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O sistema CRISPR (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats), ou seja, Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente
Interespaçadas, consiste em pequenas porções do DNA bacteriano compostas por
repetições de nucleotídeos. Cada uma dessas repetições encontra-se adjacente a um
“protoespaçador” (“espaçador de DNA”), que corresponde a uma região não-
codificante inserida no DNA bacteriano após o contato com genomas invasores
provenientes de bacteriófagos ou plasmídeos. A transcrição do locus CRISPR
resulta em pequenos fragmentos de RNA com capacidade de desempenhar o
reconhecimento de um DNA exógeno específico e atuar como um guia de modo a
orientar a nuclease Cas, que irá promover a clivagem e consequente eliminação do
DNA invasor caso este entre novamente em contato com a bactéria, atuando como
importante mecanismo de defesa contra DNAs invasores [1][2].
O CRISPR é frequentemente usado como um termo geral para se referir à edição
genômica, mas é o acoplamento do CRISPR e do sistema Cas9 que permite a
deleção seletiva do DNA[3]. Diversos são os mecanismos pelos quais a molécula de
RNA guia pode ser sintetizada, entretanto, o sistema tipo II no qual baseiam-se os
sistemas atualmente disponíveis para realização da edição gênica, requer a
presença de um RNA transativador (tracRNA), e uma molécula pequena de RNA
complementar à sequência repetida capaz de associar-se ao transcrito inicial do
locus CRISPR, denominada CRISPR RNA (crRNA-sequências que consistem em
um protoespaçador ligado a uma sequência repetida com estrutura de grampo).
Esta associação origina o complexo tracRNA-crRNA, uma molécula de RNA dupla
fita que após ser processada pela RNase III é convertida em uma molécula híbrida
madura com função importante no que diz respeito à associação e direcionamento
de uma nuclease para eliminação do DNA invasor. Nesse sistema especificamente,
a nuclease envolvida na clivagem refere-se à Proteína Associada a CRISPR 9 (Cas9)
[1][2].
A alta taxa de insucesso, custo elevado e excesso de tempo necessário para
realização das metodologias disponíveis para edição gênica, tais como
Recombinação Homóloga (comumente empregada na manipulação genica de
células-tronco), Nucleases Dedos de Zinco (ZFN, do inglês Zinc Fingers Nucleases)
e Nucleases Efetoras semelhantes à Ativadores de Transcrição (TALENs, do inglês
Transcription Activator–like Effector Nucleases), estas duas últimas requerem o
reconhecimento em ambas as fitas de DNA para que a clivagem promovida por
nucleases sintetizadas especificamente para tais metodologias seja bem sucedida, o
que nos permite considerar tais métodos mais trabalhosos quando comparados ao
sistema CRISPR [4].
A junção de todos estes fatores fez com que a recente descoberta de um sistema
imune bacteriano contra fagos e plasmídeos invasores ganhasse destaque no que
diz respeito a técnicas de edição gênica e obtenção de organismos geneticamente
modificados (OGMs) [2][5][6].
Atualmente encontra-se disponível um gRNA (RNA guia) que consiste na
construção de uma molécula de RNA desenvolvida biotecnologicamente, com a
capacidade de mimetizar o que ocorre naturalmente em bactérias, e desta forma,
promover o direcionamento da nuclease Cas9 para uma sequência alvo específica
para que esta promova a clivagem e a sequência de interesse tornando esta
disponível para atuação da maquinaria de reparo da célula e assim, promover
edição da porção de interesse presente no genoma alvo. Tais fundamentos nos
permitem considerar o sistema CRISPR (CRISPR/Cas) uma técnica rápida, com
relativa facilidade de manipulação e baixo custo quando comparada a técnicas
anteriores [1][6]. No entanto, este sistema não é restrito a bactérias, o gigantesco
Mimivírus[7] se defende de invasores utilizando um semelhante sistema CRISPR
implementado por bactérias e outros microorganismos. O sistema de defesa do
Mimivírus pode levar a novas ferramentas de edição de genoma[8].
Histórico
Diversidade do Sistema
Mecanismo de Atuação da CRISPR
Aquisição de Protoespaçadores
Transcrição do locus CRISPR
Tipo I
Tipo II
Tipo III
Benefícios do Sistema
Índice
Aplicações
Regulação
Modelos celulares e animais
Mapeamento genômico e funcional
CRISPR no tratamento de doenças infecciosas
Correções de desordens genéticas
Problemas Éticos e Regulatórios e Riscos Biológicos
Funções
Referências
Originalmente encontradas no genoma de Escherichia coli em 1987 e descritas por
Yoshizumi Ishino e colaboradores [9], as sequências curtas intercaladas
regularmente só começaram realmente a ser investigadas no início dos anos 2000,
sendo então encontradas em diversos outros organismos procarióticos, tanto do
Histórico
Possível diagrama do mecanismo para CRISPR
domínio Bacteria, quanto Archaea [10], e em 2002 a sigla CRISPR (Clustered
Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) foi criada para denominar tais
sequências [11].
Somente em 2005 foram obtidas as informações necessárias para indicar a função
destes loci. Foi descrito que as sequências espaçadoras têm origem
extracromossômica, sendo derivadas de sequências de plasmídeos ou de vírus.
Além disso, foi também descrito que vírus tornam incapazes de infectar arqueias
que possuem sequências espaçadoras correspondentes ao seu genoma, inseridas
após uma infecção prévia [12][13][13][14].
No ano seguinte foi postulada a hipótese de que o CRISPR é um sistema de defesa
adaptativo de bactérias e arqueias que faz uso de RNA antisenso como assinaturas
de memória de invasões anteriores [15]. Esta proposta recebeu o suporte necessário
quando foi evidenciada experimentalmente em Streptococcus thermophilus [6],
levando a sua primeira aplicação no campo da biotecnologia, a fim de imunizar
bactérias utilizadas na indústria de laticínios contra infecção por bacteriófagos [16].
Evidências obtidas em seguida mostraram que as sequências espaçadoras de DNA
invasor intercaladas com os arranjos de repetições intrínsecas são transcritos em
grandes moléculas de RNAs, e estas são cortadas em pedaços menores pela
nuclease Cas9 auxiliada pelo tracrRNA, tornando-se crRNAs, que por sua vez
formam complexos com as proteínas tipo Cas. O complexo age de forma a impedir
a proliferação viral em bactérias, devido a capacidade de clivagem do DNA invasor
pela Cas9, o complexo tracrRNA-crRNA tem um papel fundamental no
direcionamento desta nuclease, tendo o DNA invasor como alvo [17][18][19]. Nos
últimos anos, estudos mostraram que aparentemente a Cas9 é a principal nuclease
envolvida no processo de clivagem de DNA invasor [20][21] dentre os vários tipos de
Cas descritos, algumas ainda precisam ter suas funções elucidadas.
Em 2011, foi demonstrado que é possível transferir a memória imune de uma
espécie de bactéria para outra, gerando novas possibilidades de aplicações do
mecanismo [22], o que levou aos estudos que mostraram que Cas9 purificadas são
capazes de clivar DNA alvo in vitro quando guiadas por crRNAs [23][24]. O que
resultou na utilização do sistema CRISPR como uma ferramenta de engenharia
genética, tornando possível editar com sucesso o genoma de células de mamíferos,
assim como de inúmeros outros sistemas modelos [2][25][26].
O locus CRISPR é composto por cerca de 20 a 50 pares de base, normalmente
dispostos simetricamente, o que favorece a formação de uma estrutura em
“grampo” ou “hairpin”. Neste locus são encontradas repetições separadas por
protoespaçadores de tamanho similar, os quais podem ser adicionados
rapidamente como parte da resposta imune bacteriana contra infecção ocasionada
por fagos além de variar em tamanho e sequência [1][12].
Têm sido descrito que dentre os 198 genomas completos disponíveis no banco de
dados NCBI, é possível encontrar cerca de 50 genomas onde o gene Cas1 está
presente [12]. Além disso, sabe-se quea grande maioria dos “protoespaçadores”
possui homologia com genes conhecidos, frequentemente provenientes de
elementos extra-cromossômicos tais como fagos e plasmídeos [12]. Em Yersinia
pestis estas repetições ocorrem preferencialmente pela absorção do DNA de
bacteriófagos [1].
O primeiro estudo demonstrando como ocorre o direcionamento do complexo
CRISPR/Cas9, de modo a permitir a ligação com a sequência complementar do
gene alvo, e eliminação de um agente infeccioso em bactérias ocorreu em
Streptococcus thermophilus em 2010 [1][20].
Atualmente, sabe-se que este distinto sistema imune pode ser dividido em três
tipos principais, baseado na conservação dos genes e organização dos loci (CRISPR
Tipo I, Tipo II e Tipo III) [27].
Uma particularidade do sistema CRISPR Tipo I se dá pela presença de ao menos
um gene que codifique a nuclease Cas3, a qual participa ativamente na clivagem de
uma molécula de DNA invasor [27].
O sistema CRISPR Tipo II é considerado o mais robusto para aquisição de
plasmídeos e fagos. Nele são encontrados apenas quatro genes, dentre os quais
sempre haverá ao menos um gene que codifique a nuclease Cas9, a qual pode
Diversidade do Sistema
participar tanto no processamento de RNA quanto na eliminação do DNA alvo
[5][27].
Uma peculiaridade pode ser observada no sistema CRISPR Tipo III, que foi
subsequentemente dividido em dois subtipos. Tais sistemas foram denominados
como CRISPR TipoIII-A, o qual é capaz de atuar sobre DNA plasmidial in vivo, e
CRISPR Tipo III-B responsável pela clivagem apenas de RNA fita simples in vitro.
Estas observações sugerem que seja possível a existência de diferentes mecanismos
de atuação envolvendo subtipos distintos de CRISPR [1][27].
Vale ressaltar a possibilidade de encontrar mais de um sistema CRISPR em um
mesmo organismo, o que claramente demonstra a compatibilidade entre estes
sistemas, bem como a possibilidade de compartilhamento dos componentes
funcionais presentes nos diferentes sistemas [1].
Recentemente, verificou-se a capacidade de fagos em promover mutações em seu
genoma de modo a conseguir evadir a resposta imune bacteriana. Esta capacidade
tem sido considerada o modelo básico de evolução CRISPR, uma vez que tais
mutações impossibilitam a complementaridade do sistema tracRNA/crRNA com o
fago e, portanto, impedem a associação com a nuclease Cas9 e a subsequente
clivagem do DNA invasor [17][28]. No entanto, os cientistas que disseram que o
CRISPR é perigoso não podem sequer replicar seus próprios resultados.[29]
De maneira geral, todos os mecanismos CRISPR expressam as mesmas vias de
aquisição, expressão e interferência, conforme descrito a seguir [27]:
a) Aquisição de novos protoespaçadores: Geralmente realizada através do
reconhecimento e clivagem de ácidos nucleicos exógenos mediados por Cas1 e Cas2
para sua integração ao cromossomo bacteriano em regiões conhecidas como locus
CRISPR [27].
b) Transcrição completa do locus CRISPR como um pre-crRNA:
Processamento e amadurecimento do transcrito em pequenas moléculas de RNA
(crRNA) capazes de reconhecer uma única sequencia alvo [27].
Mecanismo de Atuação da CRISPR
c) Associação com proteínas Cas: Formação de complexo ribonuclear capaz
de guiar nucleases de maneira especifica em direção ao DNA alvo presente em
bacteriófagos e plasmídeos [27].
A integração de uma nova informação nos loci CRISPR inicia-se pela imunidade
bacteriana mediada por esse sistema, onde uma pequena porção do DNA invasor, é
integrada ao locus CRISPR do hospedeiro como um protoespaçador através da
atuação de nucleases específicas [1].
Devido à alta afinidade encontrada entre a nuclease Cas1 e ácidos nucleicos, tem
sido sugerido que esta enzima possua papel significativo no que se refere a
integração e aquisição de novos protoespaçadores. Além disso, a ausência de
necessidade de uma sequencia especifica de nucleotídeos para o acontecimento
deste tipo de ligação com a Cas1 reforça esta ideia, uma vez que esta poderia atuar
sobre qualquer seqüência protoespaçadora presente no genoma viral [1].
Outro ponto importante a ser destacado no que diz respeito a aquisição de novos
protoespaçadores é a importância da manutenção da estrutura do locus. Desta
forma, seguida da adição de um novo protoespaçador, uma nova sequencia de
repetição CRISPR é sintetizada favorecendo a organização “repeat-spacer-repeat”,
essencial para o reconhecimento do locus CRISPR [1].
A organização do locus CRISPR tem sido sugerida como ferramenta de grande valia
para a distinção entre um DNA invasor e o do genoma hospedeiro pela maquinaria
de reparo celular. Além disso, há relatos de que a seqüência líder possua elementos
capazes de promover o recrutamento deste mecanismo de reparo celular de modo a
favorecer a integração do protoespaçador no DNA bacteriano [1].
Os sinais moleculares envolvidos neste processo de distinção ainda não estão
completamente elucidados. Contudo, o mapeamento das sequências espaçadoras
presentes nos genomas virais revelam uma seqüência de poucos nucleotídeos de
comprimento próxima ao protoespaçador, denominada Motivo Adjacente ao
Protoespaçador (Protospacer Adjacent Motif - PAM) [12][30].
Aquisição de Protoespaçadores
Cada domínio PAM pode ter a sequência variável de acordo com o tipo de sistema
CRISPR, sugerindo que proteínas Cas presentes nos distintos tipos de CRISPR
estejam envolvidas no reconhecimento do domínio PAM [1][5][31].
O sistema CRISPR Tipo I pode ser dividido em 6 subtipos categorizados de A a F.
Neste sistema, a transcrição do locus CRISPR é seguida pela dobragem sobre si
mesma das sequências repetidas para formar estruturas em grampo (hairpins)
entre os protoespaçadores, seguida da clivagem do transcrito mediada pela
nuclease Cas6e/f originando crRNA [32]. Um complexo efetor conhecido como
Cascade (Complexo associado a CRISPR para defesa antiviral) reúne cinco
proteínas Cas [32][33] ligadas ao crRNA. Este complexo é direcionado à sequência
apropriada presente no DNA invasor por meio de reconhecimento do domínio PAM
na fita complementar do crRNA [34]. Uma vez que a identificação da sequência
tenha sido estabelecida, uma mudança conformacional em Cascade recruta Cas3, a
qual cliva o ácido nucleico invasor de modo sequência-específica [32].
O sistema do tipo II é comumente encontrado em Archaea e pode ser dividido em 3
subtipos distribuídos de A a C [32].
Neste caso, a transcrição do locus CRISPR é seguida pelo pareamento de bases do
tracrRNA à sequência repetida localizada entre os protoespaçadores [32]. A
clivagem do dsRNA pela RNaseIII em fragmentos de sequências formadas por um
único proto-espaçador [21] juntamente com a porção 3’ da sequência repetida é
denominado crRNA [31]. O tracrRNA se liga à sequência repetida complementar do
crRNA e essa molécula híbrida associa-se à nuclease Cas9 para promover o seu
direcionamento à sequência apropriada do DNA invasor usando o domínio PAM
como guia [31]. A proteína Cas 9 é constituída por cerca de 800-1400 aminoácidos,
com uma estrutura de 2 lóbulos [35] que possui dois sítios com atividade nuclease:
O RuvC-like (RNase-H fold) responsável pela clivagem da sequencia não alvo e o
Transcrição do locus CRISPR
Tipo I
Tipo II
domínio HNH (McrA-like) responsável pela clivagem da sequencia alvo [31].
Posterior ao reconhecimento, a clivagem do DNA invasor mediada pelo complexo
Cas9-crRNA-tracrRNA é realizada importante destacar que ao contrario do sistema
Tipo I, o reconhecimento do domínio PAM no sistema Tipo II ocorre na mesma fita
do crRNA [36][37].
Sistemas CRISPR CAS Tipo III compreendem dois subtipos, III-A e III-B, ambos
possuem o gene CAS 10 específico dos sistemas Tipo III, entretanto podem ser
diferenciados pelos genes acessórios: csm no subtipo III-A e cmr no subtipo IIIB
[27]. Além disso, eles não requeremdomínios PAM para o reconhecimento da
sequencia alvo por parte do crRNA ou para sua clivagem [32]. A transcrição do locus
CRISPR é seguida pela ligação do transcrito ao redor de Cas6 e pela clivagem 8
nucleotídeos a montante da junção entre a sequência repetida e o protoespaçador.
Isto resulta em uma série de protoespaçadores com sequências repetidas nos dois
extremos, 5’ e 3’, similar aso Tipo II [32]. Entretanto, enquanto no Tipo II a
clivagem é realizada no extremo 5’ deixando a porção 3’ da sequência repetida
ligada ao protoespaçador, no Tipo III a clivagem ocorre no extremo 3’ e deixa cada
protoespaçador com a porção 5’ da sequência repetida [32].
No Tipo III-A a maturação do crRNA intermediário é essencial para a interferência
dirigida. De fato, enquanto os crRNAs intermediários podem ser ligados dentro do
complexo proteico csm-Cas10 (conforme mencionado abaixo), o subsequente
complexo ribonucleoprotéico é incapaz de degradar o DNA invasor [38].
No Tipo III-B o crRNA é tomado pelo complexo de proteínas conhecido como cmr
(módulo Cas RAMP, proteínas misteriosas associadas a repetições) [37]. Diferentes
proteínas membros dos módulos RAMP podem ser expressas entre diversas
espécies. Os complexos cmr usualmente consistem de várias proteínas Cas
(tipicamente Cas1-6) [37]. De fato, existem diversas famílias identificadas dos
complexos cmr que quando complexadas com Cas10 realizam clivagem de RNA
através da interação de complementaridade de pares de bases do crRNA com o
RNA invasor [36].
Tipo III
Os sistemas do Tipo III-A são geralmente caraterizados pela presença de genes csm
(tipicamente csm 2-5 – membros da superfamília RAMP) os quais, da mesma
forma que os genes cmr, codificam para proteínas envolvidas na formação do
complexo com Cas10 e subsequente degradação do DNA invasor guiado por crRNA,
num modo sequência específico [32].
Inúmeras são as vantagens obtidas pelo emprego do sistema CRISPR uma vez que
trata-se de uma metodologia rápida, fácil com baixo custo e principalmente com
alta taxa de sucesso devido a sua alta sensibilidade para o reconhecimento de
sequências específicas presentes no DNA alvo de células em cultura ou até mesmo
em modelos animais [30].
Com o emprego desta metodologia é possível avançar mais rapidamente no ramo
da engenharia genética e no estudo funcional gênico, o que pode ser justificado pela
capacidade desta ferramenta em excluir ou modificar genes específicos para
obtenção de organismos geneticamente modificados passíveis de serem
empregados como modelo de estudo para compreensão de condições
fisiopatológicas nas mais diversas espécies [5][39].
Aplicações de CRISPR abrangem quase todos os setores envolvendo sistemas
biológicos. Danisco (DuPont) foi um dos pioneiros na utilização comercial da
tecnologia CRISPR para aumentar a imunidade viral em bactérias utilizadas para a
produção de iogurtes e queijos [40].
Aplicações na agricultura têm obstáculos regulatórios mais baixos do que aplicação
biomédica e alguns desses mercados preveem o retorno dos investimentos muito
rapidamente. Dow AgroSciences desenvolveu propriedade intelectual com
Sangamo Biosciences para o desenvolvimento de culturas geneticamente
modificadas utilizando Cas9, e Cellectis Ciências Vegetais está levando a tecnologia
para as plantações [41].
Benefícios do Sistema
Aplicações
CRISPR tem o potencial para se tornar uma força importante na ecologia e
conservação, especialmente quando combinada com outras ferramentas de biologia
molecular. Pode, por exemplo, na criação de genes que atrasem disseminação de
espécies invasoras como ervas daninhas. Pode vir a ser o próximo grande salto na
conservação ou melhoraria do meio ambiente [42]. Aplicações baseadas em Cas9 na
indústria agrícola e em setores da saúde humana encontram-se em crescimento
acelerado. Estes mercados incluem: terapia gênica, terapia celular e imunoterapia,
o desenvolvimento rápido e eficiente de pesquisa de animais transgênicos,
descoberta de medicamentos, bem como a validação de alvo e de triagem [43].
A modulação da transcrição de diferentes alvos genéticos tem usado cada vez mais
a tecnologia CRISPR/Cas9 em substituição aos modelos atuais, como RNA
interferência, ZFN e TALENs. Estas técnicas apresentaram limitações por serem
trabalhosas e demoradas, enquanto que nas primeiras tentativas de inativação de
gene alvo com CRISPR/Cas9 foram obtidos bons resultados [44].
Conforme citado anteriormente, o uso em produtos laticínios é um dos principais
exemplos de aplicação. Tais produtos comumente sofrem infecções por fagos o que
prejudica ciclos de fermentação normais e diminui a qualidade do produto final.
Para contornar esse problema as indústrias criaram cepas de bactérias resistentes a
fagos [45].
A técnica se baseia no sistema CRISPR tipo II com uso da S. thermophilus, já
envolvida no processo de acidificação do leite. Com a edição do gene alvo e ação das
enzimas Cas, há o controle do espaçador e defesa contra fagos. Tal procedimento
permite o isolamento de cepas resistentes a vários bacteriófagos, mas que ainda
conservam as mesmas propriedades de cultura original [6][46] .
Experimentos de perturbação dos genes para analisar sua função ou esclarecer a
causa de variantes genéticos têm sido feitos com facilidade diante da simplicidade
da Cas9 em direcionar um RNA guia. Assim, uma variedade de proteínas ou ssRNA
podem ser ligados a Cas9 ou sgRNA (single guide RNA) para modificar a
transcrição específica de genes, monitorar posição da cromatina, ou até mesmo
manipular a organização tridimensional do genoma [6].
Regulação
A caracterização dos fenótipos da doença é um dos principais objetivos para a
geração de animais geneticamente modificados. Transformações genéticas em
animais, simulando as mutações encontradas em humanos, permitem determinar a
função de genes, estruturas reguladoras e confirmação de resultados obtidos em
cultura de células [44].
A edição genômica mediada por Cas9 permitiu geração acelerada de modelos
geneticamente modificados e ampliando as pesquisas biológicas tradicionais de
estudo de organismos-modelo, podendo ser aplicada para desenvolver novas
modificações gênicas com introdução ou correções de mutações específicas in vivo
[2][31]
.
Como exemplo disso, já foi possível observar modificações de genes alvo de forma
eficaz através da micro-injeção em células embrionárias de peixe-zebra, injetando
mRNA que codifica uma Cas9 personalizada. Ou ainda a injeção de Cas9/mRNA e
sgRNAs com diferentes genes alvos de zigotos de camundongos, levando ao
desenvolvimento de mutações em determinados alelos, reforçando que a utilização
de CRISPR/Cas pode ser empregado para a modificação de múltiplos genes ao
mesmo tempo [47].
A partir de 1981 foram desenvolvidos os primeiros camundongos transgênicos, e
processo precisou ser melhorado até se alcançar uma metodologia mais adaptável e
fácil de usar [48]. Os métodos tradicionais para criar modelos de animais
geneticamente modificados costumavam levar de 8 a 13 meses de trabalho,
tornando-se um processo laborioso e custoso, já usando CRISPR /Cas9, para criar
animais transgênicos, foi possível observação de fenótipo albino após uma única
micro-injeção em embriões de camundongo da linhagem C57BL/6J, ressaltando
que este tipo de roedor tem como característica pelagem marrom escuro [48].
Dessa maneira, podemos perceber que CRISPR simplifica o desenvolvimento de
animais para estudo em pesquisa que simulem doenças ou exponham as
consequências quando um gene é nocauteado ou mutado de maneira especifica
[31]. 
Modelos celulares e animais
A identificação de genes responsáveis por um dado fenótipo de interesse é facilitada
pelo sistema CRISPR/Cas9, devido a sua habilidade de alterar diferentes alvos,
individualmente ou mesmo simultaneamente[47]. Estudos realizados com a
tecnologia de CRISPR estão confirmando sua capacidade de rastreio genômico
através da manipulação dos domínios catalíticos de Cas, sendo possível a
construção de sistemas de repressão (CRISPRi) e ativação (CRISPRa) [47].
A CRISPRi é usada para controle da transcrição com uso de Cas9 (dCas9) com
mutações nos domínios catalíticos tornando-a deficiente em atividade nucleolítica
ou através de sgRNA sendo utilizado como alvo na região do promotor, gerando
impedimento estérico na associação entre os motivos de DNA e seus fatores de
transcrição, levando a contenção do início da transcrição. Sendo assim, CRISPRi é
uma forma eficiente de redirecionamento do genoma para a manipulação da
transcrição sem modificar a sequência de alvo de DNA [49].
CRISPRa tem como objetivo aumentar a transcrição de certo gene com o uso da
dCas9, citada anteriormente, fusionado a domínios de ativação da transcrição e
esse complexo é direcionados para a região promotora de genes endógenos,
possibilitando a modulação da expressão do gene [50].
CRISPRi e CRISPRa em estudos de escala genômica vem buscando genes
endógenos que atuem como repressores ou ativadores transcricionais relacionados
a supressão de tumores, regulação de diferenciação e a sensibilidade celular para
cólera ou toxina da difteria, por exemplo, demonstrando suas aplicações como
ferramentas fundamentais para complexos de mapeamento [51].
Conforme definição o complexo CRISPR/Cas age como um sistema imune
adaptativo antiviral em bactérias, dessa forma, pode ser empregado para o
tratamento de doenças infecciosas em indivíduos contaminados pela eliminação do
genoma do agente infeccioso [47].
Mapeamento genômico e funcional
CRISPR no tratamento de doenças infecciosas
O uso desse sistema tem destaque especial na terapia de HIV através do bloqueio
da proliferação do vírus. Demonstrou-se que perturbação da região LTR (repetições
longas terminais) pode ser realizada em vírus HIV-1. O DNA do vírus contém duas
regiões LTR e ambas as extremidades podem se integrar ao genoma, o que significa
que o sistema CRISPR/Cas9 tem a capacidade de remover a sequência do HIV
associado por clivagem em ambas as LTRs, retirando assim a sequência de HIV
integrada ao DNA de indivíduos infectados. A técnica ainda se encontra em um
estágio inicial, mas se mostra muito promissora na determinação de alvos através
de um sistema de entrega segura e eficaz [47][52].
A tecnologia CRISPR-Cas9 também vem sendo amplamente estudada como
ferramenta na cura de doenças genéticas. Usando camundongos como modelo, por
exemplo, a falha genética causadora da catarata foi corrigida (reparo do fenótipo
funcional da doença) pela injeção de CRISPR/Cas9 em zigotos. De acordo com
análises de sequenciamento de DNA, foram observadas que as modificações
necessárias ocorreram somente no alelo mutante dos animais portadores da doença
e não afetaram os demais genes, confirmando a especificidade do sgRNA em atingir
exclusivamente o alelo mutante [53].
Camundongos já foram usados como modelo na correção do gene mutante da
distrofina, evitando o desenvolvimento de distrofia muscular e também no reparo
do locus do receptor transmembranar da fibrose cística por recombinação
homóloga de células-tronco intestinais cultivadas de pacientes humanos com esta
doença, evidenciando a CRISPR como técnica promissora para a terapia genética
em pacientes humanos [47]. Os pesquisadores têm utilizado para tratar uma forma
grave de distrofia muscular em camundongos. Eles empregaram CRISPR/Cas para
cortar a parte de um gene defeituoso com distrofia muscular de Duchenne,
permitindo que os animais a fazer uma proteína muscular essencial. A abordagem é
a primeira vez que CRISPR foi entregue com sucesso por todo o corpo para o
tratamento de animais adultos com uma doença genética[54].
Correções de desordens genéticas
Como toda aplicação do ramo da Biotecnologia, o uso da nova técnica traz à tona
discussões nos campos da ética e da segurança biológica, em grande parte pelo fato
de que suas aplicações estão fortemente ligadas a interesses econômicos de diversos
grupos e empresas.
Atualmente já se negociam bilhões de dólares e travam-se na justiça disputas
acirradas sobre vários aspectos das patentes que podem ser geradas.
Citando o artigo publicado no jornal Zero Hora pela Professora Cristina Bonorino,
titular de Imunologia da PUCRS e pesquisadora 1C do CNPq:
"As pesquisadoras que primeiramente desvendaram o mecanismo de
funcionamento do sistema CRISPR, duas da Universidade da Califórnia em
Berkeley, Jenifer Doudna e Jill Banfield, e a francesa Emmanuelle Charpentier,
patentearam o sistema pensando no potencial para testes diagnósticos de vírus.
Publicaram seus achados na Science em 2012, e seguiram-se uma enxurrada de
premiações, milhões de dólares captados para as empresas de biotecnologia que
fundaram e sua inclusão na lista das 100 pessoas mais influentes no mundo pela
revista Time. Enquanto isso, a DuPont anuncia que alimentos editados com
CRISPR estarão em nossas mesas em menos de cinco anos. Eles também
patentearam usos do sistema para modificar sementes e probióticos.
Paralelamente, um pesquisador do Massachussets Institute of Technology (MIT),
Feng Zhang, trabalhava em uma versão do CRISPR altamente focada. As
pesquisadoras que descobriram o CRISPR descreviam o seu mecanismo de ação.
Zhang queria ser o primeiro a usar o sistema para editar genomas humanos. Ele
escreveu essa patente, com esse foco, e o MIT depositou-a logo após a de Berkeley.
Contudo, o depósito do MIT entrou numa categoria acelerada – para a qual se
paga uma taxa a mais no depósito (!) e ele ganhou a prioridade. Isso importa
muito no meio da propriedade intelectual, e vale muito, muito dinheiro. Qualquer
empresa que quiser trabalhar com algum organismo outro que não bactérias,
precisa licenciar a patente de Zhang. Bilhões de dólares estão em jogo, e ambas as
instituições entraram com recursos e digladiam-se na justiça pelos direitos. Todos
Problemas Éticos e Regulatórios e
Riscos Biológicos
os pesquisadores fundaram startups de biotecnologia que vêm recebendo capital
de investidores, como a megafarma Novartis. Mas quem conseguir a patente de
editar células humanas vai com certeza ser o centro das atenções." [55]
Apesar do otimismo despertado pelo desenvolvimento na utilização desta nova
ferramenta da biotecnologia, os riscos envolvidos na manipulação genética
indiscriminada de organismos não devem ser minimizados em prol de interesses de
mercado, sendo essencial a continuidade das pesquisas, desenvolvimento de
protocolos adequados de controle e estabelecimento de marcos regulatórios através
de discussão dos aspectos técnicos e sócio ambientais, com a consideração dos
riscos e ganhos advindos de sua utilização.
Como verificamos CRISPR apresenta diversos campos de aplicação, assim suas
funções podem ser resumidas em:
Edição - Adição ou supressão de bases do DNA em um ou mais genes;
Repressão – Controle do gene através do bloqueio da transcrição, sem
necessidade de alteração de local especifico.
Ativação – Pela inserção de fatores de transcrição e redirecionamento da
CRISPR em determinadas regiões promotoras do gene.
1. Wiedenheft, Blake; Samuel H. (1 de janeiro de 2012). «RNA-guided genetic
silencing systems in bacteria and archaea» (http://www.nature.com/doifinder/1
0.1038/nature10886). Nature. 482 (7385). doi:10.1038/nature10886 (https://dx.
doi.org/10.1038%2Fnature10886)
2. Sander, Jeffry D; J Keith (1 de janeiro de 2014). «CRISPR-Cas systems for
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0.1038%2Fnbt.2842)
3. Lead CRISPR Scientist TalksResearch Origins, Ethics (https://www.chicagoma
roon.com/article/2018/5/8/CRISPR-jennifer-doudna-researcher-genomic-editing
-ethics/) por Emma Dyer (2018)
Funções
Referências