Introdução as analises bioquimicas - Espectrofotometria

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INTRODUÇÃO ÀS ANÁLISES BIOQUÍMICAS
CONCEITOS INICIAIS PARA AS PRÁTICAS
Os laboratórios de análises clínicas são fundamentados em um processo dinâmico que se inicia na coleta do espécime diagnóstico (amostra biológica obtida adequadamente para fins de diagnóstico laboratorial) e termina com a emissão de um laudo. Didaticamente, o processo pode ser dividido em três fases: pré-analítica, analítica e pós-analítica.
A fase pré-analítica consiste na preparação do paciente, coleta, manipulação e armazenamento do espécime diagnóstico, antes da determinação analítica. Ou seja, engloba todas as atividades que precedem o ensaio laboratorial, dentro ou fora do laboratório de análises clínicas. 
A fase analítica inicia-se com a validação do sistema analítico, através do controle da qualidade interno na amplitude normal e patológica, e se encerra, quando a determinação analítica gera um resultado. 
Já a fase pós-analítica, inicia-se, após a geração do resultado analítico, quantitativo e/ou qualitativo, sendo finalizada, após a entrega do laudo conforme legislação vigente.
Amostras: Urina, sangue total, plasma, soro, líquido sinovial, líquor, líquido pleural.
Amostras sanguíneas: As dosagens bioquímicas podem ser realizadas no soro (obtido a partir de sangue coletado sem anticoagulantes) ou no plasma (obtido de sangue coletado com anticoagulantes). A única diferença analítica entre soro e plasma é que o primeiro não contém fibrinogênio, o qual foi utilizado para a formação do coágulo (fibrina). No caso de utilização do soro, é necessário um período de 30 a 180 minutos para a formação do coágulo e a completa obtenção do soro.
ESPECTROFOTOMETRIA 
Muitas determinações realizadas no laboratório clínico são baseadas em medições de energia radiante transmitida, absorvida, dispersa ou refletida sob condições controladas. Quando usamos a espectrofotometria como processo de medida, basicamente estamos empregando as propriedades dos átomos e moléculas de absorver e emitir energia eletromagnética em uma das muitas áreas do espectro eletromagnético.
Quando a energia radiante monocromática atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com: (1): aumento da espessura da solução e (2): aumento da concentração ou intensidade de cor da solução. Estes dois conceitos são denominados de Lei de Lambert-Beer.
Quando se realiza uma medida fotométrica deve-se utilizar uma faixa do espectro na qual a energia radiante seja absorvida ao máximo ou aproximadamente ao máximo a fim de se obter o mais alto grau de sensibilidade. Uma solução azul absorve o vermelho com maior intensidade e, portanto deve ser escolhida a porção vermelha para medida de solução azul. Na maioria das determinações colorimétricas utiliza-se sempre uma faixa espectral cuja cor é complementar à da solução a ser medida.
O espectrofotômetro :
• Gera energia luminosa
• Seleciona um comprimento de onda de luz específico
• Passa o raio de luz através da amostra
• Mede a mudança na intensidade da luz na passagem
pela amostra
• Mostra a intensidade do sinal em um display
LEI DE LAMBERT-BEER – RELAÇÃO ENTRE TRANSMITÂNCIA, ABSORBÂNCIA E CONCENTRAÇÃO
A Lei de Beer estabelece que a concentração de uma substância seja diretamente proporcional à intensidade de luz absorvida ou inversamente proporcional ao logaritmo da luz transmitida
O uso do Branco em fotometria é necessário para estabelecer a absorbância zero do reagente utilizado. Exemplo: Reação das Proteínas Totais onde o Reagente de Biureto apresenta uma absorbância em 545 nm em torno de 0,120. Ao utilizarmos o Reagente como Branco, para zerar o equipamento, estamos eliminando a contribuição desta absorbância nos resultados.
Também utilizamos o padrão, substância que é colocada com o reagente e que tem a concentração conhecida, após determinação da absorbância da substância padrão, podemos utilizar o valor da sua concentração para obtermos o valor da concentração do analito na amostra analisada.
São caracterizados como Lineares os sistemas analíticos que, no intervalo operacional especificado, respondem de modo proporcional à concentração do analito na amostra. Dessa forma, quando o método é linear, ele obedece a lei de Lambert-Beer até uma determinada concentração, ou seja, a absorbância aumenta proporcionalmente com o aumento da concentração do analito. 
O limite da linearidade é o limite de concentração para o qual a lei de Lambert-beer é válida, ou seja, a partir de uma determinada concentração a absorbância não terá mais uma relação de proporcionalidade. 
Exemplo: Na dosagem de Glicose, o padrão passa pelas mesmas etapas da amostra. Se a concentração do padrão é de 100 mg/dL empregamos a seguinte fórmula: 
CONCENTRAÇÃO DO TESTE (Mg/dL) = ABSORBÂNCIA DO TESTE X 100
 
 ABSORBÂNCIA DO PADRÃO
MANUSEIO CORRETO DE PIPETAS AUTOMÁTICAS DE VOLUME FIXO