamente. Após a lavagem para retirar a sonda de DNA que não anelou, os fragmentos hibridizados com a sonda são revelados pela auto-radiografia. 
NORTHERN-BLOT
Primeiro, o RNA e o DNA são separados de todos os outros componentes celulares; as proteínas são completamente desnaturadas e removidas por extração com um solvente orgânico parcialmente miscível em agua; e os ácidos nucléicos permanecem na fase aquosa. Então, o DNA é separado do RNA por diferença de solubilidade em álcool, e qualquer ácido nucleico contaminante do tipo indesejado é eliminado pelas enzimas RNase ou DNase. Os mRNAs são separados dos RNAs grandes por sua retenção em uma coluna cromatográfica que liga especificamente as caudas de poli-A dos mRNAs. As moléculas de mRNAs purificadas e controle são separadas de acordo com os seus tamanhos em uma serie de bandas, por eletroforese em gel. Segue o mesmo processo do Sourthern Blotting e a sonda é uma molécula de DNA ou RNA.
WESTERN BLOT ou IMMUNOBLOT
Uma amostra de proteína é submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), onde as proteínas irão formar um composto com as moléculas do SDS carregados negativamente, assim a velocidade de migração é maior quanto maior for o polipeptídio, possibilitando a separação por massa molecular. As proteínas do gel são transferidas para a membrana, a qual elas se aderem. A membrana é lavada com solução contendo os anticorpos específicos, que se ligam à proteína alvo imobilizada. Uma segunda solução é então adicionada, contendo um segundo anticorpo que se liga especificamente ao primeiro. O segundo anticorpo possui uma maca radioativa ou fluorescente ligada para permitir a visualização dos complexos proteína-anticorpro.
MICROARRAY (Perfilhamento Genético)
É uma técnica que permite avaliar a expressão genica de um número ilimitado de genes simultaneamente; diagnósticos de neoplasmas; prevenção na rejeição de órgãos transplantados analise da virulência bacteriana e de resistência à antimicrobianos.
É feita a extração do mRNA nas condições de uma amostra experimental e de referência. Em seguida, realizada uma RT-PCR (Transcriptase reversa seguida de PCR), obtendo como produto final de interesse o cDNA. As amostras de cDNA são marcadas com compostos fluorescentes, geralmente as cianinas Cy3 e Cy5, sendo que uma amostra é corada com Cy3 e a outra com Cy5. Este cDNA marcado é então desnaturado por aquecimento e hibridizado com o biochip. Quando a solução contendo o cDNA marcado for colocado sobre a lâmina de microarray, ocorrerá a hibridização entre este cDNA e o DNA do biochip, pelo princípio da complementaridade das bases de DNA. Após a hibridização o biochip é colocado em um scanner especial onde irá medir a expressão gênica, que irá fazer a leitura da intensidade da fluorescência nos comprimentos de onda referente aos 2 compostos fluorescentes utilizados. As imagens digitalizadas são então analisadas por um software específico que irá converter a cor e a intensidade da fluorescência em um conjunto de valores numéricos. Os arquivos resultantes (valores numéricos) são analisados posteriormente em outros softwares onde os dados são filtrados e tratados estatisticamente.
*cDNA é o DNA complementar sintetizado a partir de uma molécula de mRNA
	RNA- seq
Os microarranjos apresentam algumas desvantagens para a análise de transcriptomas – conjunto completo de Transcritos (RNAs) em uma célula, e sua quantidade para um estágio especifico ou condição fisiológica. Podem fornecer informação pouco acurada sobre os níveis relativos de transcrição para genes que são expressos em níveis muitos baixos ou muito altos.
Nesta técnica, isola se p RNA da célula ou tecido, e então é convertdo em cDNA com a enzima transcriptase reversa. O cDNA é fragmentado para um tamanho médio apropriado, por nucleases, e em cada extremidade, pequenos segmentos de DNA adaptadores que fornecem sequencias marcadoras para os iniciadores necessários para o sequenciamento de DNA, são ligados. Cada cDNA é então lido por sequenciamento.
CONTROLE DA EXPRESSÃO GENICA
Ricardo Souto (UFABC)
EM PROCARIOTOS
Existem muitas formas de regulação gênica, isto é, mecanismos para controlar quais genes serão expressos e em que níveis. No entanto, muito da regulação gênica acontece durante a transcrição.
As bactérias têm moléculas reguladoras específicas que controlam se um gene determinado será transcrito em RNAm. Muitas vezes, essas moléculas atuam se ligando ao DNA próximo do gene e promovendo ou bloqueando a enzima da transcrição, RNA polimerase.
→ Como uma célula individual especifica quais dos seus muitos genes serão expressos em proteínas?
 Decidir quais genes deve ser expresso é um problema especialmente importante para os organismos multicelulares, porque, durante o desenvolvimento animal, tipos celulares, como músculos, nervos e células do sangue, tornam-se diferentes uns dos outros, levando finalmente à ampla variação de tipos celulares vista no adulto. Essa diferenciação surge porque as células produzem e acumulam diferentes conjuntos de moléculas de RNA e proteína, ou seja, elas expressam genes diferentes.
→ Todos os genes são expressos ao mesmo tempo? NÃO!
A expressão do gene pode ser indutiva ou constitutiva:
1. Constitutiva: o produto dos genes constitutivos (housekeeping) é sempre necessário, ou seja, proteínas essenciais para a manutenção da vida, normalmente envolvida em processos básicos como geração de energia, replicação e manutenção do material genético, e sua expressão é constante em diferentes condições metabólicas. Frente a um determinado estimulo passam a gerar proteína em baixas quantidades. Ex.: enzimas da glicólise (A E. coli, produz enzimas da glicólise constantemente, devido sua abundancia no meio), proteínas regulatórias.
2. Indutiva: ao longo do tempo tem sua expressão (conversão da informação do DNA em proteína) variável; depende de condições específicas, quando necessária. Ex. enzimas do catabolismo de nutrientes pouco comuns, por exemplo, diferente da glicólise, a lactose é um nutriente mais raro na natureza, então a chance que a bactéria tem de se deparar com a lactose, é menor, portanto as enzimas do catabolismo de lactose, tem um comportamento indutível, isto é, se a bactéria encontrar lactose os genes são expressos, ao contrário, não. Outro exemplo, são as enzimas da síntese de aminoácidos. 
→ Regulação temporal do gene
As bactérias crescem exponencialmente por alguns períodos em função da disponibilidade de nutrientes. A E. coli possui cerca de 4279 genes mapeados, mas somente cerca de 600 – 800 genes são expressos em proteínas (indutíveis e constitutivas): enzimas do catabolismo, replicação de DNA, componentes dos ribossomos,síntese da parede celular. Em condições onde há muitas bactérias concorrentes, não há quantidade de nutrientes disponíveis → mudança ambiental →crescimento exponencial não é mais sustentado → situação que o controle da expressão gênica é necessário, pois ela está em condições em que há esgotamento de nutrientes. Então uma das intervenções da expressão genica é interromper a formação de proteínas relacionadas à biossíntese. Neste caso, a bactéria irá expressar genes relacionados a mobilidade celular. 
→ Mecanismos pelo qual a expressão ou não de determinados genes são expressos
Nas bactérias uma questão fundamental é que transcrição e tradução são simultâneas. Isso é possível porque as bactérias não têm núcleo. Neste contexto, o controle do início da transcrição é a principal forma de regulação da expressão genica, pois quando se gera RNAm já tem a disponibilidade para que ocorra a tradução pelo ribossomo.
Os experimentos mais importantes sobre a regulação gênica em bactérias, que culminaram com a concepção do operon por Jacob e Monod em 1961, foram realizados com o sistema Lac de E. coli, o qual envolve três enzimas indutíveis que atuam no metabolismo da lactose, codificadas por um gene específico e que a ordem desses três genes no cromossomo bacteriano é: gene Z, gene Y e gene A.
→ Operon
Os genes procarióticos estão organizados em operon, conjunto de genes estruturais organizados em sequência e sob o controle de um único promotor, e possuem um controle coordenado da expressão. A polimerase do RNA transcreve, a partir do promotor comum, todos os genes estruturais em uma única molécula de RNA policistrônico, a qual é traduzida nas proteínas codificadas pelos genes. 
Operon Lac:
É o operon bem mais caracterizado, é um conjunto de genes que codifica proteínas envolvidas no metabolismo da lactose (nutriente pouco comum disponíveis para bactéria, mamíferos que produz em secreções específicas); produz as enzimas do catabolismo de lactose. 
Para processar o leite, a bactéria necessita de uma proteína de membrana, a permease de galactosideo, que é codificada pelo gene Lac Y e permite que a lactose atravesse a membrana, além de aumentar a absorção de lactose pela célula. E de uma enzima, a β-galactosidase, codificada pelo gene Z (Lac Z), que quebra, ou seja, hidrolisar o dissacarídeo (lactose) em glicose e galactose (monossacarídeos). A glicose por sua vez é utilizada na glicólise e a galactose que por uma ou duas reações é convertida em glicose. A ação da enzima β-galactosidase, pode também, por um mecanismo de catalise alternativo gerar um intermediário de alolactose, um isômero da lactose, importante na expressão. 
Existe uma terceira enzima envolvida no metabolismo da lactose: a transacetilase, codificada pelo gene A (Lac A), cuja função parece ser a de transferir um grupo acetil, proveniente da acetil-coenzima A, para os beta-galactosídeos.
Operon Lac tem outras regiões além dos genes estruturais. Entre o promotor e as regiões codificantes do gene, existe uma sequência de DNA reguladora chamada operador (O), um sítio de ligação da proteína – a molécula repressora do operon Lac. E antes do promotor, um gene associado ao seu próprio promotor, chamado Lac I. Lac I, um gene regulatório que contem as informações para produção da proteína repressora do operon Lac. O promotor e o operador estão rearranjados de tal forma que, quando o repressor do operon Lac ocupa o operador, ele bloqueia o acesso da RNA polimerase ao promotor, impedindo assim, a transcrição, consequentemente a tradução e, portanto não há expressão do operon Lac.
Mas em muitos momentos, a atividade de um único promotor pode ser controlada por dois sinais diferentes. O óperon Lac em E. coli, é controlado tanto pelo repressor Lac (controle negativo) como pela proteína ativadora CAP (controle positivo). O óperon Lac codifica as proteínas necessárias para importar e digerir o dissacarídeo lactose. Na ausência de glicose, a fonte de carbono preferida da célula, a CAP (proteína ativadora catabolica) ativa os genes que a célula utiliza como fontes alternativas de carbono – incluindo a lactose. Genes ativados por CAP são estimulados em resposta a um aumento da concentração intracelular de AMPc, o qual sinaliza a baixa de nutrientes para a célula, ou seja, sinaliza para a bactéria que a glicose, a sua fonte de carbono preferida, não está mais disponível; como resultado, enzimas capazes de degradar outros açúcares são produzidas. 
Seria um desperdício, entretanto, para CAP induzir a expressão do óperon Lac quando a lactose não estivesse presente. Assim, o repressor Lac assegura que o óperon está desligado na ausência de lactose. Esse arranjo possibilita à região controladora do óperon Lac responder e integrar dois sinais diferentes, de maneira que o óperon seja altamente expresso somente quando as duas condições são atingidas: a lactose precisa estar presente e a glicose precisa estar ausente. 
Quando o operon será transcrito? 
O operon Lac será expresso somente se duas condições forem atendidas:
A glicose deve estar indisponível: quando a glicose está indisponível, o AMPc se liga a CAP, tornando-a capaz de se ligar ao DNA. A CAP ligada auxilia a RNA polimerase a ligar-se ao promotor do operon Lac. 
A lactose deve estar disponível: se a lactose está disponível na célula (no citoplasma), o repressor Lac vai se soltar do operador pela ligação da Alolactose, um indutor, obtido pela ação catalítica da β-galactosidase que se liga à proteína repressora causando a modificação conformacional que a remove do DNA operador. Isso permite que a RNA polimerase percorra o DNA e transcreva o operon. 
→ Regulação coordenada do operon Lac
	Disponibilidade de Nutrientes
	Operon Lac
	↓Glicose (↑AMPc)
	↓Lactose
	CAP é estimulado pelo aumento de AMPc que sinaliza a indisponibilidade de glicose, o AMPc se liga a CAP, tornando-a capaz de se ligar ao DNA, ativando a transcrição. No entanto como não tem lactose, o repressor Lac está ativo ocupando o operador e bloqueando a entrada da RNA polimerase ao promotor.
Então a RNA pol não transcreve o operon. Não é expresso.
	↓Glicose (↑AMPc)
	↑Lactose
	CAP é estimulado pelo aumento de AMPc que sinaliza a indisponibilidade de glicose, o AMPc se liga a CAP, tornando-a capaz de se ligar ao DNA, ativando a transcrição. E como há disponibilidade de lactose, o repressor Lac vai se soltar do operador pela ligação da Alolactose, que se liga à proteína repressora causando a modificação conformacional que a remove do DNA operador então o acesso ao promotor é livre. Isso permite que a RNA polimerase percorra o DNA e transcreva o operon. Altamente expresso
	↑Glicose (↓AMPc)
	↑Lactose
	A presença de lactose no citoplasma gera a Alolactose, então a proteína induz o repressor Lac a se soltar do operador, permitindo que a RNA pol acesse o promotor. No entanto como tenho glicose, e o AMPc é baixo, o ativador da transcrição (CAP) não é estimulado. Baixa expressão
	↑Glicose (↓AMPc)
	↓Lactose
	A disponibilidade de glicose, e o AMPc é baixo, o ativador da transcrição (CAP) não é estimulado e não ativa a transcrição.
E a indisponibilidade de Lactose não produz Alolactose, o indutor que se liga à proteína repressora causando a modificação conformacional que a remove do DNA operador. Então isso não permite que a RNA polimerase percorra o DNA e transcreva o operon.
Não é expresso
E. COLI PREFERE GLICOSE À LACTOSE.
Operon trp
A interação do triptofano no citoplasma com o repressor trp favorece sua ligação ao operador – bloqueia a transcrição, ou seja, o repressor do triptofano, desativa os genes do triptofano em bactérias somente na presença do triptofano. Quando o triptofano é removido do meio, os genes são novamente ativados, ou seja, quando a concentração de triptofano livre na célula cai, o repressor não mais se liga ao triptofano e, assim, não mais se liga ao DNA, e o óperon do triptofano é transcrito pela RNA polimerase. 
Genes estruturais: trp E, trpD, trp C, trp B e trp A (cinco proteínas)
Gene regulador: trp R
Repressor do operon trp
O operon do trp apresenta controle de expressão genica por atenuação: a disponibilidade de triptofano interrompe a tradução, mesmo após o inicio da transcrição (regulação pós-transcricional).  A atenuação é um mecanismo para redução da expressão dos genes do operon trp quando os níveis de triptofano estão altos. No entanto, em vez de bloquear a iniciação da transcrição, a atenuação impede o término da transcrição.
O operon trp se expressa (torna-se "ativo") quando os níveis de triptofano estão baixos e é reprimido (torna-se "inativo") quando os níveis estão altos.
→Controle da expressão genica pelo reconhecimento do promotor 
Além dos operons, existem outros mecanismos de controle pela RNA polimerase bacteriana. A RNA polimerase é uma enzima quaternária com subunidades (2α, 1β, 1β´e 1ω ) mais o fator σ. Fator sigma é a principal responsável pelo reconhecimento da sequência promotora sobre o DNA. Ele faz isto diminuindo a ligação do cerne da enzima a sequências inespecíficas do DNA e aumentando a ligação específica ao promotor. 
O uso de diferentes fatores sigma permite à célula coordenar sua expressão gênica. A bactéria E. coli, por exemplo, possui diversos tipos desses fatores. O tipo σ70 é padrão, reconhecendo as sequências de consenso 5’ TATAAT 3’ e 5’ TTGACA 3’. O tipo σ32, induzido quando a célula sofre um aumento súbito de temperatura, reconhece a região promotora dos genes do choque térmico. Esses genes - também conhecidos como heat-shock – têm, então, sua taxa de transcrição aumentada, sintetizando uma série de proteínas protetoras. Já o tipo σ54 entra em ação quando a célula apresenta uma baixa de nitrogênio, estimulando a expressão de genes responsáveis pela síntese de proteínas que assimilam esse composto.
EM EUCARIOTOS
A expressão do gene/ proteínas é regulada em dois níveis:
Temporal: Quando um determinado gene/proteína só é expresso em um “tempo” determinado, na abundancia ou ausência de nutrientes.. Por exemplo, a Ferritina, proteína citoplasmática, cuja função é armazenar o íon Fe2+; sua expressão é controlada pelos níveis intracelulares de ferro através da IRE-binding protein, que se liga ao ferro e controla a expressão de Ferritina, ou seja, uma célula que contem baixas concentrações de Fe2+, possui baixa expressão de genes de ferritina.
Espacial quando a expressão de determinado gene/proteína é diferente dependendo tipo celular. Fibras, neurônios, adipócitos, etc. apesar do conteúdo DNA ser idênticos, a composição de proteínas é distinta. Ex: proteínas que só são expressas em células nervosas (ex: mielina) ou no tecido muscular (ex: miosina).
→ A expressão de genica pode ser regulada em muitas etapas na via que vai do DNA para o RNA até a proteína
(1) Controle de quando e quão frequentemente um determinado gene é transcrito,
(2) controle de como a transcrição de RNA é submetido à splicing ou de alguma outra maneira processada;
(3) seleção de quais mRNAs são exportados do núcleo para o citosol;
(4) degradação seletiva de certas moléculas de mRNAs;
(5) seleção de quais mRNAs são traduzidos por ribossomos; 
(6) ativação ou inativação seletiva de proteínas após a sua produção
Controle transcricional 
O controle da transcrição é exercido na etapa inicial. A iniciação da síntese do RNA ocorre nas regiões promotoras reconhecidas pelas RNA polimerase, que se liga a sequências específicas chamadas de promotores, que direcionam a transcrição dos genes. Os promotores incluem um sítio de iniciação, onde a transcrição na verdade se inicia, e uma sequência de aproximadamente 50 nucleotídeos. Essa região contém sítios que são necessários para que a RNA-polimerase se ligue ao promotor. Além do promotor, praticamente todos os genes, eucarióticos, possuem sequências regulatórias de DNA que são usadas para ativar ou desativar o gene.
→ estrutura da cromatina
O início da transcrição nas células eucarióticas precisa levar em conta o empacotamento do DNA em cromossomos. O empacotamento do DNA por sua vez pode restringir a expressão gênica.
Proteínas eucarióticas reguladoras da transcrição possuem um mecanismo adicional de ação: elas atraem as proteínas que modulam a estrutura da cromatina e afetam assim a acessibilidade do promotor aos fatores gerais de transcrição e à RNA-polimerase. 
Regiões de DNA resistentes à transcrição incluem a heterocromatina (DNA altamente compactado, mais densa, menos acessível à RNA) encontrada nos cromossomos em interfase e o cromossomo X inteiro das femeas de mamíferos, logo os genes encontrados nestas regiões possuem baixa expressão. Já na outra região interfásica da cromatina na célula, a eucromatina, é caracterizada por determinadas modificações nas histonas e proteínas associadas; genes na eucromatina geralmente são capazes de ser mais expressados.
O material genético nas células eucarióticas está empacotado nos nucleossomos. A estrutura da cromatina pode ser alterada por complexos de remodelamento da cromatina e enzimas que covalentemente modificam as proteínas histonas que formam o centro do nucleossomos. O controle das regiões que podem ser compactadas (mais densas) e descompactadas é pela ação de enzimas e proteínas celulares, mas principalmente pela enzima histona acetiltransferase (HAT).
Modificações químicas das histonas por acetilação (enzima HAT) previne formação de heterocromatina, tornando-a mais acessivo à RNA polimerase – favorece a alta expressão.
A enzima histona acetiltransferase, acetila, ou seja, transfere um grupo químico acetil para as histonas. Muitas proteínas ativadoras da transcrição atraem as histona-acetilases que ligam um grupo acetila a lisinas selecionadas na cauda das proteínas histonas. Essas alterações resultantes na estrutura da cromatina provavelmente permitem uma maior acessibilidade ao DNA envolvido pois favorece a descompactação e consequentemente genes expressos; além disso, o próprio grupo acetila é reconhecido por proteínas que promovem a transcrição, incluindo alguns dos fatores gerais de transcrição. Da mesma forma, as proteínas de repressão gênica podem modificar a cromatina de maneira que reduzam a eficiência do início da transcrição e, portanto a indisponibilidade de genes expressos. Por exemplo, muitos repressores atraem histona-desacetilases – enzimas que removem os grupos acetila das caudas das histonas, revertendo, dessa forma, os efeitos positivos que a acetilação tem no início da transcrição.
A histona quando é acetilada, não há interação com as proteínas da família Sir ao nucleossomos e, portanto inibe a formação de heterocromatina.
→ Metilação da citosina no DNA da célula diminui a expressão de genes
Modificação química do DNA, que consiste na adição de grupo metil na base nitrogenada, posição 5 da citosina, e ocorre mais frequentemente em dinucleotídeos CG- formação de 5 metilcitosina. Essa modificação covalente de citosinas normalmente desliga genes pela atração de proteínas que bloqueiam a expressão gênica. Os padrões de metilação de DNA são passados para as células da progênie pela ação de uma enzima que copia o padrão de metilação da fita de DNA parental para a fita de DNA filha, imediatamente após a replicação. Essa metilação ocorre nas duas fitas, pois regiões do DNA ricas em CG (“ilhas CpG”) causa redução na expressão de genes próximos. A metilação é conservada após divisão celular, isso mantem a diferenciação celular. É um mecanismo importante para o controle da expressão espacial. 
Células de baixo nível de metilação: células troncos embrionárias.
→ Enhancers
São sequências de DNA, sítios de proteínas ativadoras da transcrição, que estão bastante distantes do promotor, afetando a taxa de transcrição em um promotor que pode estar localizado a milhares de pares de bases de distância. A ligação de proteínas regulatórias nos enhancers é responsável pelo controle da expressão genica durante o desenvolvimento e a diferenciação, bem como durante a resposta das célulasaos hormônios e fatores de crescimento. Uma proteína ativadora se liga a uma sequência regulatória de DNA e então interage com a RNA-polimerase para auxiliar na iniciação da transcrição. Sem a presença do ativador, o promotor falha em iniciar a transcrição eficientemente.
Uma proteína ativadora ligada ao DNA auxilia na associação da RNA-polimerase e fatores gerais de transcrição ao promotor: estruturas que se ligam aos enhancers atraem coativadores (mediadores) que auxiliam a comunicação entre ativadores e fatores de transcrição necessários para a RNA polimerase. Como ativadores funcionam a distancia? A formação da alça pelo DNA permite o contato entre a proteína ativadora ligada ao estimulador e o complexo transcricional ligado ao promotor.
Um tipo de enzima que é recrutada pelos enhancers são as enzimas de modificação e remodelagem da cromatina (por exemplo, histonas acetil transferase), então é possível mudar o nível de compactação da cromatina favorecendo a transcrição. A remodelação da cromatina ocorre em estágios facilitados pelas interações entre ativadores e HAT ou complexos enzimáticos apropriados. Essas modificações afetam a carga elétrica liquida a forma e outras propriedades das histonas, bem como as propriedades estruturais e funcionais da cromatina, participando na regulação da transcrição.
Existem enhancers que estão envolvidos na regulação espacial do gene e permite que alguns genes sejam expressos em tecidos específicos, porque a proteína ligante que ativa o gene próximo ao enhancer é produzida em tecidos/células especificas. Outros enhancers estão envolvidos na regulação temporal do gene, ou seja, a proteína ligante do enhancer é ativada por estimulo especifico (exemplos genes regulados pela proteína HSP70 são ativados por choque térmico).
A expressão eucariótica pode ser regulada por sinais inter e intracelulares. Hormônios esteroides (cortisol) uma vez no interior da célula interagem com receptores nuclear de ligação de esteroides formando o complexo hormônio-receptor que atua ligando-se a sequencias de DNA especificas chamadas HRE (elementos de resposta hormonal) alterando desse modo a expressão. Atuando nesses sítios, os receptores atuam como ativadores de transcrição recrutando o complexo de transcrição. A ação dos enhancers está relacionada às moléculas sinalizadoras do meio extracelular. Por exemplo hormônios que são sinalizados por AMPc. 
Fosforilação de fatores nuclear: os efeitos da insulina na expressão genica numa ultima etapa, leva a ativação de uma proteína cinase no núcleo que fosforila proteínas de ligação de DNA especificas como a CREB (proteína de ligação do CRE) alterando sua habilidade de atuar como fatores de transcrição. Quando fosforilada a CREB se liga aos CRE ( elemento de resposta de AMPc) perto de genes e atua como um fator de transcrição, ligando a expressão dos genes.
Processamento do RNA
Splicing envolve a adição de CAP e poliadenilação, que são fenômenos fundamentais para obter o RNAm para ser traduzido. E o splicing alternativo por sua vez, é um fenômeno de expressão genica capaz de modificar o transcrito, ou seja, formando diferentes RNAm e proteínas com um mesmo transcrito de RNAm.
O splicing alternativo é controlado por proteínas reguladoras onde diferentes partes de um RNAm podem ser selecionadas para serem usadas como éxons, isso permite que duas ou mais moléculas de RNAm sejam feitas a partir de um pré-RNAm. Então diferentes células podem expressar diferentes proteínas reguladoras. Uma classe de reguladores descoberta é chamada de pequenos RNAs reguladores, que pode controlar o tempo de vida e tradução do RNAm.
Estabilidade do RNA
O tempo de vida de uma molécula de RNAm no citoplasma afeta quantidade de proteínas. Pequenos RNAs reguladores podem se ligar a RNAm-alvos e gerar quebra do mesmo. Nesse sentido, entre dois genes diferentes que possuem taxas de transcrição semelhantes, aquele cujos mRNAs apresentem maior estabilidade gerará maior acumulo dos transcritos no citoplasma e a tradução de tais transcritos resultara na maior produção da proteína codificada. Portanto o controle da estabilidade é importante, pois a quantidade de RNAm no citoplasma em altíssimos níveis pode inviabilizar o funcionamento celular.
Degradação do mRNA
Pode ocorrer pela ação de microRNA (miRNA), pequenos RNAs que não codificam proteínas, cuja função é regulatória e é um mecanismo que está envolvido no silenciamento do vários genes. É uma formação de regulação gênica que controla o tempo de desenvolvimento e tradução do RNAm. Duas características os tornam reguladores importantes: 1) um único miRNA pode regular um conjunto de diferentes mRNAs e 2) o gene que codifica um miRNA ocupa relativamente pouco espaço no genia comparado à um que codifica uma proteína reguladora transcricional.
O miRNA maduro corresponde a uma das fitas do duplex é incorporado ao complexo RISC (complexo de silenciamento induzido por RNA) enquanto a outra é degradada. O RISC é constituído por enzimas helicases e proteinas que promovem o desenovelamento de duplex e a quebra das pontes de hidrogênio que unem as duas fitas. Dessa maneira o miRNA incorporado ao RISC pode conduzir o complexo proteico ao mRNA complementar para promover a repressão gênica.
Aparentemente a escolha da fita que servirá como miRNA maduro parece ser determinada pela estabilidade termodinâmica do duplex.
Tradução
A tradução de um mRNA pode ser aumentada ou inibida por reguladores, ex., RNAm podem bloquear a tradução dos seus RNAm-alvos (ao invés de gerar a quebra dos mesmos).
Atividade proteica
O controle dos mecanismos responsáveis pelo endereçamento de uma proteína representa uma forma de regulação. Proteínas podem sofrer uma variedade de modificações como serem quebradas ou marcadas com grupos químicos. Essas modificações podem ser reguladas e podem afetar a atividade ou comportamento da proteína.
MicroRNA (miRNA) e RNA de Interferencia (RNAi)
Luciana Vasques
Alguns autores agrupam os tipos de RNA em classes, sendo uma a que contem a informação genética para a síntese de proteína, o RNAm. As demais classes de RNA são chamadas de RNA funcional: RNAr – constituintes estruturais e componentes catalíticos do ribossomo atuando no processo de síntese proteica. Os RNAt – transportam aminoácidos do citoplasma para o RNAm nos ribossomos, no processo de tradução. Alguns outros RNAs participam do processo de splicing do RNAm e são chamados de pequenos RNA nucleares (snRNA). As demais classes de RNA, descobertas recentemente, são os microRNA, curtos RNA de interferência (siRNA) e RNA longos não codificadores (lncRNA).
A interferência de dupla fita de RNA na tradução é um mecanismo que pode ser mediado pelo miRNA e siRNA (pequenos RNAs interferentes):
→MicroRNA (miRNA)
São pequenos RNAs endógenos não codificantes de proteínas, de aproximadamente 22 nucleotídeos presente na maioria dos organismos multicelulares que variam de vermes a mamíferos, que se anelam a sequências complementares na região 3’ não traduzida (3’UTR) dos mRNAs mediando a degradação do mRNA ou na inibição da tradução. 
São RNAs que funcionam como reguladores de processos em eucariotos como proliferação celular, diferenciação celular, etc. É uma forma de regulação gênica que controla o tempo de desenvolvimento em organismos além de ser um mecanismo usado para proteção contra vírus de RNA invasores e controle de atividade de transposons. São sintetizados a partir de endorribonucleases na família da RNase III, Drosha e Dicer. No núcleo, o transcrito primário – pri-miRNA é reduzido a pré-miRNA pelo por um complexo que inclui a Drosha. Após este processamento, os pré-miRNAs são transportados para o citoplasma pela proteína Exportina – 5-Ran-GTP. No citoplasma o pré é clivado pela proteína Dicer gerando uma molécula intermediaria dupla-fita. O miRNA maduro corresponde a uma das fitas do duplex é incorporado ao complexo RISC (complexo de silenciamento induzido por RNA) que então se liga ao RNA-alvo, enquantoa outra é degradada. Se a complementariedade entre o miRNA e seu alvo é total, o mRNA-alvo é clivado, ocorre degradação. Se a complementariedade é apenas parcial, o complexo bloqueia a tradução do mRNA-alvo.
microRNAs e o câncer: O câncer resulta do crescimento celular anormal e perda da capacidade de apoptose. Estudos demonstram que os miRNAs regulamo crescimento celular e a apoptose. O silenciamento e a superexpressão de miRNAs específicos parecem ser essenciais na iniciação e desenvolvimento do câncer. O padrão de expressão dos miRNAs parece ser tecido-especifico, assim tipos diferentes de tumores mostram padrões de expressão de miRNAs distintos, assim diferentes perfis de expressão em canceres poderão ser usados como ferramenta diagnostica do câncer.
→RNAi 
A presença de RNA de fita dupla exógenos na célula estimula o RNAi a atrair um complexo proteico contendo a nuclease Dicer. Os siRNA, então, são segmentos pequenos obtidos a partir da quebra do duplex de RNA de origem exógena pela proteina Dicer. Esses pequenos RNAs são incorporados ao complexo RISC, o mesmo que pode carregar os miRNAs, que então se liga ao mRNA-alvo e o silenciam. O mRNA é degradado. 
Esse mecanismo permite que cientistas inativem genes em culturas de células, em alguns casos em plantas ou animais. 
	Diferenças entre siRNA e miRNA
	siRNA
	miRNA
	
	Exógeno
	Endógeno
	Apesar de constituírem o grupo de ncRNA podem ser diferenciados principalmente em função e origem: enquanto os miRNA são tidos como endógenos, os siRNA são exógeno, derivados de vírus, transposons ou transgenes
	Defesa
	Desenvolvimento/ processos fisiologicos
	Enquanto que o miRNA está envolvido na manutenção da identidade celular, bem como estabelecer e manter o estado diferenciado da célula, o siRNA, está envolvido na defesa à vírus.
	Degradação
	Impede a tradução
	No siRNA como o pareamento à sequencia complementar ao RNAm-alvo e total, ele causa a degradação, e portanto o silenciamneto especifico do gene. Já no miRNA, quando a complementariedade é parcial, pode ocorrer apenas a repressão da tradução.
	Complementariedade total
	Complementariedade parcial ou total
	O siRNA parea-se a sequencia complementar ao RNAm de forma total, causando a degradação. No miRNA quando a complementariedade é total, ocorre degradação do mRNA e quando é parcial, ocorre repressão da tradução
TRADUÇÃO E PROCESSAMENTO - Síntese De Proteínas
Gisele Justo
→Importância das proteínas
As proteínas constituem os instrumentos moleculares pelos quais as informações genéticas são expressas. São responsáveis pela homeostasia do sistema, sua síntese é fundamental no crescimento, desenvolvimento e manutenção celular. Possuem funções estruturais e dinâmicas.
Elas podem ser intracelular como extracelular. Por exemplo, o lisossomo possui pH acido portanto as proteínas devem ser resistentes a ação da acidez presente nos lisossomos ao contrario de outras organelas que necessariamente não possuem pH acido; proteínas de membranas tem um caráter mais hidrofóbico, etc.
→Tipos de proteínas: 
Catalítica
Transporte de moléculas (hemoglobina)
Sustentação mecânica e movimento (colágeno)
Sinalização 
Resposta imune
Atuação da contração muscular (actina e miosina)
Regulação do metabolismo devido à ação hormonal (insulina); Crescimento, diferenciação e morte celular
→As proteínas são compostas por polímeros de aminoácidos 
Cada resíduo de aminoácido (resíduo reflete a perda de elementos de água quando os aminoácidos são unidos) unido à outro por uma ligação covalente.
Todos os 20 tipos de aminoácidos são α-aminoácidos, mas se diferenciam pela estrutura da cadeia lateral que variam em tamanho, carga elétrica e influenciam na solubilidade dos aminoácidos em água. Eles têm um grupo amino (-NH2)e um grupo carboxila (-COOH) ligados aos carbono α. 
Com exceção à glicina, onde o carbono α ao invés de estar ligado aos quatro grupos diferentes citados acima, o grupo R é outro átomo de hidrogênio. O carbono é chamado de α, pois se refere ao carbono que está ligado à principal função da cadeia, no caso do aminoácido, a principal função é o ácido carboxílico.
Os aminoácidos podem se ligar covalentemente por meio da ligação peptídica a fim de produzir peptídeos. Tal ligação é formada pela remoção de elementos de água (desidratação) do grupo α-carboxila de um aminoácido e do grupo α-amino de outro. Os grupos amino são bons nucleófilos, mas o grupo hidroxila é um grupo de saída fraco e não prontamente deslocado. em condições padrões, a reação não ocorre em grau aplicável. A hidrólise de uma ligação peptídica é reação exergônica, e só ocorre lentamente porque tem uma elevada energia de ativação. Como resultado as ligações em proteínas são estáveis.
Entretanto, devido esta problemática termodinâmica encontrada nas células, esta reação, além de ser realizada através de um complexo aparato de síntese proteica que induz ribossomos, ácidos nucleicos e tantas outras proteínas, para deixar termodinamicamente favorável, o grupo carbonila do aminoácido é ativado tornando a saída da hidroxila mais fácil.
 A sequência de aminoácidos da cadeia de um peptídeo é iniciada pela extremidade aminoterminal (à esquerda) e a extremidade carboxiterminal à direita. E lida da esquerda para a direita. 
As configurações D e L dos aminoácidos, por convenção de Fischer, referem-se apenas à configuração absoluta dos quatro substituintes em torno do carbono quiral, e não às propriedades ópticas da molécula. 
 Os carbonos são numerados de 1 a 3, iniciando com o carbono do aldeído ou carboxilaterminal (no caso da alanina), o grupo R do aminoácido sempre abaixo do α, e os L-aminoácidos são aqueles com o grupo OH para a esquerda, e os D-aminoácidos com o OH para direita.
Os aminoácidos são classificados pela polaridade do grupo R ou a tendência para interagir com a água em pH biológico (próximo a 7,0). Obviamente, os aminoacidos tem pelo menos dois grupos ionizáveis que podem existir na forma protonada (-COOH, -NH3+) ou desprotonada (-COO-, -NH2) dependendo do pH do meio.
Grupo não polar, alifática: são apolares e hidrofóbico, ex.; Alanina, valina, leucina e isoleucina, tendem a se agrupar no interior de proteinas, estabilizando a estrutura proteica por meio de interações hidrofóbicas. A glicina de estrutura simples, não possui carbono quiral, portanto sua estrutura lateral muito pequena não contribui para as interações hidrofóbica, possui maior flexibilidade. A prolina tem cadeia lateral com estrutura cíclica, portanto seu grupo amino secundário (imino) de resíduos de prolina é mantido em uma configuração rígida que reduz a flexibilidade estrutural de regiões polipeptídicas.
Grupo R aromáticos: possuem cadeias laterais aromáticas relativamente apolares (hidrofóbicas), embora a tirosina e o triptofano sejam menos hidrofóbicos que a fenilalanina devido ao grupo hidroxila da tirosina e ao nitrogênio do anel indol do triptofano. As interações hidrofóbicas são fortes principalmente quando os anéis encontram-se adjacentes na proteína. E Absorvem a luz ultravioleta em 280 nm característica na maior parte das proteínas. 
Grupo R polares, não carregados (sem carga): são mais solúveis em água e inclui a serina, treonina, cisteína, asparagina e glutamina. A cisteina por sua vez, é um caso isolado deste grupo, porque quando oxidada forma-se um aminoácido dimerico – cistina – onde duas moléculas de cisteina são ligadas por ligações dissulfeto. As ligações dissulfeto desempenham um papel especial nas estruturas das proteinas pela formação de ligações covalentes entre cadeias polipeptídicas.
Grupo R carregados positivamente (básicos): possuem carga positiva significativa em pH 7,0, são a lisina, com um segundo grupo amino primário na cadeia alifática; a arginina com um grupo guanidinio e a histidinan com um grupo inidazol aromático.
Grupo R carregados negativamente (ácido): apresentam carga negativa final em pH 7,0 são o aspartato e o glutamato, cada um dos quaistem um segundo grupo carboxila.
→Organização Estrutural
Estrutura primaria: consiste em uma sequencia de resíduos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas e inclui quaisquer pontes dissulfeto. 
Estrutura secundária: é definida pelo arranjo espacial de aminoácidos adjacentes. Duas organizações são mais estáveis e recorrentes: a formação das estruturas Folha beta pregueada e alfa hélice, as quais formam-se devido à existência de ligações de hidrogênio entre átomos de aminoácidos não adjacentes
Estrutura terciária: descreve os aspectos de enovelamento tridimensional de um polipeptídio: interações fracas e ligações covalentes entre aminoácidos distantes.
Estrutura quaternária: é definida pelo arranjo de várias cadeias de subunidades polipeptídicas em complexos tridimensionais mantida por ligações não covalente entre as subunidades.
→A síntese proteica é altamente regulada. E, portanto ocorre quando há um estimulo, ou seja, a necessidade de haver determinada proteína na célula, quando esta proteína não é mais necessária, ela é degradada. 
→ TRADUÇÃO
Processo geral da síntese proteica dirigida por mRNA. A mensagem genética codificada no mRNA é traduzida nos ribossomos em um polipeptídio com uma sequencia particular de aminoácido. Os ribossomos estão agrupados em uma única fita de mRNA – Polissomos.
As quatro letras do código do DNA (A, T, G e C), em grupos de dois podem gerar apenas 16 combinações diferentes, o que é insuficiente para codificar 20 aminoácidos. Grupos de três, no entanto geram 64 combinações diferentes. Portanto cada códon é um triplete de nucleotídeos que codifica apenas um aminoácido, sendo assim, há situações em que um aminoácido pode ser especificado por mais de um códon, diz-se então que o códon é degenerado. Nestes casos, a diferença entre eles geralmente se dá na terceira base (extremidade 3’)
A fase de leitura é definida pelo primeiro especificado na sequencia, sempre inicia com a metionina. Em procariotos, a metionina que inicia a tradução é enzimaticamente transformada em N-formilmetionina, essa transformação consiste na adição de um radical formil à extremidade amino do aminoácido.
A leitura do códon é sucessiva e sem sobreposição, ou seja, não há interrupções entre os códons para os resíduos. Isso ocorre porque há uma limitação, como se deixássemos enrijecidos o código genético, não permitindo a sobreposição sobre o triplete. Um código sem sobreposição permite maior flexibilidade para as sequencias dos códons vizinhos e, portanto, para as possíveis sequencias de aminoácidos designadas pelo código.
 Longas sequencias de fases de leitura aberta geralmente correspondem a genes que codificam proteínas, essas sequencias geralmente, são uma fae de leitura sem um códon de parada entre 50ou mais códons – ORF OPEN READING FRAME.
Códon de iniciação: AUG é o sinal para o inicio de um polipeptídio nas células e codifica resíduos de metionina (Met) nas posições internas. 
Códon de parada: UAA, UAG, UGA sinalizam o fim da síntese e não codificam qualquer aminoácido conhecido. 
→Como é feito o reconhecimento do códon e como um aa é selecionado especificamente entre tantos existentes na célula?
Um mínimo de 32 tRNAs são necessários para traduzir todos os 61 códons (31 para codificar os aminoacidos e 1 para o inicio da tradução). Os tRNAs pareiam se com códons do mRNA em uma de três bases no tRNA – anticódon por meio de ligações de hidrogênio. Portanto, os anticódons que determinam onde os aa serão inseridos na cadeia em crescimento. 
A especificidade das enzimas aminoacil sintetase, responsáveis por ligar covalentemente o aminoácido à extremidade 3’ de uma molécula de tRNA, determinam a identidade do aa ligado a um dado tRNA – processo aminoacilação.
Os tRNAs permitem o alinhamento dos aa de acordo com a sequencia do mRNA. Eles possuem uma configuração tradicional de folha-de-trevo, constituída por um Braço aceptor de aminoácido (local de ligação do aminoácido sempre através da sequencia de nucleotídeos CCA (3’). Braço TᴪC ; Braço D, braço extra, braço anticódon e alça anticódon. Os braços D e TᴪC são importantes para o dobramento do tRNA (estrutura secundária: L torcida), locais reconhecidos pela enzima aminoacil sintetase.
O pareamento entre o códon e o anticódon é antiparalelo. Hipótese da oscilação:
As duas primeiras bases de um códon (que são iguais ao do anticódon) no mRNA conferem a maior parte da especificidade do código.
A primeira base do anticódon (se lido na direção 5’-3’) que pareia se com a terceira base do códon, é uma base oscilante que determina o número de códons reconhecidos pelo tRNA.
As bases oscilantes (ou terceiro base) do códon contribui para a especificidade, mas como ela pareia de forma frouxa (não é Watson-Crick) com sua base correspondente no anticódon, ela permite uma dissociação rápida entre o tRNA e seu códon durante a síntese proteica. Se todas as bases envolvessem em fortes pareamentos Watson-Crick com as três bases do anticódon, os tRNAs se dissociariam muito lentamente, e isso limitaria a velocidade da síntese proteica. 
Essas interações que não são Watson-Crick, são necessárias, pois garantem fidelidade e processividade na síntese proteica. 
→Local da SínteseO processo de tradução ocorre no citosol, em ribossomos “livres” ou em ribossomos associados ao retículo endoplasmático (RER). As subunidades ribossomais estão identificadas pelos seus valores S. A cavidade entre elas é um sitio isento de proteínas e onde ocorre a síntese. O ribossomo é uma ribozima, enzimas cuja função catalítica reside em RNA, responsável pela catalise da ligação peptídica. O ribossomo caminha ao longo da fita do mRNA no sentido 5’-3’.
Sítios de ligação para o tRNA no ribossomos. O ribossomo bacteriano possui três sítios: os sítios A e P (define o tamanho da cadeia polipeptídica) se ligam a um aminoacil-tRNA, enquanto o sítio E se liga apenas a tRNA não carregados, que já completaram sua tarefa no ribossomo. O (5’) AUG iniciador é posicionado no sítio P. O fMet-tRNA é o único aminoacil-tRNA que se liga primeiro ao sitio P (pois o Sítio A está bloqueado estericamente), os demais, durante o estágio alongamento, se ligam primeiro ao sitio A e em seguida ao P e E.
 
Etapas da Tradução:
Ativação do aminoacido:
Como a formação da ligação peptídica entre aminoácidos livre não é termodinamicamente favorável, pra que ocorra as primeiras etapas, deve haver a ativação dos aminoácidos. Esse processo é a esterificação de um aminoácido na adenosina localizada na extremidade 3’ do tRNA. A formação de um aminoacil-adenilato, é catalisado por duas enzimas, com a clivagem do ATP em AMP e PPi. Para as enzima da classe I, o grupo aminoacila é transferido inicialmente para o grupo 2’hidroxila do resíduo e para as enzimas da classe II o grupo aminoacila é transferido diretamente oara o grupo 3’-hidroxila do adenilato terminal, onde deve ocorrer a finalização.
A aminoacilação do tRNA cumpre duas finalidades: ativa um aminoácido para a formação de uma ligação peptídica; criação de um link entre aminoácido e a informação genética; formação de um tRNA “carregado”, pronto para participar da síntese proteica. Atividade revisora da enzima garante o posicionamento apropriado do aminoácido no polipeptídio nascente, pois a ligação do aminoácido correto é essencial para a fidelidade da síntese proteica.
Iniciação:
A iniciação da síntese de um polipeptídeo nas bactérias requer (1) a subunidade 30S do ribossomo, (2) o mRNA que codifica o polipeptídeo a ser produzido, (3) o fMet-tRNAfMet iniciador, (4) um conjunto de três proteínas denominadas fatores de iniciação (IF-1, IF-2 e IF-3), (5) GTP, (6) a subunidade 50S do ribossomo e (7) Mg21. A formação do complexo de iniciação se dá em três etapas.
Na etapa 1, a subunidade 30S do ribossomo se liga a dois fatores de iniciação IF 1 e IF-3. mRNA se liga então a subunidade 30S. O iniciador é guiado pela sequência de shine-Dalgarno do mRNA. Essa sequência consenso é um sinal de iniciação contendo