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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA 
CENTRO DE TECNOLOGIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E 
TECNOLOGIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
TALIANA KÊNIA ALENCAR BEZERRA 
 
 
 
POTENCIAL FUNCIONAL DE CRISTAS E BARBELAS DE 
FRANGO: OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE 
PEPTÍDEOS BIOATIVOS 
 
 
 
JOÃO PESSOA - PB 
2017 
2 
 
TALIANA KÊNIA ALENCAR BEZERRA 
 
 
 
 
 
 
POTENCIAL FUNCIONAL DE CRISTAS E BARBELAS DE 
FRANGO: OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE 
PEPTÍDEOS BIOATIVOS 
 
 
 
 
 
 
 
JOÃO PESSOA - PB 
2017 
3 
 
TALIANA KÊNIA ALENCAR BEZERRA 
 
 
 
POTENCIAL FUNCIONAL DE CRISTAS E BARBELAS DE 
FRANGO: OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE 
PEPTÍDEOS BIOATIVOS 
 
 
 
Tese de Doutorado apresentado ao 
Programa de Pós-graduação em 
Ciência e Tecnologia de Alimentos, 
do Centro de Tecnologia, da 
Universidade Federal da Paraíba em 
cumprimento aos requisitos para 
obtenção do título de Doutor em 
Ciência e Tecnologia de Alimentos. 
 
 
 
Orientadora - Prof
a
. Dra. Marta Suely Madruga 
Co-orientadora - Prof
a
. Dr
a
. Maria Teresa Bertoldo Pacheco 
 
 
 
JOÃO PESSOA - PB 
2017 
4 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
B574p Bezerra, Taliana Kênia Alencar. 
Potencial funcional de cristas e barbelas de frango: 
obtenção e caracterização de peptídeos bioativos / Taliana 
Kênia Alencar Bezerra. - João Pessoa, 2017. 
104 f.: il. - 
 
Orientadora: Marta Suely Madruga. 
Coorientadora: Maria Teresa Bertoldo Pacheco. 
Tese (Doutorado) - UFPB/ CT 
 
1. Tecnologia dos alimentos. 2. Frango - subprodutos. 
3. Carne de frango – produção e consumo. 4. Colágeno. 
5. Hidrolisado proteico. 6. Peptídeos antioxidantes. I. Título. 
UFPB/BC CDU: 664(043) 
 
 
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A Deus, pelo seu amor incondicional 
A minha mãe, Penha Bezerra, pelas suas orações e seu amor 
Ao meu marido, Igor Costa, por seu amor e companheirismo 
Dedico 
 
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AGRADECIMENTOS 
 
A Deus, pela vida e pela força para enfrentar todas as dificuldades. 
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa 
concedida. 
Ao Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, a todos os 
professores que o compõem e a secretária, Lindalva, por todo apoio e dedicação. 
A Prof
a
. Dr
a
. Marta Suely Madruga, pela excelente orientação, pela oportunidade de 
realização deste trabalho, confiança, por todo o conhecimento repassado e por todo 
carinho e amizade. Obrigada. 
A Prof
a
. Dr
a
. Maria Teresa Bertoldo Pacheco, pela co-orientação, correções e 
principalmente pelo apoio e dedicação da execução desta tese. Obrigada. 
A minha mãe, Penha Bezerra, pelo exemplo de mulher e de honestidade, por todo amor 
incondicional e orações. Mãe, amor eterno. 
Ao meu pai, Severino Bezerra (in memoriam), que onde quer que esteja nunca deixará 
de me amar. Pai, amor eterno. 
Ao meu marido, Igor Costa, pela força durante todos os momentos, pelo carinho, amor, 
paciência e compreensão por todos os períodos difíceis e de ausência. Te amo muito. 
Aos meus irmãos Romulo, Tatiana e Taciana, por todo apoio, confiança e carinho. Amo 
muito vocês. 
Aos meus lindos e amados sobrinhos Guívia, Karol, Lara e Gabriel, por fazerem minha 
vida mais colorida, feliz e leve. 
A toda a equipe MADRUGA (Narciza, Angela, Ana Rita, Fábio, Valquíria, Iris, Leila, 
Thayse, Darlinne, Sérgio, Ana Maria e Mércia), por toda ajuda e pela amizade, além de 
tudo. Meus dias ficaram mais alegres com a presença de vocês. 
As minhas queridas amigas lindas que enfrentaram junto comigo todas as batalhas do 
Doutorado, Narciza, Geany e Rayssa e pela amizade. 
As minhas Luluzinhas de hoje e sempre, Carine, Diva, Renata, Aline, Adma e Keliane, 
por todo apoio concedido e amizade. 
A todos os meus amigos do PPGCTA, em especial Lorena e Edilza. 
 A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste sonho. 
 
 
8 
 
RESUMO 
A crista e a barbela do frango fazem parte dos subprodutos que apresentam elevada 
quantidade de proteínas colagenosas, sendo consideradas matérias-primas promissoras 
para a obtenção de peptídeos bioativos. O objetivo desta pesquisa foi desenvolver 
procedimento tecnológico voltado a um melhor aproveitamento dos subprodutos cristas 
e barbelas de frango. Para tanto foram realizados estudos de hidrólise proteica da 
mistura de crista e barbelas (1:1 p/p) para produção de peptídeos com bioatividades de 
quelação ao mineral ferro e capacidade antioxidante. Inicialmente foi avaliada a 
composição centesimal, perfil de minerais e a qualidade proteica (% colágeno, % 
aminoácidos totais e livres, perfil de hidrofobicidade e perfil eletroforético) da crista, 
barbelas e sua mistura (1:1 p/p). Estes subprodutos apresentaram elevada concentração 
de proteínas (61 a 83% b.s.) com destaque para as proteínas de origem colagenosa (47 a 
51% b.s.). O perfil de aminoácidos apresentou elevado teor de ácido glutâmico (10,01 
g/100g), ácido aspártico (7,38 g/100g), glicina (9,05 g/100g). Os minerais ferro (8 
mg/100g), fósforo (337 mg/100g) e zinco (2,62 mg/100g) também foram encontrados 
em grandes quantidades nos subprodutos, destacando-se como fontes destes nutrientes. 
Foi realizada uma analise comparativa de melhor atividade proteolítica para seleção da 
enzima (Alcalase, Flavourzyme, Protamex, Brauzyn e Colagenase), a ser utilizada na 
hidrolise da mistura crista e barbelas (1:1 p/p). A enzima Alcalase apresentou o maior 
grau de hidrólise (DH = 19%) em comparação com as demais proteases (DH < 3%). 
Definida a enzima foi realizada a otimização do processo de hidrólise com a Alcalase. 
Mediante a avaliação foram selecionados os experimentos que obtiveram o menor grau 
de hidrólise (< GH: relação enzima substrato de 1% e 60 min de hidrólise) e o maior 
grau de hidrólise (> GH: relação enzima substrato de 5% e 240 min de hidrólise). Os 
hidrolisados selecionados foram analisados em relação ao seu perfil proteico (% 
aminoácidos totais e livres, perfil de hidrofobicidade e perfil eletroforético), perfil de 
minerais e caracterizados quanto a sua capacidade quelante ao ferro e antioxidante 
(ABTS, DPPH e FRAP). O hidrolisado de >GH exibiu maiores quantidades de 
peptídeos com baixo peso molecular e caráter hidrofílicos, além de maiores quantidades 
de aminoácidos livres. Ambos os hidrolisados (> GH e < GH) apresentaram 
concentrações de minerais que os caracterizam como fontes Fe, F e Zn. Quanto a 
bioatividade os hidrolisados exibiram capacidade quelante ao Fe
2+
 (> 94%) e atividade 
antioxidante através da inibição dos radicais ABTS
●
 (> 46%), DPPH
● 
(> 41%) e FRAP 
9 
 
por redução do Fe
3+
 (> 95 mg / 100 g equivalente trolox). As cristas e barbelas 
apresentam potencial para elaboração de hidrolisados, fonte de minerais e peptídeos 
funcionais com bioatividades, como capacidade antioxidante e capacidade quelante ao 
mineral ferro. Com isto foi registrado a patente de processo de obtenção dos peptídeos 
bioativos da mistura de crista e barbela de frango - BR 10 2016 027430 3. 
 
Palavras-chave: Colágeno, hidrolisado proteico, peptídeos antioxidantes, processo 
enzimático, subprodutos de frangos.10 
 
ABSTRACT 
The chicken’s comb and wattle are part of the by-products they are composed of a large 
number of collagenous proteins, they are considered a promising source for obtaining 
bioactive peptides. The objective of this thesis was to develop a technical procedure 
aimed at making better use of the chicken’s comb and wattle. For this, the authors 
carried out studies on the protein hydrolysis of a comb/wattle mixture (1:1 w/w), 
focusing on the production of peptides with bioactivities such as iron chelation and 
antioxidant capacity. At first, the following were evaluated: centesimal composition, 
mineral profile and protein quality (percentage of collagen, percentage of total amino 
acids and free amino acids, hydrophobicity profile and electrophoretic profile) of the 
comb, the wattle and a mixture of both (1:1 w/w). These by-products displayed a high 
protein concentration (61 to 83% dry base), especially proteins of collagenous origin 
(47 to 51% dry base). The amino acid profile presented a high level of glutamic acid 
(10.01 g/100g) aspartic acid (7,38 g/100g), glycine (9,05 g/100g). The minerals iron (8 
mg/100g), phosphorus (337 mg/100g) and zinc (2,62 mg/100g) were present in high 
amounts, which emphasizes the byproducts as an excellent sources of these nutrients. 
Considering the protein quality of the chicken’s comb and wattle, and the absence of 
studies regarding their use in functional products, a study was then carried out to 
evaluate the obtaining of peptides from these by-products. Firstly, comparative analysis 
of proteolytic activity was carried out in order to select the enzyme (Alcalase, 
Flavourzyme, Protamex, Brauzyn and Colagenase) to be used in the hydrolysis of the 
comb and wattle mixture (1:1 w/w). The enzyme Alcalase displayed the highest degree 
of hydrolysis (DH = 19%) when compared to the other proteases (DH < 3%). After 
selecting the enzyme, the next step was to optimize the Alcalase hydrolysis process. The 
researchers selected the samples with the lowest degree of hydrolysis (< DG: enzyme 
substrate ratio of 1% and 60 min of hydrolysis) and the highest degree of hydrolysis (> 
DG: enzyme substrate ratio of 5% and 240 min of hydrolysis). These experimental 
samples were analyzed for their protein profile, (percentage of total amino acids and 
free amino acids, hydrophobicity profile and electrophoretic profile), mineral profile 
and were characterized according to their iron chelating and antioxidant (ABTS, DPPH 
e FRAP) capacities. The hydrolysate with the higher DH exhibited a higher quantity of 
peptides with low molecular weight and hydrophilic character, as well as a higher 
quantity of free amino acids. The minerals Fe, F and Zn were present in quantities that 
allow the samples to be characterized as sources. As for bioactivity, they showed 
excellent Fe2+ chelation capacity (> 94%) and antioxidant activity through the 
inhibition of ABTS
●
 (> 46%), DPPH
●
 (> 41%) and FRAP through the reduction of 
Fe3+ (> 95 mg/100g trolox equivalent). Comb and wattle have the potential to be used 
in the production of hydrolysates and are also sources of minerals and peptides with 
bioactivities antioxidant capacity and iron chelating. As a result of these studies, the 
process patent BR 10 2016 027430 3 was registered. 
Keywords: Collagen, protein hydrolysate, antioxidant peptides, enzymatic process, 
chicken by-products. 
11 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
 
Figura 1 Delineamento experimental da pesquisa............................................ 29 
 
ARTIGO 
Figure 1 Hydrolysis kinetics of the extract from the chicken comb and 
wattle mixture (1:1 w/w) using different proteases………………… 87 
Figure 2 A - Response surface for the dependent variable “degree of 
hydrolysis”. B - Desirability graph of the degree of hydrolysis…… 88 
Figure 3 Hydrophobicity profile at 218 nm...................................................... 89 
Figure 4 Electrophoretic profile of the comb, wattle, mixture of combs and 
wattles (C + W) and protein hydrolysates of the mixture with the 
highest and lowest degrees of hydrolysis…………………………... 90 
Figure 5 A - Reducing capacity of Fe
3+
 and chelation to the Fe
2+
 metal of 
the chicken comb and wattle mixture (1:1 w/w) and protein 
hydrolysates; B - Ability of the chicken comb and wattle mixture 
(1:1 w/w) and protein hydrolysates to eliminate ABTS
●
 and 
DPPH
●
 radicals……………………………………………………... 91 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
LISTA DE TABELAS 
 
 
Tabela 1 Aplicações para utilização de subprodutos do abate de frango............. 19 
Tabela 2 Descrição de enzimas utilizadas em diferentes fontes proteicas............ 23 
Tabela 3 Enzimas proteolíticas utilizadas na pesquisa......................................... 30 
Tabela 4 Variáveis independentes e níveis do planejamento para obtenção de 
hidrolisados proteicos da mistura de crista e barbela de frango (1:1 
p/p)......................................................................................................... 31 
Tabela 5 Planejamento experimental completo 2
2 
+ 3 repetições do ponto 
central..................................................................................................... 31 
 
ARTIGO 
Table 1 Chemical characterization of the chicken comb, wattle, and comb + 
wattle mixture (1:1 w/w)……………….…………………………… 84 
Table 2 Full experimental plan involving 2
2
+ 3 repetitions of the central 
point…………………………………………………………………. 85 
Table 3 Total and free amino acid profile (g/100 g sample) of the chicken 
comb and wattle mixture and the protein hydrolysates…………… 86 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 15 
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................. 17 
2.1 PRODUÇÃO E CONSUMO DE CARNE DE FRANGO.................... 17 
2.2 SUBPRODUTOS DO ABATE DE FRANGOS................................... 18 
2.3 HIDROLISADOS PROTEICOS........................................................... 21 
2.4 ENZIMAS PROTEOLÍTICAS.............................................................. 22 
2.5 PEPTÍDEOS BIOATIVOS.................................................................... 24 
 2.5.1 Atividade antioxidante.................................................................. 25 
 2.5.2 Capacidade quelante à minerais................................................... 26 
3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................. 28 
3.1 MATERIAL........................................................................................... 28 
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL................................................ 28 
3.3 OBTENÇÃO DO HIDROLISADO PROTEICO DA MISTURA DE 
CRISTAS E BARBELAS DE FRANGO (1:1 p/p)...................................... 29 
3.3.1 Seleção de enzimas para hidrólise proteica da mistura de 
cristas e barbelas de frango (1:1 p/p).................................................... 29 
3.3.2 Otimização do processo de hidrólise, com protease, do 
extrato de misturas de cristas e barbelas de frango (1:1) utilizando-
se protease microbiana (Alcalase)......................................................... 31 
3.4 PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS..................................................... 32 
3.4.1 Caracterização química da crista e barbela de frango e sua 
mistura (1:1 p/p)..................................................................................... 32 
3.4.2 Determinação de hidroxiprolina / Colágeno..............................32 
3.4.3 Medida do grau de hidrólise (GH)............................................... 33 
3.4.4 Perfil de hidrofobicidade da mistura de cristas e barbelas de 
frango (1:1 p/p) e dos hidrolisados proteico......................................... 33 
3.4.5 Eletroforese das cristas e barbelas de frango, de sua mistura 
(1:1 p/p) e dos hidrolisados proteico..................................................... 34 
3.4.6 Perfil de aminoácidos totais e livres da mistura de cristas e 
barbelas de frango (1:1 p/p) e dos hidrolisados proteicos por HPLC 
 
35 
 
 
 
 
14 
 
3.4.7 Perfil de minerais da mistura de cristas e barbelas de frango 
(1:1 p/p) e dos hidrolisados proteicos por ICP OES........................... 
 
35 
3.4.8 Medida da capacidade quelante ao Fe
2+
da mistura de cristas e 
barbelas de frango (1:1 p/p) e dos hidrolisados proteicos................... 
 
36 
3.4.9 Medida da atividade antioxidante da mistura de cristas e 
barbelas de frango (1:1 p/p) e dos hidrolisados proteica.................... 36 
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA..................................................................... 38 
REFERÊNCIAS ………….…………………………………………….... 39 
4 RESULTADOS....................................................................................... 48 
ARTIGO: Chelating and antioxidant capacity of peptides from chicken 
combs and wattles......................................................................................... 49 
PATENTE: Processo de obtenção de peptídeos bioativos de cristas e 
barbelas de frango......................................................................................... 92 
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................. 102 
ANEXOS...................................................................................................... 103 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
O aumento da produção de frangos de corte resulta na elevação da quantidade de 
subprodutos gerados durante o processo de abate e apenas a carcaça é valorizada 
comercialmente. O aproveitamento integral desses subprodutos com uma tecnologia 
inovadora, através do processamento e industrialização, reveste-se de uma grande 
importância econômica, pois agrega valor a toda cadeia produtiva (LAFARGA; 
HAYES, 2014; MARTÍNEZ-ALVAREZ; CHAMORRO; BRENES, 2015). 
No abate de frangos, considera-se apenas a carcaça como objeto de 
comercialização, subutilizando outras partes do corpo do animal, como a cabeça, as 
vísceras, os pés, o sangue e as penas, os quais podem representar cerca de 37% do peso 
vivo total do animal. Estes materiais em geral são destinados para fins pouco nobres 
(farinha para ração animal, sabão, etc), com baixo retorno econômico, ou são 
descartados de forma inadequada, gerando impactos indesejáveis ao meio ambiente 
(UBABEF, 2013; BRASIL, 2014). Dois subprodutos do abate de frango, a crista e a 
barbela, não são aproveitados em sua potencialidade, embora sejam excelente fonte de 
proteína colagenosa, > 60% em base seca (ROSA et al., 2008). Tais características os 
habilitam como excelente matéria-prima para a obtenção de hidrolisados proteicos. 
Na literatura encontram-se descritos o aproveitamento de subprodutos da 
indústria de origem animal para obtenção de peptídeos bioativos com propriedades 
biológicas e tecnológicas, resultantes da hidrolise enzimática de subprodutos de origem 
animal: aves (SURÓWKA; FIK, 1994; LEE et al., 2013), bovino (ZHANG et al., 2013), 
pescado (FERRARO et al., 2013; SILA; BOUGATEF, 2016). No entanto, nenhum 
trabalho enfocou a potencialidade do aproveitamento da crista e barbelas de frango na 
obtenção de ingredientes bioativos. 
Os hidrolisados proteicos resultam da ação de enzimas proteolíticas clivando 
ligações peptídicas em diversas regiões da molécula de proteína, liberando peptídeos de 
diferentes pesos moleculares com sequenciamentos de aminoácidos distintos 
dependentes da origem da proteína e da enzima utilizada (LARIO et al., 2015). 
Os peptídeos obtidos de hidrolisados proteicos têm recebido atenção especial de 
pesquisadores em consequência de exibirem bioatividades, destacando-se os adquiridos 
de hidrolisado do colágeno. Estudos relataram que os peptídeos resultantes da quebra do 
colágeno, oriundo de fontes diversas, podem apresentar propriedades de quelação aos 
16 
 
minerais, melhorando a absorção/biodisponibilidade destes minerais, além de outras 
propriedades como: antioxidante, anti-hipertensiva, antitrombótica, antiulcerativa, 
cicatrizantes, efeitos osteoprotetores, dentre outros (CHOI et al., 2012; GÓMEZ-
GUILLÉN et al., 2011; LEE et al., 2013). 
A capacidade dos peptídeos de quelação a minerais resulta em novas moléculas, 
que apresentam melhor absorção no trato gastrointestinal, em comparação aos minerais 
isolados ou na forma inorgânica, a exemplo dos sulfatados ou cloretos; no entanto, uma 
vez quelatos os minerais perdem a sua atuação pró-oxidante. A obtenção de peptídeos 
através da proteólise enzimática, com posterior síntese de quelatos e adição em matrizes 
alimentares, apresentam-se como uma alternativa promissora para o combate de 
deficiência alimentar de micronutrientes, a exemplo do ferro, melhorando a sua 
biodisponibilidade (DE LA HOZ et al., 2014). 
Atualmente nosso grupo de pesquisa vem realizando estudos com o 
aproveitamento de subprodutos do abate de frango, obtendo ingredientes com 
potencialidades funcionais, sejam bioativos e tecnológicos. Dentre os subprodutos 
pesquisados citam-se a utilização da cartilagem do osso da quilha de frango (ARAÚJO, 
2017a) e dos pés de frango (ARAÚJO, 2017b) para a obtenção de colágeno. 
 Diante dos argumentos citados e da escassez de trabalhos realizados, o objetivo 
desta pesquisa foi desenvolver procedimento tecnológico para o aproveitamento de 
cristas e de barbelas de frango, baseado na hidrólise enzimática, voltado à obtenção de 
peptídeos com bioatividade de quelação ao mineral ferro e com capacidade 
antioxidante. Desta forma será possível agregar valor a esta matéria-prima, colaborando 
com o desenvolvimento da cadeia produtiva de frango, disponibilizando resultados de 
interesse à comunidade científica, indústria de alimentos e população em geral. 
 
17 
 
2 REVISÃO DE LITERATURA 
 
2.1 PRODUÇÃO E CONSUMO DE CARNE DE FRANGO 
 
A produção de frangos de corte mundial ganha destaque em decorrência de seu 
elevado consumo, atingindo valores de produção no ano de 2015 de aproximadamente 
88 mil toneladas (ABPA, 2016). No Brasil a produção de frangos de corte se sobressai 
como uma atividade econômica consolidada, ocupando a segunda posição mundial 
(14,9%) depois dos Estados Unidos da América (20,4%). A cadeia produtiva de frango 
coloca o Brasil como o maior exportador mundial de carne de frango, alcançando 
aproximadamente 40% do volume total exportado (ABPA, 2016). 
Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) 
estima-se que até 2025, o Brasil apresentará um limite de produção de carne de frango 
superior a 17 milhões de toneladas ao ano, atingindo assim um progresso de 3% durante 
cada ano. O crescente aumento na produção de frangos de corte no Brasil irá refletir no 
mercado consumidor deste produto no país. O MAPA registra que 70% da carne de 
frango destinada ao consumo interno é produzida no país (BRASIL, 2014). 
A Associação Brasileira de Proteína Animal (ABPA) relata que no Brasil a carne 
de frango exibe um maior consumo quando comparado com a carne bovina, suína e de 
peixe, em decorrência, principalmente do custo (ABPA, 2015). Estima-se que2016 à 
2026 o consumo de carne de frango no Brasil obtenha um aumento de 21,8% atingindo 
aproximadamente 12.9 mil toneladas (BRASIL, 2016). 
As projeções do MAPA para o período de 2014 a 2024 estima um aumento no 
consumo interno de carne de frango de 2,5% ao ano, totalizando uma elevação de 
aproximadamente 32% nos próximos 10 anos (BRASIL, 2014). Diante destas projeções, 
o consumo de carne de frango de 42,1 kg/habitante/ano, em 2014, atingirá em 2024 
valores de 54,6 kg/habitante/ano. 
Diante deste contexto, observa-se um cenário de crescimento da produção e 
consumo de carne de frango no mundialmente e consequentemente uma elevação na 
quantidade de subprodutos gerados durante o processo de abate das aves. 
 
 
 
18 
 
2.2 SUBPRODUTOS DO ABATE DE FRANGOS 
 
No abate de frangos, apenas a carcaça é objeto de comercialização, desprezando-
se assim outras partes do animal, as quais constituem os subprodutos. Estes podem 
representar 37% do peso vivo total do animal, sendo compostos por cabeça, pele, penas, 
crista, barbela, ossos, aparas de carne, sangue, tecidos adiposos, pé e órgãos internos 
(TOLDRÁ et al., 2012). 
Devido à grande quantidade de subprodutos originados, os mesmos acarretam 
para o abatedouro uma grande quantidade de resíduos (MARTÍNEZ-ALVAREZ; 
CHAMORRO; BRENES, 2015), fazendo-se necessário o aproveitamento integral dos 
subprodutos oriundos do abate. Portanto, o processamento e industrialização destes 
subprodutos se revestem de importância econômica impactante no estabelecimento de 
abate (LAFARGA; HAYES, 2014). 
O valor comercial de uma carcaça, às vezes é insuficiente para cobrir as 
despesas do abate, deixando aos subprodutos a incumbência de equilibrar a balança 
econômica e comercial dos abatedouros. Sua utilização se apresenta como uma 
alternativa de agregação de valor, por apresentar custo praticamente zero (LAFARGA; 
HAYES, 2014). 
 Além do mais, os materiais oriundos do abate de frangos apresentam natureza 
orgânica e são altamente perecíveis, demandando seu aproveitamento correto em 
relação às questões ambientais. Quando descartados de forma inadequada, a 
decomposição dos subprodutos pode gerar danos ao meio ambiente, levando à presença 
de roedores, insetos e odores desagradáveis, por consequência da proliferação 
microbiana (MORA; REIG; TOLDRÁ, 2014). 
Por outro lado, a pesquisa e as indústrias estão cada vez mais exibindo interesse 
pelos subprodutos e estão aplicando diversos métodos de transformação, levando em 
consideração a sua composição química em particular, com elevadas quantidades de 
proteínas e lipídeos de alto valor biológico. A finalidade é extrair e/ou obter um produto 
final com funcionalidades específicas, sejam tecnológicas ou biológicas (MORA; 
TOLDRÁ, 2012). Na Tabela 1 encontram-se descritas pesquisas que utilizaram os 
subprodutos do abate de frango para obtenção de produtos com funcionalidades. 
 
 
 
19 
 
Tabela 1. Aplicações para utilização de subprodutos do abate de frango. 
Subprodutos Aplicação Referência 
Cabeça Hidrolisado proteico SUROWKA; FIK (1994) 
Pescoço Hidrolisado proteico NIKOLAEV et al. (2016) 
Crista Extração de ácido hialurônico ROSA et al. (2008) 
Pés Colágeno hidrolisado WATANABE et al. (2010) 
Pele Colágeno hidrolisado SAIGA et al. (2008) 
Osso Colágeno hidrolisado ZHANG et al. (2010) 
Penas Extração de queratina CHENG et al. (2009) 
Vísceras Hidrolisado proteico JAMDAR E HARIKUMAR (2008) 
Sangue Hidrolisado proteico HUANG E LIU (2010) 
 
 Os subprodutos do abate de frango exibem excelentes potenciais de 
aproveitamento por sua composição química. As penas de frango são consideradas fonte 
de proteína atingindo 85 à 90%, sendo em sua maior quantidade a queratina. Entretanto, 
são amplamente utilizadas para elaboração de farinha para ração animal após passar por 
processamento de hidrólise (LASEKAN; BAKAR; HASHIM, 2013). 
 O sangue de frango também é comumente utilizado por apresentar elevada 
concentração de proteínas de alto valor biológico. É empregado na elaboração de 
farinha para alimentação animal, extração dos constituintes do plasma e obtenção de 
peptídeos bioativos com potencialidades de inibição da enzima conversora da 
Angiotensina I (HUANG; LIU, 2010). Os ossos e a pele do frango são subprodutos que 
também apresentam altas concentrações de proteínas, destacando-se o colágeno. São 
largamente empregados na elaboração de farinha para alimentação animal, fertilizantes 
e extração de peptídeos bioativos, com capacidade antioxidante (LEE et al., 2013; 
MORA; REIG; TOLDRÁ, 2014). 
A cabeça do frango é utilizada para elaboração de farinha e graxarias; em alguns 
casos é descartada de forma inadequada no meio ambiente. Surowka e Fik (1994) 
utilizaram cabeça de frango para obtenção de hidrolisado e avaliaram as atividades 
tecnológicas, obtendo peptídeos com boa capacidade de formação de espuma. 
A crista e as barbelas apresentam em suas composições, elevadas quantidades de 
proteína (61% em base seca), tendo com predominante o colágeno. A crista é formada 
por estruturas anatômicas, constituída por um conjunto de tecido conjuntivo denso, que 
envolve vários tecidos soltos, como a cartilagem mucosa, revestida por um tecido 
epitelial altamente vascularizado e rica em ácido hialurônico (ROSA et al., 2008). O 
ácido hialurônico é um glicosaminoglicano formado por unidades dissacarídicas 
contendo N-acetilglicosamina e ácido D-glicurônico, unidas por ligações β (1, 4) e β 
20 
 
(1,3). É amplamente utilizado na indústria de cosméticos, reduzindo efeitos do 
envelhecimento e na eliminação de radicais livres (KANCHANA et al., 2013). 
Devido a abundante constituição de colágeno na crista e nas barbelas estes 
subprodutos apresentam-se como excelentes fontes de moléculas com propriedades 
tecnológicas e bioativas, voltadas às aplicações em diversos fins da indústria alimentar e 
farmacêutica. O colágeno é a proteína mais abundante nos animais, sendo considerado 
um dos biomateriais de grande aproveitamento e aplicação industrial (CHEN et al., 
2012). 
O colágeno é uma molécula composta por três cadeias entrelaçadas em forma de 
tripla hélice, estabilizada por pontes de hidrogênio, apresentando em suas cadeias 
sequencias repetidas de (Glicina-X-Y)n, onde o X e Y em muitos casos são a prolina e a 
hidroxiprolina, respectivamente. Existem 29 tipos de colágeno, entretanto os tipos I, II e 
III são os encontrados e identificados de forma mais abundante, com destaque para o 
tipo I (MOHAMMADI et al., 2016). 
O colágeno do tipo I, que é denominado de colágeno nativo ou tropocolágeno, é 
encontrado em maior proporção no tecido conectivo como: pele, ossos, tendões, grandes 
vasos, útero, derme, ligamentos, intestino e fibrocartilagem. O tipo II pertence aos 
tecidos cartilaginosos, a cartilagem hialina e elástica, e ao disco invertebral; o tipo III 
localiza-se nos grandes vasos, na parede uterina, na derme (jovem), no intestino, na 
válvula do coração e na gengiva. Os demais tipos de colágenos são específicos e 
reduzidos, encontrados, por exemplo, em lâminas basais, cápsula do cristalino, córnea, 
membranas da placenta, músculo do coração, pulmão, pele fetal, mucosa intestinal, 
dentre outros (KARIM; BHAT, 2009). 
Atualmente a grande utilização da proteína de colágeno é feita por meio da sua 
obtenção em forma de gelatina. No entanto, observa-se uma busca crescente pela 
aquisição de peptídeos com potenciais bioativos, levando em consideração o reduzido 
valor nutricional da molécula de colágeno, devido à composição de seus aminoácidos 
elementares serem não essenciais. Estudos relatam que os produtos resultantes da 
hidrólise do colágeno,oriundo de diversas fontes, podem apresentar propriedades 
bioativas como: capacidade quelante aos minerais (GUO et al., 2015), capacidade 
antioxidante (LEE et al., 2013), capacidade anti-hipertensiva (ALEMÁN; GÓMEZ-
GUILLÉN; MONTERO, 2013) e capacidade anti-ulcerativa (AZUMA et al., 2014). 
 
 
21 
 
2.3 HIDROLISADOS PROTEICOS DE SUBPRODUTOS DO ABATE 
 
 Diversos processos e métodos tecnológicos são aplicados aos subprodutos de 
origem animal para obtenção de produtos com funcionalidades diversas. Devido ao 
elevado teor de proteínas de composição aminoacídica diferentes, os subprodutos são 
amplamente utilizados de forma hidrolisada. O processo de hidrólise consiste na quebra 
da ligação peptídica das proteínas, resultando na liberação de peptídeos de tamanhos 
moleculares diversos, com sequenciamento de aminoácidos distintos e aminoácidos 
livres (MARTÍNEZ-ALVAREZ; CHAMORRO; BRENES, 2015). 
 A hidrólise pode ser realizada por métodos enzimático, químico ou térmico. Os 
métodos químico e térmico são considerados como de difícil controle e resultam em 
produtos de menor qualidade nutricional e bioativa. A hidrólise enzimática é 
comumente a mais empregada devido à especificidade das enzimas e assim, controle da 
obtenção do produto final (SCHMIDT; SALAS-MELLADO, 2009). 
 O processo de obtenção do hidrolisado por via enzimática é realizado 
controlando as condições para atender especificações técnicas de ação da enzima 
utilizada para atingir a sua melhor atividade catalítica. Os principais fatores a serem 
controlados na hidrólise são: temperatura, pH, tempo e relação enzima/substrato, onde 
essas condições devem ser estudadas e otimizadas para os diferentes substratos, a fim de 
que se obtenha as melhores condições de atividades de ação enzimática (MORA; REIG; 
TOLDRÁ, 2014). A seleção da enzima proteolítica deve ser realizada dependendo do 
produto (tipo de substrato) de origem da proteína a ser clivada e da funcionalidade do 
peptídeo a ser obtido. 
Os hidrolisados de proteínas derivados de subprodutos do abate das aves têm 
potenciais aplicações em indústrias de alimentos e farmacêuticas. Na literatura 
encontram-se pesquisas avaliando o potencial tecnológico (capacidade e estabilidade 
emulsificante e de formação de espuma) de peptídeos liberados pela hidrólise de 
proteínas da cabeça de frango (SUROWKA; FIK, 1994). Lee et al. (2013) estudaram o 
potencial antioxidante de peptídeos oriundos da hidrolise proteica de pele de pato. Saiga 
et al. (2008) pesquisaram a atividade anti-hipertensiva de peptídeos obtidos de 
hidrolisados de colágeno extraído da coxa e peito de frango. Sangsawad, Sittiruk e 
Yongsawatdigul (2017) avaliaram o potencial de inibição da enzima conversora da 
Angiotensina I (ACE) de peptídeos derivados da digestão gástrica, simulada, de peito de 
22 
 
frango cozido. Nikolaev et al. (2016) verificaram a atividade antioxidante em 
hidrolisado proteico obtido de pescoço de frango. 
Além destas funcionalidades os hidrolisados proteicos de subprodutos da 
indústria de origem animal vêm se destacando quanto a propriedade de quelação à 
minerais. Pesquisadores encontraram atividade quelante de hidrolisados de pescado, 
como pele, músculo e escama de peixe à minerais como ferro, cálcio e cobre (LEE; 
SONG 2009; GUO et al. 2015; HUANG et al. 2015). Na indústria de laticínios 
encontram-se estudos de quelação à minerais como o ferro e cálcio com hidrolisado 
proteico obtido através do soro de leite (DE LA HOZ et al. 2014; ZHAO et al. 2014; 
SILVA et al. 2015). 
 
2.4 ENZIMAS PROTEOLÍTICAS 
 
As proteases são enzimas capazes de hidrolisar proteínas, clivando ligações 
peptídicas no interior da cadeia proteica ou nas suas extremidades da cadeia lateral, 
dependendo de sua especificidade catalítica . As enzimas proteolíticas podem ser de 
origem microbiana, animal ou de fontes vegetais (BOUACEM et al., 2015). Portanto, as 
enzimas exibem especificidades que possibilitam a ação em regiões diferenciadas da 
cadeia da proteína, permitindo a liberação de peptídeos com sequenciamentos diferentes 
(BAH et al., 2015; LARIO et al., 2015). 
Segundo a Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry and 
Molecular Biology (IUBMB), as enzimas proteolíticas pertencem ao grupo das 
hidrolases e podem ser classificadas de acordo com seu modo de ação, endopeptidases 
ou exopeptidase. Devido a estas especificidades é de extrema importância a escolha da 
protease a ser utilizada, pois deve levar em consideração o material a ser hidrolisado e 
as atividades bioativas ou tecnológicas que almejam aos peptídeos liberados (BAH et 
al., 2015). Na Tabela 2 encontram-se descritas proteases utilizadas na hidrólise de 
subprodutos de origem animal com finalidade de obtenção de hidrolisados e peptídeos. 
23 
 
 Tabela 2. Descrição de enzimas utilizadas em diferentes fontes proteicas. 
Fonte proteica Enzima (Origem) Especificidade Atividade Bioativa Referência 
Cabeça de frango Pepsina - (Animal) Endopeptidase Hidrolisado 
Surowka; Fik (1994) 
 
Carne de frango 
Flavourzyme (Aspergillus oryzae) - (Microbiana) 
Alcalase (Bacillus licheniformis) - (Microbiana) 
Endo e exopeptidase 
Endopeptidase 
Hidrolisado 
Schmidt; Salas-Mellado 
(2009) 
Colágeno bovino 
Alcalase (Bacillus licheniformis) - (Microbiana) 
Colagenase (Clostridium histolyticum) - (Microbiana) 
Thermolysin (Bacillus thermoproteolyticus) - (Microbiana) 
Pepsina - (Animal) 
Tripsina - (Animal) 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Anti-hipertensiva Zhang et al. (2013) 
Cabeça de peixe Alcalase (Bacillus licheniformis) - (Microbiana) Endopeptidase Hidrolisado Sathivel et al. (2003) 
Escama de peixe 
Flavourzyme (Aspergillus oryzae) - (Microbiana) 
Papaína - (Vegetal) 
Endo e exopeptidase 
Endopeptidase 
Quelação Huang et al. (2015) 
Pele de peixe Tripsina - (Animal) Endopeptidase Quelação Guo et al. (2015) 
Pele de peixe 
Flavourzyme (Aspergillus oryzae) - (Microbiana) 
Alcalase (Bacillus licheniformis) - (Microbiana) 
Neutrase (Bacillus amyloliquefaciens) - (Microbiana) 
Tripsina - (Animal) 
Pepsina - (Animal) 
Papaína - (Vegetal) 
Endo e exopeptidase 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Antioxidante Chi et al. (2015) 
Carne de peixe 
Alcalase (Bacillus licheniformis) - (Microbiana) 
Tripsina - (Animal) 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Anti-hipertensiva 
García-Moreno et al. 
(2015) 
Pele de raia Neutrase (Bacillus amyloliquefaciens) - (Microbiana) 
Endopeptidase 
 
Antioxidante 
Anti-hipertensiva 
Lassoued et al. (2015) 
Soro de leite 
Flavourzyme (Aspergillus oryzae) - (Microbiana) 
Alcalase (Bacillus licheniformis) - (Microbiana) 
Pancrearina - (Animal) 
Endo e exopeptidase 
Endopeptidase 
Endopeptidase 
Quelação De La Hoz et al. (2014) 
 
24 
 
Dentre as demais origens, as enzimas microbianas são mais comumente 
utilizadas para obtenção de hidrolisados proteicos, em decorrência a sua fácil aquisição 
e modificação genética. É consolidado na literatura, que essas enzimas são mais 
eficazes, principalmente no que se diz respeito ao aumento do grau de hidrólise, tendo 
como destaque as enzimas Alcalase
®
 (Bacillus licheniformis) e Flavourzyme 
(Aspergillus oryzae) (BOUACEM et al., 2015). 
A Alcalase
®
 é uma enzima produzida pela fermentação submersa do micro-
organismo Bacillus licheniformis, sendo classificada de acordo com o modo de ação, 
como endopeptidase e pela natureza química de seu sítio ativo, como serina-protease. 
Exibe pouca especificidade e também possui ação hidrolítica em moléculascolagenosas, agindo na estrutura da tripla hélice da molécula do colágeno (ZHANG et 
al., 2013). 
 A Flavourzyme é considerada um complexo de enzimas resultantes de ação de 
fúngica de Aspergillus oryzae. De acordo com sua ação catalítica no substrato é 
classificada como, endopeptidase e exoproteinase, sendo denominada pelo seu sítio 
ativo, como proteases aspárticas (TAVANO, 2013; HUANG et al., 2015; PASTORE; 
BICAS; MARÓSTICA, 2013). 
Em geral para o substrato colágeno, utilizam-se enzimas específicas como a 
colagenase (Clostridium histolyticum), cuja protease é capaz de hidrolisar a tripla hélice 
do colágeno nativo ou desnaturado, porém apresenta um valor comercial elevado 
(ZHANG et al., 2013). 
 
2.5 PEPTÍDEOS BIOATIVOS 
 
Como resultado da hidrolise de proteínas são liberados peptídeos das sequencias 
proteicas, que podem apresentar atividades biológicas específicas de acordo com o seu 
sequenciamento de aminoácidos, os quais quando incluídos na cadeia proteica as suas 
características são inativadas (MORA; REIG; TOLDRÁ, 2014). 
É fato que, os peptídeos obtidos de hidrolisados proteicos, têm recebido atenção 
especial de pesquisadores em consequência das suas características inerentes de exibir 
bioatividades, destacando-se os peptídeos adquiridos de hidrolisado do colágeno 
(FERRARO et al., 2013). Quando oriundos do colágeno, esses peptídeos apresentam 
ênfase em atividades que envolvem suas maiores fontes de constituição, como na 
reconstituição da pele, cartilagens e tendões (AZUMA et al., 2014). 
25 
 
Dentre as atividades biológicas mais estudadas encontram-se os efeitos 
osteoprotetores, antiulcerativos, cicratizantes, antitumorais, além de antimicrobianos, 
antioxidantes, anti-hipertensivos, imunomoduladores, hipocolesterêmicos, e ainda 
melhoria da absorção/biodisponibilidade de minerais, quando quelatados (CHOI et al., 
2012). Todas essas propriedades fazem com que os hidrolisados de proteínas de origem 
animal tornem interessantes, com potenciais de aplicação na indústria de alimentos 
(MARTÍNEZ-ALVAREZ; CHAMORRO; BRENES, 2015). 
 Neste sentido, diversos peptídeos gerados a partir de subprodutos do abate de 
animais, como frango, suínos, bovinos e peixes, foram estudados com pesquisas in vitro 
e in vivo e suas bioatividades foram comprovadas (ALEMÁN; GÓMEZ-GUILLÉN; 
MONTERO, 2013; SAIGA et al., 2008). 
 
2.5.1 Atividade antioxidante 
 
A oxidação está cada vez mais sendo objeto de estudo, devido a sua grande 
relevância, por estar relacionada a doenças como estresse oxidativo, câncer, diabetes, 
aterosclerose, doenças neurodegenerativas, inflamatórias e o envelhecimento celular 
(LEE et al., 2013). 
A oxidação ocorre quando alguma molécula perde elétron, como consequência 
da transferência para outra molécula, gerando os radicais livres. Estes radicais livres 
podem ser formados em moléculas importantes para o funcionamento do nosso corpo e 
assim provocar disfunções (estresse oxidativo). Com isto é necessário a utilização de 
moléculas antioxidantes para impedir reações oxidativas no organimo. A utilização de 
peptídeos com ação antioxidantes tem a capacidade de cessar reações de peroxidação 
desencadeadas, através da doação de um par de elétrons para os radicais livres (DUAN 
et al., 2014). 
 A capacidade dos peptídeos atuarem como antioxidantes provem da presença de 
alguns aminoácidos nas cadeias laterais e da sequência destes em sua estrutura. Esses 
peptídeos quando inseridos na cadeia proteica apresentam-se na maioria das vezes 
inativados, quanto a bioatividades; podem ser liberados através do processo hidrolítico 
para desempenhar sua função bioativa (CHI et al., 2015). 
 Evangelho et al. (2017) e Pan et al. (2016) relataram a influência de aminoácidos 
com carater hidrofóbico e/ou ácido no mecanismo da ação antioxidante de peptídeos, 
por apresentarem capacidade quelantes à metais e doadores de elétrons à radicais livres. 
26 
 
Outro fator de grande importância para a capacidade antioxidante está relacionado com 
o peso molecular da cadeia peptídica. Esta bioativade é intensificada com frações de 
menores pesos moleculares e devido a isto, a hidrólise deve ser realizada de forma 
eficaz para a obtenção de peptídeos de fragmentos menores. O peptídeo de menor peso 
molecular terá a capacidade de absorção e assim exercerem a ação antioxidante no 
organismos (LEE et al., 2013; SAIDI et al. 2014). 
Diversos estudos têm sido descritos sobre obtenção e isolamento de peptídeos 
antioxidantes em diferentes matrizes proteicas. Nikolaev et al. (2016) obtiveram 
peptídeos com capacidade antioxidantes, oriundos de hidrolisado proteico de pescoço de 
frango. Lee et al. (2013) encontraram peptídeos, derivados de hidrolisado proteico de 
pele de pato, também com capacidade antioxidante. Pan et al. (2016) e Lassoued et al. 
(2015) estudaram peptídeos com esta mesma bioatividade em hidrolisado proteico de 
pele de arraia. Abdelhedi et al. (2016), Chi et al. (2015) e Saide et al. (2014) avaliaram a 
atividade em peptídeos obtidos de produtos do abate de peixe, como vísceras, pele e 
músculo. 
 
2.5.2 Capacidade quelante à minerais 
 
Os minerais exercem atividades de extrema importância para as funções vitais 
do humano. O ferro é um mineral essencial no transporte de oxigênio, está envolvido na 
divisão celular, na síntese de hemoglobina e na síntese do sistema nervoso central (DE; 
KRISHNA; JETHWA, 2015). 
A Organização Mundial de Saúde (OMS) considera a deficiência alimentar de 
ferro como sendo a mais agravante, pois além da ingestão insuficiente deste mineral na 
alimentação o ferro apresenta baixa biodisponibilidade na dieta de origem vegetal 
(HUANG et al. 2015). O ferro quando suplementado em forma de sais exibe baixa 
biodisponibilidade, devido principalmente à sua interação com outros componentes 
como ácido fítico, polifenóis e fibras. Além disso, ocorre o risco de ser oxidado no 
intestino, gerando radicais livres capazes de ocasionar a peroxidação lipídica de 
proteínas da membrana do enterócito e consequentemente provocar lesões inflamatórias, 
como gastrite e úlcera (CANÇADO; LOBO; FRIEDRICH, 2010; HUANG et al., 2015). 
A carência do ferro provoca diversas alterações na saúde humana, tendo como 
destaque doença ocasionada pela redução da hemoglobina no sangue, conhecida como 
anemia e doenças na capacidade intelectual (GUO et al. 2015). 
27 
 
 Os consumidores, principalmente crianças, mulheres grávidas e idosos, estão 
cada vez mais adquirindo minerais por meio de suplementos alimentares, como 
alternativas para previnir ou suprir a necessidade devido a carência de minerais (ZHU et 
al. 2015). A obtenção de peptídeos provenientes da proteólise enzimática, com posterior 
síntese a minerais (processo de quelação) e adição em matrizes alimentares apresenta-se 
como uma alternativa promissora para o combate da deficiência alimentar de 
micronutrientes como o ferro (GUO et al., 2015). 
Os peptídeos quelatos à minerais apresentaram melhor absorção no trato 
gastrointestinal, do que os minerais isolados ou na forma inorgânica, como os sulfatados 
ou cloretos (DE LA HOZ et al., 2014; HUANG et al., 2015). A ligação dos peptídeos a 
íons metálicos é baseada na interação entre um grupo doador de elétrons presente na 
superfície do peptídeo e um íon metálico que apresente um ou mais sítios de 
coordenação acessíveis, assegurando que o átomo de metal se torne parte de uma 
estrutura biologicamente estável (UEDA; GOUT; MORGANTI, 2003). 
Na literatura encontram-se estudos utilizando peptídeos para quelatar minerais, 
observando-se que a capacidade quelante dos peptídeos à minerais está principalmente 
relacionada a atuaçãode alguns grupos de aminoácidos presentes em sua estrutura e 
resíduos. Estudos citados por Guo et al. (2014) confirmaram a interação dos grupos 
carboxílicos dos aminoácidos ácidos aspártico, ácido glutâmico e histidina, presentes 
em peptídeos liberados de proteínas de produtos de pescado, com minerais, como ferro, 
cálcio, zinco e cobre. Silva et al. (2015) e De La Hoz et al. (2014) avaliaram o quelatos 
de peptídeos, obtidos da hidrólise enzimática de soro de leite, ao mineral ferro. Guo et 
al. (2015) e Huang et al. (2015) relataram em suas pesquisas a eficiência de peptídeos 
oriundos da hidrólise proteica de subprodutos do abate de pescado, fonte de colágeno, 
em quelatar os minerais cálcio, ferro e cobre. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
3 MATERIAL E MÉTODOS 
 
3.1 MATERIAL 
 
Cristas e barbelas de frango foram adquiridas em abatedouro localizado no 
Estado da Paraíba (Brasil) e devidamente fiscalizado pelo Serviço de Inspeção Federal 
(SIF). As enzimas, Alcalase
®
 (Bacillus licheniformis) e Flavourzyme
®
 (Aspergillus 
oryzae) foram fornecidas pela Novozymes Latino Americana Ltda (Paraná, Brasil) e a 
Protamex (Bacillus licheniformes e Bacillus amyloliquefaciens), Brauzyn 
(Caricapapaya) e Colagenase (Clostridium histolyticum) pela Prozyn Biosolutions (São 
Paulo, Brasil). 
 
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 
 
 A pesquisa foi executada em três etapas (Figura 1). Inicialmente, foi realizada a 
composição química parcial dos subprodutos do abate de frangos (crista, barbela e sua 
mistura 1:1 p/p), através da determinação dos macronutrientes (proteína, lipídeos, 
umidade e cinzas), perfil de minerais (Fe, Ca, P, Zn, K, Mg, Mn, Na) e do perfil 
proteico (perfil eletroforético, de hidrofobicidade e de aminoácidos totais e livres). 
Mediante o resultado dos macronutrientes, que indicou um maior teor lipídico na crista, 
optou-se por realizar os estudos de hidrolise enzimática e obtenção de peptídeos com a 
mistura de crista e barbelas na proporção de 1:1 (p/p) reduzindo assim a concentração 
de lipídeos no hidrolisado, e consequentemente a necessidade de eliminação do material 
lipídico. 
 Na segunda etapa foi realizada a seleção da enzima protease a ser utilizada na 
obtenção do hidrolisado proteico da mistura de cristas e barbelas de frango (1:1 p/p). 
Esta etapa consistiu na avaliação da atuação de cinco enzimas proteolíticas 
separadamente, medindo-se o grau de hidrólise de cada enzima, optando-se por aquela 
que apresentou melhor atividade proteolítica. A terceira etapa, envolveu os estudos de 
otimização do processo de hidrólise com a enzima proteolítica previamente selecionada. 
Para tanto utilizou-se um Planejamento Fatorial Completo, no qual os hidrolisados 
proteicos obtidos que apresentaram maior e menor grau de hidrólise foram avaliados 
quanto aos parâmetros de perfil proteico, perfil de minerais, capacidade quelante ao 
29 
 
Fe
2+
, poder de redução do Fe
3+
 e atividades antioxidantes frente a inibição dos radicais 
ABTS
●
 e DPPH
●
. 
 
 Figura 1. Delineamento experimental da pesquisa. 
 
 
 
3.3 OBTENÇÃO DO HIDROLISADO PROTEICO DA MISTURA DE CRISTAS E 
BARBELAS DE FRANGO (1:1 p/p) 
 
3.3.1 Seleção de enzimas para hidrólise proteica da mistura de cristas e barbelas 
de frango (1:1 p/p) 
 
Inicialmente, foram avaliados o desempenho das 5 enzimas [Alcalase (Bacillus 
licheniformis), Flavourzyme (Aspergillus oryzae), Protamex (Bacillus licheniformes e 
Bacillus amyloliquefaciens), Brauzyn (Caricapapaya) e Colagenase (Clostridium 
30 
 
histolyticum)] apresentadas na Tabela 3, onde foi avaliado o desempenho, maior 
atividade hidrolítica, tomando-se como base os parâmetros ótimos de pH e temperatura 
indicados pelas empresas. 
 
Tabela 3. Enzimas proteolíticas utilizadas na pesquisa. 
Enzimas proteolíticas Especificidade Condições ótimas 
Alcalase (Bacillus licheniformis)* Endopeptidase pH 8,0 - 60 °C 
Flavourzyme (Aspergillus oryzae)* Endopeptidase/Exopeptidase pH 7,0 - 50 °C 
Protamex (Bacillus licheniformes e 
Bacillus amyloliquefaciens)* 
Endopeptidase pH 7,0 - 50 °C 
 
Colagenase (Clostridium histolyticum)* Endopeptidase pH 8,0 - 55 °C 
Brauzyn (Caripapaya)** Endopeptidase pH 7,0 - 70 °C 
Fonte: Novozyme Latino Americana Ltda (Paraná, Brasil); Prozyn Biosolutions (São Paulo, Brasil). * fonte 
microbiana; ** fonte vegetal 
 
As cristas e as barbelas de frango foram trituradas e homogeneizadas em 
proporção 1:1 (p/p). A mistura foi transferida para um béquer encamisado com banho 
termostatizado e previamente aquecido. Ao sistema foi adicionado água ultra pura na 
proporção de 1:2 (p/v), com agitação constante. A relação enzima substrato (5%) e o 
tempo total de hidrólise (240 minutos) foram selecionados de acordo com os níveis 
máximos a serem utilizados no Planejamento Experimental Fatorial Completo, 
executado posteriormente à seleção da enzima, tomando-se por base os resultados 
reportados por Zhang et al. (2013), Saide et al. (2014), Alemán et al. (2013), Chi et al. 
(2015) e Pan et al. (2016). 
Durante a hidrólise o pH foi controlado pela adição de solução de NaOH 0,5 
mol / L. Após 240 minutos de hidrólise foi realizada a inativação da enzima, pelo uso 
de temperatura a 90 °C por 15 minutos (ZHANG et al., 2013). O hidrolisado foi 
centrifugado (12.000 x g por 30 minutos) e o sobrenadante foi filtrado, liofilizado, com 
obtenção do pó de hidrolisados proteicos. A enzima de maior atividade hidrolítica foi 
selecionada para uso na obtenção das melhores condições de hidrólise aplicando o 
Planejamento Fatorial Completo 2
2
. 
 
 
 
 
31 
 
3.3.2 Otimização do processo de hidrólise, com protease, do extrato de misturas de 
cristas e barbelas de frango (1:1) utilizando-se protease microbiana (Alcalase) 
 
 As condições do processo de hidrólise das cristas e barbelas de frango, 
utilizando-se protease, foram otimizadas mediante um Planejamento Fatorial Completo 
2
2
, com 4 pontos fatoriais e 3 pontos centrais, totalizando 7 experimentos (Tabela 4 e 5). 
As variáveis independentes investigadas foram: X1 ou E:S (Relação enzima/substrato) e 
X2 ou T (Tempo de hidrólise em minutos) e a função resposta foi medida como % do 
grau de hidrolise (% GH). 
 
Tabela 4. Variáveis independentes e níveis do planejamento para obtenção de 
hidrolisados proteicos da mistura de crista e barbela de frango (1:1 p/p). 
Variáveis 
Níveis 
-1 0 +1 
X1 - Relação enzima / substrato (%) 1 3 5 
X2 - Tempo de hidrólise (minutos) 60 150 240 
Valores codificados e reais do planejamento experimental. 
 
Tabela 5. Planejamento experimental completo 2
2
+ 3 repetição do ponto central. 
Ensaios 
Relação 
enzima/substrato (%) 
Tempo de hidrólise 
(minutos) 
Grau de 
hidrólise 
1 - (1) -(60) - 
2 +(5) -(60) - 
3 - (1) +(240) - 
4 +(5) +(240) - 
5 0(3) 0(150) - 
6 0(3) 0(150) - 
7 0(3) 0(150) - 
Valores codificados e reais do planejamento experimental. 
 
 O modelo utilizado foi o seguinte: β β β β 
 onde Y é a função resposta, predito pelo modelo; β0 é o coeficiente 
médio (ou a constante) β1 e β2 linear e β3 coeficiente de interação. Neste modelo E:S 
(Relação enzima substrato) e T (Tempo de hidrólise) são as variáveis independentes e a 
32 
 
variável dependente neste estudo é o grau de hidrólise. O modelo ajustado aos dados 
experimentais foi verificado pela análise de Variância (ANOVA) e o coeficiente de 
determinação (R
2
). A superfície de resposta e função desejabilidade foram construídas 
utilizando STATISTICA 5.0 (Statsoft Inc. Corporativo Tulsa, OK, EUA)(Statsoft, 
2004). 
Para validação do modelo, um novo ensaio no ponto ótimo foi realizado em 
triplicata e os resultados foram comparados com a função resposta, estimada pelo 
modelo, aplicando o teste t (p ≤ 0,05). 
Os hidrolisados de maior e menor grau de hidrólise (>GH e <GH) foram 
selecionados e analisados quanto ao perfil eletroforético, hidrofobicidade, aminoácidos 
totais e livres e minerais. Também foram avaliadas a capacidade quelante ao mineral 
ferro e antioxidante (redução ao Fe
+3
 e inibição dos radicais (DPPH
●
 e ABTS
●
). 
 
3.4 PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS 
 
3.4.1 Caracterização química da crista e barbela de frango e sua mistura (1:1 p/p) 
 
As cristas e barbelas de frango foram caracterizadas pelas determinações dos 
teores de umidade, cinzas e proteínas conforme a metodologia da AOAC (2010), 
descrita nos procedimentos n° 39.1.03, 39.1.09 e 39.1.15, respectivamente. Os lipídeos 
foram realizados utilizando a metodologia de Folch, Lees e Sloane Stanley (1957). 
 
3.4.2 Determinação de hidroxiprolina / Colágeno 
 
 A quantificação do aminoácido hidroxiprolina foi realizada seguindo a 
metodologia descrita pela AOAC (2010), no procedimento n° 990.26. A amostra passou 
por processo de hidrólise ácida à quente em estufa a 105 °C por 16 horas. Após 
hidrólise foi realizada uma filtração e posterior diluição (10 vezes). Para a realização da 
reação de cor adicionou-se 2 mL do extrato diluido, 1 mL da solução oxidante (1,41 g 
do reagente cloramina T em 100 mL de solução tampão de ácido cítrico em pH 6), 
agitou-se e deixou-se em repouso por 20 minutos. Logo após foi adicionado 1 mL do 
reagente de cor (10 g de 4-dimetilaminobenzaldeído em 35 mL de ácido perclórico a 
60% e 65 mL de 2-propanol); homogeneizado vigorosamente, e acondicionado à 
temperatura de 60 °C em banho maria, por 15 minutos. Em seguida foi realizada a 
33 
 
leitura da absorbância das soluções contra o branco de reagentes a 558 nm em 
espectrofotômetro UV-VIS (Quimis, Q798U, São Paulo, Brasil). A quantificação foi 
realizada utilizando curva padrão preparadas com diferentes concentrações de 
hidroxiprolina (0,6 à 3,6 μg/mL). A conversão da concentração de hidroxiprolina para 
colágeno foi realizada multiplicando-se o valor final por 8. 
 
3.4.3 Medida do grau de hidrólise (GH) 
 
O grau de hidrólise das enzimas proteolíticas no extrato da mistura de cristas e 
barbelas de frango (1:1 p/p) foi determinado através do consumo de base, utilizando a 
equação descrita por Adler-Nissen (1986). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 (Equação 2), onde DH (%) = 
grau de hidrólise; B = consumo de NaOH (0,5moL L
-1
) em mL; Nb = normalidade 
NaOH (0,5moL L
-1); 1/α = média de grau de dissocia o do grupo α-NH2; MP = massa 
da proteína em g; htot = número total de ligações peptídicas no substrato proteico, sendo 
7,6 para carnes. 
 
3.4.4 Perfil de hidrofobicidade da mistura de cristas e barbelas de frango (1:1 p/p) 
e dos hidrolisados proteico 
 
A mistura de cristas e barbelas de frango (1:1 p/p) e os hidrolisados proteicos da 
mistura, de maior e menor grau de hidrólise foram diluídos em água ultra pura e 
homogeneizados em Ultra-Turrax tube disperser (Ika, Staufen, Germany) durante 10 
minutos à 18.000 rpm. Em seguida a solução foi colocada em banho ultrassônico por 10 
minutos (Unique, 1400, São Paulo, Brasil) e centrifugada à 2060 x g por 10 minutos. As 
amostras foram filtradas em papel de filtro e transferidas para seringa contendo filtro 
com poros de diâmetros de 0,45 μm. 
O perfil de hidrofobicidade foi separado utilizando coluna Nova - Pak C18 (4,6 
m x 250 mm, 4 μm de tamanho de partícula, cartridge, Waters, Irlanda), conectada em 
Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (Varian, Waters 2690, Califórnia, EUA). O 
volume de injeção do extrato solúvel (0,2 g/mL) foi 20 µL e a fase móvel foi constituída 
em: Eluente A (Ácido trifluoroacético a 1% em água ultra pura) e Eluente B (Ácido 
trifluoroacético a 1% em acetonitrila). Um gradiente linear do eluente (A) e eluente (B) 
34 
 
foi aplicado durante 60 minutos em fluxo de 1 mL / minuto e a detecção foi realizada a 
218 nm. 
 
3.4.5 Eletroforese das cristas e barbelas de frango, de sua mistura (1:1 p/p) e dos 
hidrolisados proteico 
 
O perfil das frações proteicas e dos peptídeos foi determinado por eletroforese 
em gel de poliacrilamida contendo SDS para separação das bandas de maior peso 
molecular (225 kDa à 38 kDa) (LAEMMLI, 1970) e de menor peso (38 kDa à 3,5 kDa) 
por SDS-PAGE-Tricina (SCHAGGER; JOAGOW, 1987). As amostras foram diluídas 
em tampão redutor (0,5 mol/L Tris-HCl, pH 6,8, 10% SDS, 10% glicerol, 5% β-
mercaptoetanol e 0,1% Comassie Blue G250), homogeneizadas com auxílio de vórtex e 
sonicadas por 10 minutos. Logo após foram aquecidas a 90 °C por 5 minutos em banho 
à seco (Loccus, São Paulo, Brasil). 
Pelo sistema SDS-PAGE o gel de aplicação (stacking gel) foi preparado na 
concentração de 3,5% de poliacrilamida em tampão Tris - HCl 0,5 mol/L, pH 6,8 e SDS 
a 1%, enquanto que o gel de separação foi montado formando um gradiente de 7,5 a 
17,5% de poliacrilamida em tampão Tris - HCl 3 mol/L, pH 8,8 e SDS a 1%. A corrida 
foi realizada sob amperagem constante (25 mA) e ao final da corrida, o gel foi retirado 
da placa e fixado em TCA 12,5% por uma hora, sendo então corado com Coomassie 
brilliant blue R250. A remoção do excesso de corante foi realizada com o auxílio de 
uma solução descorante de metanol, ácido acético e água (1:3,5:8 v/v/v). Os pesos 
moleculares das frações proteicas foram comparados mediante utilização de marcador 
de peso molecular (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). 
No sistema SDS-PAGE-Tricina foram utilizados géis de poliacrilamida de 
diferentes concentrações: gel de separação (16% T e 3% C), gel espaçador (10% T e 3% 
C) e gel de empilhamento (4% T e 3% C). Após as corridas, o gel foi fixado por 1 h em 
solução metanol, ácido acético e água (5:1:4 v/v/v) e corados por Comassie brilliant 
Blue G250 (0,025% de Comassie Blue em 10% ácido acético), durante 48 horas e 
posteriormente descorados em 10% ácido acético. Os pesos moleculares das frações de 
baixo peso foram comparados mediante utilização de marcador de peso molecular (GE 
Healthcare Life Sciences, Nova Jersey, USA). 
 
35 
 
3.4.6 Perfil de aminoácidos totais e livres da mistura de cristas e barbelas de 
frango (1:1 p/p) e dos hidrolisados proteicos por HPLC 
 
 Os aminoácidos totais foram hidrolisados à 105 °C, em seguida derivatizados 
com fenilisotiocianato (PITC) de acordo com as metodologias propostas por White, 
Hart e Fry (1986). Os aminoácidos livres foram extraídos mediante um processo mais 
brando que envolveu a agitação orbital por 60 minutos com ácido clorídrico a 0,1 
mol/L, seguida de derivação com fenilisotiocianato (PITC), seguindo o método descrito 
por Hagen, Frost e Augustin (1989). 
 A separação dos aminoácidos livres e totais derivatizados (feniltiocarbamil-
aminoácidos / PTC-aa) foi realizada em Cromatógrafo Líquido de Alta Resolução 
(Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan) em coluna de fase reversa C18 - Luna - 
Phenomenex (250 mm x 4,6 mm, 5 µm; Phenomenex Inc., Torrence, CA, USA). As 
fases móveis empregadas consistiram de um tampão acetato de pH 6,4 e uma solução de 
acetonitrila a 40%. A injeção da amostra foi efetuada automaticamente (50 µL) e a 
detecção ocorreu a 254 nm. A separação cromatográfica foi realizada a um fluxo 
constante de 1 mL / minuto, à temperatura de 35 ºC. O tempo de corrida cromatográfica 
foi de 45 minutos e os resultados foram expressos em mg de aminoácido por 100 g de 
amostra. A quantificaçãofoi realizada mediante a adição do padr o interno ácido α-
aminobutírico e identificados por comparação a uma mistura de padrões. 
 
3.4.7 Perfil de minerais da mistura de cristas e barbelas de frango (1:1 p/p) e dos 
hidrolisados proteicos por ICP OES 
 
As amostras foram previamente tratadas utilizando o método de digestão por via 
seca (AOAC, 2012) através do método de incineração em forno mufla à 450 °C. As 
cinzas obtidas foram solubilizadas em solução de ácido clorídrico a 5% (v/v) e filtradas 
em papel de filtro quantitativo. A determinação e quantificação do perfil de minerais 
(Fe, Ca, P, Zn, K, Mg, Mn, Na) foi realizada utilizando Espectrômetro de Emissão com 
Fonte de Plasma com Acoplamento Indutivo (ICP OES) (Agilent Technologies, 5100 
VDV, Tóquio, Japão), equipado com uma fonte de Rádio-Frequência (1200 W) de 
estado sólido de 27 MHz, composto por um detector óptico sequencial, bomba 
peristáltica (12 rpm), câmera de nebulização ciclônica de duplo passo e nebulizador 
spray (vazão 0,70 L / min). Para o sistema foi utilizado como gás de plasma o argônio 
36 
 
líquido (12 L / min) com pureza mínima de 99,996% (Air Liquide, Brasil) e a visão 
radial do ICP OES. A quantificação foi obtida através de curva de calibração (colocar o 
nome e marca dos padrões utilizados) para cada mineral detectado, em faixas de 
concentrações que variaram de 0,001 à 61 mg / 100 mL. 
 
3.4.8 Medida da capacidade quelante ao Fe
2+
da mistura de cristas e barbelas de 
frango (1:1 p/p) e dos hidrolisados proteicos 
 
A capacidade quelante ao Fe
2+ 
foi avaliada com base na interrupção da formação 
do complexo F
2+ 
- Ferrozina, verificada a 562 nm em espectrofotômetro UV-VIS 
(Quimis, Q798U, São Paulo, Brasil), seguindo a metodologia descrita por Stookey 
(1970). Foi realizada a homogeneização do extrato solúvel dos hidrolisados com FeCl2 a 
2 mmol / L e posterior leitura no espectrofotômetro. Após primeira leitura de 
absorbância, foi adicionada uma solução de Ferrozina a 5 mmol / L, agitando-se 
vigorosamente por 1 minuto. Para a formação do complexo foi aguardado 10 minutos 
em repouso e em seguida nova leitura de absorbância. 
A porcentagem de inibição de formação do íon complexo (F
2+ 
- Ferrozina) foi 
avaliada pelo decréscimo da intensidade da cor, pois quanto maior for a inibição, maior 
será a competição dos peptídeos em formar complexos estáveis com Fe
2+
, imobilizando-
o. O EDTA foi utilizado como padrão quelante e o resultado foi expresso em 
porcentagem de inibição do íon complexo. 
 
 3.4.9 Medida da atividade antioxidante da mistura de cristas e barbelas de frango 
(1:1 p/p) e dos hidrolisados proteica 
 
 Poder Antioxidante de Redução do Ferro (FRAP) 
 
A capacidade de redução férrica foi avaliada utilizando a metodologia FRAP 
(Ferric Reducing Antioxidant Power), conforme descrita por Benzie e Strain (1999). O 
reagente de FRAP foi preparado por mistura de acetato tampão (300 mmol/L - pH 3,6) a 
 uma solução de 10 mmol / L TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina) em HCl a 40 mmol / L e 
20 mmol / L de FeCl3 a 10:1:1 (v:v:v). Uma alíquota de 100 µL foi adicionada à 
3,4 mL de FRAP. 
37 
 
Após homogeneização os ensaios em triplicata foram mantidos à 37 °C por 30 
minutos. Em seguida, de acordo com o potencial antioxidante, a atividade de redução do 
ferro (Fe
3+
) para a forma ferrosa (Fe
2+
) dos hidrolisados foi verificada a 593 nm em 
espectrofotômetro UV-VIS (Quimis, Q798U, São Paulo, Brasil), zerando-se o 
equipamento com o branco, contendo solvente e reagente FRAP. Com base na curva de 
calibração preparada com diferentes concentrações de Trolox 1000 µmol / L, os 
resultados foram expressos como mg equivalente Trolox / 100 g de amostra, de acordo 
com o potencial antioxidante dos hidrolisados. 
 
 Atividade Sequestradora do Radical 2,2-difenil-1picrilhidrazila (DPPH●) 
 
A capacidade sequestradora do radical DPPH
● 
dos hidrolisados proteicos 
avaliados foi determinada seguindo a metodologia descrita por Brand-Williams, 
Cuvelier e Berset (1995). Uma alíquota de 350 µL foi adicionada à 3,15 mL do radical 
DPPH (%) em metanol. Após homogeneização, foi realizada a leitura no tempo zero 
apenas do ensaio branco, contendo radical livre e solvente e todos os ensaios em 
triplicata foram mantidos a 25 °C por 30 minutos. Em seguida a atividade de eliminação 
do radical de acordo com a capacidade antioxidante dos hidrolisados foi verificada a 
517 nm em espectrofotômetro UV-VIS (Quimis, Q798U, São Paulo, Brasil), em 
triplicata de ensaio, zerando-se o equipamento com metanol. Os resultados foram 
expressos em porcentagem de inibição do radical DPPH
●
 em relação ao potencial 
antioxidante das amostras. 
 
 Atividade Sequestradora do Radical 2,2- azino-bis(3-etilbezotiazolina)-6-ácido 
sulfônico (ABTS
●+
) 
 
A capacidade sequestradora do radical ABTS
●
+ foi determinada seguindo a 
metodologia proposta por Re et al. (1999). Uma alíquota de 50 µL foi adicionada à 950 
µL do radical ABTS
●+
 (%) em metanol. Após homogeneização, foi realizada a leitura 
no tempo zero apenas do ensaio branco, contendo radical livre e solvente, e todos os 
ensaios em triplicata foram mantidos a 25 °C por 6 minutos. Em seguida, a atividade de 
eliminação do radical de acordo com a capacidade antioxidante dos hidrolisados foi 
verificada a 734 nm em espectrofotômetro UV-VIS (Quimis, Q798U, São Paulo, 
38 
 
Brasil), zerando-se o equipamento com etanol. Os resultados foram expressos em 
porcentagem de inibição do radical ABTS
●+
em relação ao potencial antioxidante das 
amostras. 
 
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 
 
Os dados obtidos na otimização do processo de hidrolise da mistura de cristas e 
barbelas de frango (1:1 p/p) foram avaliados por análise de variância (ANOVA) 
utilizando-se o software Statistica versão 5.0 (STATSOFT, 2004), onde, a partir deste, 
foram estimados os efeitos das variáveis estudadas e determinados os coeficientes do 
modelo para a resposta experimental, utilizando um nível de significância de 5% (p ≤ 
0,05). 
Os resultados (perfil de hidrofobicidade, perfil de aminoácidos totais e livres, 
capacidade quelante ao mineral ferro e das atividades antioxidantes) dos hidrolisados 
proteico da mistura de crista e barbela de frango (1:1 p/p), de maior e menor grau de 
hidrólise foram avaliados por análise de variância (ANOVA) utilizando-se o software 
Statistical Analysis System versão 11.0 (SAS, 2014), baseada níveis de significância de 
1% e 5%. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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