Espectrofotometria: Princípios e Aplicações

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espectrofotometria
Bioquímica clínica
Tabela1-Intervalos de comprimento de onda no espectroeletromagnético
Cores
Intervalos de comprimento de onda (nm)
Ultravioleta (não visível)
<380
Violeta Azul
Verde
Amarela
Alaranjada
Vermelha
380 a 450450 a 500
500 a 570
570 a 590
590 a 620
620 a 750
Infravermelha curta
750 a 2000
Segundo a natureza da solução examinada, obtêm-se os espectros de absorção da luz de tal modo que a imagem espectral pode servir para a identificação de uma determinada substância.
A espectrofotometria é um método utilizado para medir o quanto uma substância química absorve a luz, medindo a intensidade quando um feixe de luz passa através da solução da amostra.
O princípio básico é que cada composto absorve ou transmite luz em uma certa amplitude de comprimento de onda. Assim, a medida também pode ser usada para medir a quantidade de uma substância química conhecida.
A espectrofotometria é muito utilizada nas áreas de biologia, físico-química, indústria e em diversos laboratórios, incluindo de análises clínicas.
Conceitos da espectrofotometria
O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração de compostos presentes em solução. Todo composto químico absorve, transmite ou reflete luz (radiação eletromagnética) em uma certa amplitude de comprimento de onda.
Por meio da espectrofotometria é realizada a medição da intensidade da luz em comprimentos de onda, sendo que os componentes de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos ao ultravioleta, visível ou infravermelho.
A técnica utiliza a propriedade das soluções de absorver ou transmitir a luz para quantificar reações.  Na prática, a quantidade de luz absorvida ou transmitida é proporcional à concentração da substância em solução. Como uma impressão digital, saber exatamente a cor absorvida, nos permite identificar e quantificar materiais diferentes.
Quanto mais concentrada for a solução, maior será a absorção de luz. Por outro lado, a cor da solução é determinada pela cor da luz transmitida.
Espectrofotometria – Princípios e aplicações
A espectrofotometria é um método que estuda a interação da luz com a matéria e a partir desse princípio permite a realização diversas análises. Cada composto químico absorve, transmite ou reflete luz ao longo de um determinado intervalo de comprimento de onda. A espectrofotometria pode ser utilizada identificar e quantificar substâncias químicas a partir da medição da absorção e transmissão de luz que passa através da amostra.
Vamos supor que você olhe para duas soluções da mesma substância, uma com maior intensidade de cor que a outra. O senso comum diz que o mais escuro é o mais concentrado. Assim, tal como a cor da solução se intensifica, sua concentração também aumenta. Esta é uma analogia com o princípio da espectrofotometria: a intensidade da cor é a medida da quantidade de um material em solução.
Um segundo princípio é que cada substância absorve ou transmite certos comprimentos de onda, mas não outros. Por exemplo, a cor de uma folha está relacionada com comprimento de onda de luz. Cada cor tem um comprimento de onda diferente, então quando a luz atinge um objeto, alguns comprimentos de onda são absorvidos e outros refletidos de volta. A clorofila absorve luz vermelha e violeta, enquanto que transmite amarela, verde e azul. Os comprimentos de onda transmitidos e refletidos nos fazem perceber a cor verde.
É esse mesmo princípio de cor e comprimento de onda em que um espectrofotômetro se baseia. Esse equipamento mede e compara a quantidade de luz que uma substância absorve. Dessa forma é possível realizar uma análise quantitativa e qualitativa, identificando e determinando a concentração das substâncias conforme a interação com a luz.
Uso e aplicação da espectrofotometria
Espectrofotometria é uma ferramenta importante e versátil amplamente utilizada para a análise em diversas áreas como química, física, biologia, bioquímica, materiais, engenharia química e aplicações clínicas e industriais.
Dentre as diversas aplicações o espectrofotômetro é usado para medir determinados ingredientes em uma droga, medir o crescimento bacteriano, ou diagnosticar um paciente com base na quantidade de ácido úrico presente em sua urina. Sendo que as análises podem ser quantitativas (identificação da concentração da substância) e qualitativas (identificação de uma substância desconhecida), já que cada substância irá refletir e absorver a luz de forma diferente.
Como o espectrofotômetro funciona?
Uma amostra é colocada dentro do espectrofotômetro.
Há uma fonte de luz e um dispositivo chamado monocromador divide a luz em cores, ou melhor, comprimentos de onda individuais.
Uma fenda ajustável permite apenas um comprimento de onda específico através da solução de amostra.
O comprimento de onda da luz atinge a amostra, que está em um pequeno recipiente chamado de cubeta.
A luz passa através da amostra e é lida pelo detector.
O espectrofotômetro é muito sensível e qualquer interferência pode mostrar um resultado errado. As cubetas têm papel fundamental e sua limpeza e correta utilização são essenciais para a obtenção de resultados corretos e confiáveis.
Os principais componentes de um espectrofotômetro
Fonte de Luz: é composta por uma lâmpada de deutério e uma lâmpada de tungstênio. A lâmpada de deutério emite radiação UV e a de tungstênio emite luz visível.
Monocromador: alguns equipamentos ainda possuem um prisma como monocromador, porém, os mais modernos possuem dispositivos eletrônicos que transformam a luz incidida em vários comprimentos de onda em um único comprimento de onda, ou seja, luz monocromática.
Detector: é um dispositivo que detecta a fração de luz que passou pela amostra e transfere para o visor e para o computador acoplado ao aparelho.
Amostras: só podem ser analisados por espectrofotometria de absorção compostos que absorvem luz. Em caso de soluções fortemente coloridas como permanganato, dicromatos, cromatos e outros compostos com cores altamente acentuadas deverão ser feitas, no mínimo, 5 diluições.
Cubeta / Recipiente: é um pequeno recipiente utilizado para conter o material a ser analisado. As cubetas podem ser quadradas, retangulares ou redondas e são constituídas de vidro, sílica (quartzo) ou plásticas.
Cubetas para espectrofotometria
É preciso ter cuidado ao manusear as cubetas, mesmo uma ligeira impressão digital pode interferir nos resultados. É muito importante não tocar na superfície óptica da cubeta, pois óleos de sua pele, partículas de tecidos de limpeza, poeira e outros contaminantes podem afetar as leituras. A utilização e limpeza corretas são a base de qualquer análise espectrofotométrica, ajudando a evitar erros de medição.
As cubetas de vidro são usadas para comprimento de onda de luz visível e o quartzo tende a ser usado na luz UV com comprimento de ondas abaixo de 340nm. Já as cubetas descartáveis de plástico são, muitas vezes, utilizadas em ensaios rápidos onde a velocidade é mais importante do que a exatidão elevada, mas com a praticidade de ser usada apenas uma vez.
 
Cubetas para espectrofotometria
A cubeta, também chamada de célula, é o recipiente que contém a amostra, utilizada para permitir a leitura óptica.
As cubetas de espectrofotômetro são fabricadas em uma variedade de materiais para suportar diferentes padrões de comprimento de onda e requisitos do caminho óptico. As cubetas podem ser de quartzo ou vidro (reutilizáveis) e ainda de acrílico (descartável), sendo empregadas dependendo de qual é a faixa o espectro a ser analisada.
A de quartzo é usada para a região ultravioleta do espectro, já o vidro é usado para a faixa visível e a cubeta de acrílico, para ensaios rápidos e menos exigentes.
É preciso ter cuidado ao manusear as cubetas, mesmo uma ligeira impressão digital pode interferir nos resultados. É muito importante não tocar na superfície óptica da cubeta, pois óleos de sua pele, partículas de tecidos de limpeza,poeira e outros contaminantes podem afetar as leituras. A utilização e limpeza corretas são a base de qualquer análise espectrofotométrica, ajudando a evitar erros de medição.
As cubetas não devem ser secas por aquecimento em uma estufa ou chama porque isso pode provocar danos físicos e/ou mudar o caminho óptico.
Cubeta em vidro óptico
Cubeta em Quartzo 
Cubeta descartável 
Transmitância
Exprime a fração da energia luminosa que consegue atravessar uma determinada espessura de um material, sem ser absorvida. Ou seja, a capacidade de transmitir a luz.
 
Absorbância
Exprime a fração da energia luminosa que é absorvida por uma determinada espessura de um material. Ou seja, a capacidade de absorver a luz.
A absorbância de uma solução está relacionada com a transmitância. Quando a absorbância de uma solução aumenta, a transmitância diminui.
Transmitância e absorbância tendem a ser grandezas complementares. Assim, sua soma (para a mesma energia e comprimento de onda incidente) é aproximadamente igual a 1, ou 100%. Se 90% da luz é absorvida, então 10% é transmitida.
 
Cores em espectrofotometria
A luz é uma forma de radiação eletromagnética que possui características de onda e de partícula (fóton). Os diferentes elementos absorvem energia em comprimentos de onda específicos.
A cor de uma solução está relacionada ao comprimento de onda complementar ao apresentado. Portanto, uma solução aparece como branca porque transmite luzes de todas as cores. Quando absorve luzes de todas as cores, a solução é preta. Finalmente, a solução é verde quando absorve luz vermelha e transmite luz verde (amarelo + azul), denominada de cor complementar.
As radiações eletromagnéticas com comprimento de onda entre 380 e 780 nm são visíveis ao olho humano. Abaixo de 380 nm é denominada ultravioleta (UV) e acima de 780 nm correspondem à zona infravermelha.
Relação entre comprimento de onda e as características de cor:
Princípio do espectrofotômetro
O espectrofotômetro é o equipamento utilizado para determinar os valores de transmitância (luz transmitida) e absorbância (luz absorvida) de uma solução em um ou mais comprimentos de onda.
Ele mede a quantidade de fótons (a intensidade da luz) absorvida depois de passar pela amostra.  A quantidade de uma substância química conhecida (concentração) também pode ser determinada.
Componentes do espectrofotômetro
Alguns componentes são comuns a todos os espectrofotômetros. A luz, fornecida por uma lâmpada, é fracionada pelo prisma (monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes monocromáticas).
O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida em uma cubeta. Parte da luz é absorvida e parte é transmitida. A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector (célula fotelétrica) porque o sinal elétrico de saída do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele.
O sinal elétrico é lido como uma absorbância e é proporcional à concentração da substância absorvente existente na cubeta.
 
(a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora (e) cubeta contendo solução, (f) detector, (g) leitor.
Padrão branco em espectrofotometria
Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma cubeta de espectrofotômetro, parte da luz sofre refração, reflexão, absorção pelos reagentes e outras interações indesejáveis.
Para eliminar tais interferências, deve-se zerar o aparelho com uma solução que é denominada “branco”. O branco deve conter todos os constituintes do sistema, exceto a amostra a ser estudada. A cada conjunto de determinações, bem como após alterar o comprimento de onda, o aparelho deve ser sempre zerado e calibrado com o tubo que contém o branco.
FACULDADE ESTÁCIO FIR
EQUIPE : RAFHAELLA GABRYELLE 
 ERIKA GONÇALVES
 EDECIO PAULO
 DEYVSON RUFINO
 WILLIENE DANTAS
prof° Wanderlan pontes
Referência Bibliográfica
MOTTA, Valter Teixeira. Bioquímica clínica para o laboratório - princípios e interpretações. 5ª edição, p. 15-17. Rio de Janeiro: MedBook, 2009.
COMPRI-NARDY, Mariane B., STELLA, Mércia Breda, OLIVEIRA, Carolina de. Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica. Guanabara Koogan.
ROSA, Gilber, GAUTO, Marcelo, GONÇALVES, Fábio. Química Analítica: Práticas de Laboratório – Série Tekne. Bookman, 2013.
DIAS, Silvio Pereira, VAGHETTI, Júlio Pacheco, LIMA, Éder Cláudio, BRASIL, Jorge Lima. Química Analítica: Teoria e Prática Essenciais. Bookman, 2016.
XAVIER, Ricardo M., DORA, José Miguel, BARROS, Elvino. Laboratório na Prática Clínica, 3ª edição . ArtMed, 2016. 
OBRIGADO